Summary
De novo lipogenese og β-fettsyre oksidasjon utgjør sentrale metabolske veier i hepatocytter, veier som er gjennomtrengt på flere metabolske forstyrrelser, inkludert fatty leversykdom. Her viser vi isolering av mus primære hepatocytter og beskrive kvantifisering av β-fettsyre oksidasjon og lipogenese.
Protocol
Alle dyreforsøk bør utføres i henhold til lokale og føderale forskrifter og med godkjenning av en institusjonell IACUC og strålingssikkerhet administrasjon.
1. Forberedelse
- Flere dager før analysen, tine 500 ml flaske Liver Digest Medium (LDM) og refreeze ~ 35 ml porsjoner i 50 ml koniske rør. Oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig.
- En dag før målingen ble pre-sterilisere rene disseksjon verktøy av autoklaven.
- På dagen for analysen, behandle den nødvendige mengden av 24-brønners kulturplater med kollagen.
- Bland 1 del av 3 mg / ml rottehalecollagen med 50 deler PBS. Tilsett ca 500 ul til hver brønn av en 24-brønns plate og inkuberes i 3-5 minutter ved romtemperatur (RT). Ta av kollagen og la plate lufttørke i hette. Gjenta minst en ytterligere gang.
Merk: Kollagen belegg kan utføres opptil en uke i annonsenVance og plater lagret ved 4 ° C forseglet i plast brytes.
- Bland 1 del av 3 mg / ml rottehalecollagen med 50 deler PBS. Tilsett ca 500 ul til hver brønn av en 24-brønns plate og inkuberes i 3-5 minutter ved romtemperatur (RT). Ta av kollagen og la plate lufttørke i hette. Gjenta minst en ytterligere gang.
- Forbered LDM for analysen: Thaw LDM og varm til 37 ° C og justere pH til 7,4 ved hjelp av en N KOH. Filtrer med 0,2 mikrometer sprøyte filter og plasser i en resirkulerende 42 ° C vannbad.
- Varme 25 ml Liver perfusjonsmediet til 42 ° C i resirkulere vannbad.
- Forbered 90% kolloidalt silisiumdioksyd belagt med polyvinylpyrrolidon-løsning: Tilsett 1 ml av 10x DPBS til 9 ml av kolloidalt silica belagt med polyvinylpyrrolidon. Juster pH til 7,4 med 0,1N HCl. Filter med et sterilt 0,2 um sprøytefilter. Oppbevar ved romtemperatur.
- Varm Plating Middels til 37 ° C.
2. Isolering av Primary Mouse Hepatocytter
- Sett opp peristaltisk pumpe, rør og disseksjon tabell: Steril rør ved spyling med 5 ml 70% etanol i destillert vann, etterfulgt av 10 ml sterilt vann. Plasser slangen i Liver perfusjonsmediet og kjøre pumpe for å fylleHele lengden av slangen.
- Ofre mus ved institusjonelt godkjent metode.
- Dissekere åpne bukhulen: Spray musen magen rikelig med 70% etanol. Ved hjelp av butt-ende saks, gjør et et midtlinjesnitt gjennom dermis lengden av abdomen og reflektere sideveis. Lag en tilsvarende snitt i bukhinnen å avsløre innvollene.
- Ved hjelp av en stump gjenstand, forsiktig fortrenge tarmen for å avsløre mage blodkar Finn mage inferior vena cava (IVC) og plasser en sutur under blodkar, distal til nyrevenen
- Distalt for suturen, plassere en nål og kateter inn i IVC, fremme den utover nivået av suturen. Med nålen fremdeles er på plass, tie sutur rundt kateteret for å holde den på plass. Fjern forsiktig nålen. Hvis det gjøres riktig, blod med flyt gjennom kateteret.
- Ved hjelp av en pipette, fylle den gjenværende område på kateteret med perfusjonsmediet, sikrerat ingen luft er til stede. Med stor omhu, fester slangen til kateteret.
- Dissekere åpne lungene hulrom: forsiktig reflektere den overlegne lever fliker å avsløre mellomgulvet. Punktere nøye membranen med skarp spiss saks, deretter foreta en lateral snitt å avsløre pleuralhulrommet, ta vare å unngå galleblæren og pleural blodkar. Plasser en klamme rundt thorax inferior vena cava like proksimalt for levervenen.
- Skjær portvenen og slå på pumpen på 3 - 4 ml / min. Perfuse leveren med leveren perfusjonsmediet for 5 min bruker ca 20 ml perfusjonsmediet.
Merk: Leveren bør umiddelbart skifte fra rødt til grå / tan. Dersom deler av leveren forblir rødt, sannsynligvis dette indikerer dårlig perfusjon, og sannsynligheten for vellykket isolasjon er sterkt redusert. Under perfusjon, være nøye med å sikre mediet ikke kjører ut og at ingen bobler gå inn i slangen. - Etter 5 minutters inkubasjon, stoppepumpen og overføre røret til leveren Digest Medium. Start pumpen og perfuse leveren for en annen 10 - 15 min (inntil mediet er oppbrukt).
- Ved slutten av perfusjonen, stoppe pumpen. Leveren bør ha en rosa fargetone og virker noe forstørret. Skjære leveren ved forsiktig disseksjon. Fjern galleblæren og overføre leveren til 10 cm vevskulturskål.
- I en biosikkerhet kabinett, tilsett 10 ml plating Medium (Tabell 1) til leveren. Forsiktig skrape leveren ved hjelp av enten tang eller en skalpell for å fjerne hepatocytter. Filtrer suspensjonen ved hjelp av en 100 um celle sil og overfør til et 50 ml konisk rør. Vask platen med ytterligere 10 ml plating Medium og basseng i 50 ml konisk tube.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 5 minutter ved 350 xg, 4 ° C.
- Aspirer medium og resuspender pelleten i 10 ml Plette medium og tilsett 10 ml av 90% kolloidalt silisiumdioksyd belagt med polyvinylpyrrolidone. Bland forsiktig og sentrifuger som i trinn 2,11. Etter sentrifugering blir et lag av døde celler bli flytende på toppen av blandingen, mens levende celler vil klumpe til bunnen.
- Aspirer døde celler og medium. Vask 2 ganger med 20 ml plating Medium, sentrifuger som i 2.11.
- Resuspender cellene i 10 ml av pletteringsmedium. Cellene telles med et hemocytometer og plassere 9 x 10 4 celler / brønn på kollagen-behandlede 24-brønners kulturskåler. Inkuber i en 37 ° C vevskulturinkubator i 2 timer. Hver plate kan brukes for enten fettsyreoksydasjon assay ELLER lipogenese analysen.
- Eventuelt kan endre brønner til opprettholdelsesmedium (Tabell 1) og kultur ved 37 ° C. Cellene kan dyrkes i 2 - 3 dager, uten at det påvirker analyseresultatene.
3. Fatty Acid Oksidasjon analysen
Advarsel: Bruk av radioaktivitet kan være farlig. Alle innkjøp, oppbevaring, håndtering, og disposal av radioaktivt materiale skal utføres i henhold til institusjonelle, statlige og føderale forskrifter og retningslinjer.
- 16-20 timer før analysen, vask cellene 2 ganger med varm PBS. Endre cellene til serumfritt Serum sultemedium (Tabell 1) med 20 nM glukagon og inkuberes over natten ved 37 ° C.
Merk: Siden foster bovinserum inneholder en ukjent konsentrasjon av stoffskiftehormoner (f.eks insulin, glukagon), serum sulte cellene for å fjerne eventuelle konfunderende effekter dette kan ha på analysen. Cellene er levedyktig i Serum Sult Medium for> 24 timer. Glukagon behandlingen brukes til å stimulere fettsyreoksidasjon i hepatocyttene. - Om morgenen av analysen, forberede preinkubering Medium: Suspender en passende mengde av natriumpalmitat i ultrarent vann for å lage en 100 mM løsning og oppvarm til 70 ° C i 10 min. I mellomtiden fremstille den nødvendige mengde (0,5 ml pr brønn i en 24-brønns plate)DMEM med 25 mM HEPES, 1% BSA fraksjon V, og 20 nM glukagon. Varm opp til 37 ° C.
- Når oppløst, tilsett palmitate til en sluttkonsentrasjon på 250 uM til mediet. Endre hepatocytter til Preinkubasjon Medium og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer. Reservere litt Preinkubasjon medium ved 37 ° C for senere bruk.
- I løpet av inkubasjonen, tørk en passende mengde av 14 C-Palmitat (0,5 uCi / brønn) ved fordampning under nitrogengass.
- For eksempel, for å måle 24 prøver i en 24-brønns plate, overfør 120 pl av 0,1 uCi / ml 14 C-palmitate til et 1,5 ml rør. Sakte fordamp etanolløsningsmidlet ved å blåse nitrogengass over oppløsningen fra en avstand på 3-5 cm i en avtrekkshette. Løsningsmidlet skal fordampe i ca. 30 - 40 min, slik at tørr-Palmitat 14 C i bunnen av røret.
- Omtrent 15 min før slutten av inkubasjonen, resuspender 14C-Palmitat i 0,1 N NaOH (12.5 mL / uCi). Inkuber ved 70 ° C i 10 min. Legg tre volumer av varm Pre-inkubasjonsmediet og bland ved å pipettere opp og ned.
- Spike hver brønn med 25 ul av fortynnet 14 C-Palmitate. Bland ved å riste plate og inkuberes ved 37 ° C i 90 min. Dette er Assay Plate.
- Under inkubasjon, forberede filterpapiret Plate (figur 1).
- Fjern lokket fra en steril 24-brønns plate. Plasser en 2 cm x 2 cm stykke av filterpapir i bunnen av hver av brønnene. Overlegg plate med et stykke 4 "x 7" Parafilm.
- Ved hjelp av en stor rektangulær gjenstand, for eksempel en mikropipette spiss boks, gni parafilmen på brønnene for å perforere parafilmen ved brønnåpningene og opprette en tetning over resten av platen. Fjern de perforerte sirkler av Parafilm nå dekker brønnene. Platen skal nå være tett dekket med parafilm i alle områder, bortsett fra brønnen openings.
- 10 minutter før slutten av inkubasjonen, tilsett 200 pl 3 N NaOH til hver brønn på filterpapir Plate, slik at filterpapiret absorberer all væsken.
- Eventuelt før frysing, overføre mediet til en ny 24-brønners plate. Etter vasking en gang med PBS, lysere de gjenværende celler i 0,1 N HCl og beregne proteininnhold ved BCA-analyse.
- Ved slutten av inkuberingen, snap-fryse Assay Plate i flytende nitrogen. Vær nøye med å sikre hver brønn er helt frosset før du fortsetter.
- Tilsett 100 ul av 70% perklorsyre til hver brønn av analyseplaten. Umiddelbart dekke med filterpapiret Plate. Plasserer platene på en orbital-rystemaskin, og stein ved omløpshastighet på 80 opm ved romtemperatur i 2 timer.
- Etter inkubering behandle prøvene:
- For å måle CO2-fraksjonen, overfører filterpapiret rutene til 4 ml flytende scintillasjonsvæske i et scintillasjonshetteglass og måle 14 C signal.
- For å måle syreløselig materiale, overføre 400 ul av medium til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 10 min. Tilsett 100 ul av den resulterende supernatant til 500 ul av 2: 1 kloroform-metanol (v / v), og vortex kort øyeblikk.
- Tilsett 250 ul vann til blandingen, og vortex igjen. Sentrifugere prøven 10 min ved 3000 x g. Overføring 200 ul av den øvre fase til 4 ml flytende scintillasjonsvæske i et scintillasjonsglass og måle 14C-signalet.
4. lipogenesen Analyse
- Kvelden før du begynner med analysen, vaske cellene 2 ganger med varm PBS. Endre hepatocytter til Serum Sult Medium med 100 nM insulin. Inkuber over natten ved 37 ° C.
Merk: Siden føtalt bovint serum inneholder en ukjent konsentrasjon av metabolske hormoner (for eksempel insulin, glukagon), Serum sulte cellene for å fjerne eventuelle konfunderende effekter dette kan ha på analysen. Cellene er levedyktig i Serum Sult Medium for> 24 timer. Insulin er brukt i denne analysen for å stimulere lipogenese. - Gjør lipogenesen Medium: Serum Sult Medium 100 nM insulin, 10 mikrometer kaldt acetat og 0,5 uCi tre H-Acetat per brønn. Endrer celler til lipogenese medium og inkuber ved 37 ° C i 2 timer. Omfatte eventuelle forbindelser av interesse som skal testes.
- Etter inkubasjonsperioden, vask cellene 2 ganger med PBS. Lyse-celler ved skraping i 120 ul 0,1 N HCl. Reserve 10 pl for proteinanalyse (vurdere ved BCA-analyse), og overføre 100 ul til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Pakk lipider ved tilsetning av 500 ul av 2: 1 kloroform: metanol (v / v). Vortex kort og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Tilsett 250 ul vann, vortex og inkuber ved romtemperatur i ytterligere 5 min. Sentrifuger prøvene i 10 minutter ved 3000 xg, RT. Nøyeoverføre nedre fase til 4 ml flytende scintillasjonsvæske i et scintillasjonsglass og måle 3H-aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytter isoleringer typisk resultere i 1 - 3 x 10 7 totalt celler. Etter inkubering over natten blir cellene vist sekskantet, og mange av disse vil bli binucleated (figur 2). Friske celler må være blottet for granuleringer eller blebs, som er indikativ for celledød.
Generelt er fettsyreoksidasjon analysen kjøres i tre til fire replikater per testforbindelse. Teller for CO 2 prøver er omtrent en femtedel av de som er avledet fra syreoppløselige materiale. Vi vanligvis beregne forholdet CO 2 til syreløselig materiale som et mål for fullstendig oksidasjon (dvs. den mengde oksydert via sitronsyresyklusen). Stoffer som fremmer cellulær respirasjon, som Carbonyl cyanid-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) vil skifte dette forholdet mot CO 2, noe som indikerer mer oksidasjon via TCA syklus. Inhibitorer av respirasjonskjeden vil redusere oksydasjon på hele(Figur 3). Når pilote denne analyse, er det best å inkludere et ikke-celle-kontroll for å verifisere prosedyren produserende celle-spesifikk aktivitet.
Den lipogenese-analysen er oftest i forhold til et null-endepunktet kontroll (celler behandlet med substrat umiddelbart før slakting). Analysen bør være lineær i forhold til tid gjennom minst fire timers inkubering. Forbindelser som øker fettsyre oksidasjon, slik som FCCP, eller redusere ATP-syntese, slik som oligomycin, vil redusere lipogenic aktivitet (figur 4).
Figur 1: Fremstilling av filterplaten For å fremstille filterplaten som beskrevet i trinn 3.6, ta av dekselet fra en steril 24-brønns plate. Plasser en 2 cm x 2 cm stykke av filterpapir i bunnen av hver brønn. Overlegg hele platen med en 7 "x 4" stykke parafilm, og gni platen til tett forsegle toppen av brønnene. Dette vil generere perforerte kretser av parafilm over brønnåpningene, som bør fjernes. Etter tilsetning av perklorsyre i trinn 3.9, plasseres filterpapirplaten tett over Assay Plate for å frembringe en tetning.
Figur 2: primære hepatocytter i kultur fase kontrast bilder av sunn og usunn primære muse hepatocytter 16 timer etter plating i kollagen belagt 24-brønners plater. Scale bar, 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fatty Acid Oksidasjon av Primary Mus hepatocytter i kultur 14 C-Palmitat oksydasjon til (A) CO 2, (b) syreløselig materiale, og (C) forholdet mellom CO 2 til syreløselig materiale fra primære hepatocytter inkubert med bærer, FCCP, eller oligomycin. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * p <0,05, ** p <0,01 vs. kjøretøy ved ensidige t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: lipogenese i Cultured muse Hepatocytter (A) lipogenic aktivitet vs. tid i primære hepatocytter ble behandlet med 3 H-acetat og (B) lipogenic aktivitet i nærvær av kjøretøyet, oligomycin, eller FCCP. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. *** p <0,001 vs. kjøretøy ved ensidige t-test.
| Tabell 1 | |||
| Culture Media | |||
| Plating Medium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| FBS | 10% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mm | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Deksametason | 1 mikrometer | ||
| Insulin | 0,1 mikrometer | ||
| Vedlikehold Medium | |||
| DMEM | 500 ml | BSA Fraction V | 0,2% |
| Natriumpyruvat | 2 mm | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Deksametason | 0,1 mikrometer | ||
| Insulin | 1 nM | ||
| Sult Medium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| BSA Fraction V | 0,2% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mm | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiden fra offer perfusjon bør være mindre enn 3 min for ideell perfusjon og kollagenase fordøyelse av leveren. Når perfusjon med perfusjonsmediet igangsettes, bør leveren umiddelbart endre utseendet til fra rød til blek. Etter ca 10 min av inkubasjon med LDM, vil leveren vises hovne og rosa. I det tilfelle at perfusjon er utilstrekkelig, kan det hende at leveren ikke oppviser disse endringene, og dette vil vanligvis resultere i et lavere utbytte hepatocytter.
Etter vasketrinnet, kan isolerte hepatocytter lagres i flere timer i suspensjon på is før plettering. Når belagt, dyrkede hepatocytter kreve flere timer å forholde seg og spre seg. Etter to timers inkubasjon i plating Medium, vil hepatocytter forbli liten og rund. Etter inkubering over natten, vil hepatocytter innta en mer karakteristisk utseende sekskantet, og mange av disse vil bli binucleated. Dersom preparatet er usunn, calen vil stille mange granulations og sporadiske blebbing, indikerer celledød. For å best bevare kultur levedyktighet, bør media byttes hver 24 time og omsorg tatt for å hindre eksponering friluft.
Natriumpalmitat er uoppløselig i vann ved romtemperatur, men etter inkubasjon ved 70 ° C, bør det fullstendig oppløst. Eksponering til RT vil føre til at lipidet for å størkne raskt, slik at det er viktig å arbeide raskt. Når palmitat har vært oppløst i Pre-inkubasjonsmedium, er det avgjørende å holde mediet ved 37 ° C for å opprettholde løseligheten av lipidene.
Som nevnt ovenfor, for å sikre nøyaktige resultater fra fettsyreoksidasjonen analysen, må mediet være helt frosset i flytende nitrogen. Dette hindrer utslipp av CO 2 under tilsetningen av perklorsyre til brønnene. Umiddelbart etter tilsetningen av perklorsyre til de frosne prøvene må analyseplaten være tett covered av filterpapiret Plate, og pass på å justere platene for gassoverføring mellom brønnene. Siden filterpapiret er fuktet med et overskudd av NaOH, er støkiometrien av reaksjonen er i stand til å fange opp de frigjorte CO 2 som NaHCO3. Følgende eksperimenter denne protokollen er generert reproduserbare resultater, med typiske replikater ha% CV ≤ 10. Dersom det er nødvendig, syreløselig materiale fra fettsyreoksydasjon assay eller cellelysatet fra lipogenese-analysen er i stand til å bli lagret ved -80 ° C og behandles senere uten nevneverdig effekt på resultatene. Analysene beskrevet ovenfor, tillater en forholdsvis enkel og tidseffektiv mekanisme for å vurdere lipidmetabolisme i primære hepatocytter isolert fra muselever. Ved bruk av ex vivo kultur, lar disse fremgangsmåter å teste effekten av flere forhold på fettsyreoksidasjon og lipogenese. Denne protokollen kan tilpasses for å vurdere rollen til genetiske endringer på disse processes er imidlertid isolering av hepatocytter tidsbegrensende og således in vivo-analyser kan være mer egnet for å undersøke visse transgene dyremodeller. Ved analyse av flere hepatocytter preparater er nødvendig, kan normalisering av analyseverdiene til proteinnivået bli utført som beskrevet i valgfritt trinn 3.7.1 og anvendt for normalisering. Vi anbefaler analyser utført i flere preparater sammenlignes som relative endringer versus en egnet kontroll.
Endelig har vi ikke utforsket muligheten for lengre dyrkningsperioder, men hepatocytter kan oppvise tilsvarende metabolske egenskaper etter flere dager i kultur. Med små modifikasjoner kan denne protokoll tilpasses for å gi rom for flere dagers behandling forut for å vurdere virkningene av forbindelser på lipidmetabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P.
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
- Day, C. P., James, O. F. Steatohepatitis: a tale of two 'hits'. Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).
- Donnelly, K. L., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).
- Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).
- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
