Summary
De novo lipogenes och β-fettsyraoxidation utgör viktiga metaboliska vägar i hepatocyte, vägar som störs i flera metabola sjukdomar, inklusive fettlever. Här visar vi isolering av mus primära hepatocyter och beskriva kvantifiering av β-fettsyraoxidation och lipogenes.
Protocol
Alla djurförsök bör utföras i enlighet med lokala och federala föreskrifter och med godkännande av en institutionell IACUC och strålsäkerheten administration.
1. Förberedelse
- Flera dagar före analysen, tina 500 ml flaska av lever Digest Medium (LDM) och refreeze ~ 35 ml alikvoter i 50 ml koniska rör. Förvara vid -20 ° C tills det behövs.
- En dag före analysen, för-sterilisera ren dissektion verktyg genom autoklav.
- På dagen för analysen, behandla den nödvändiga mängden av 24-brunnars odlingsplattor med kollagen.
- Blanda en del av 3 mg / ml råttsvanskollagen med 50 delar av PBS. Tillsätt cirka 500 pl till varje brunn i en 24-brunnars platta och inkubera under 3-5 min vid rumstemperatur (RT). Ta kollagen och låt plattan lufttorka i huva. Upprepa åtminstone en ytterligare tid.
Obs: Kollagen beläggning kan utföras upp till en vecka i annonsenvance och tallrikar förvaras vid 4 ° C förseglade i plastfolie.
- Blanda en del av 3 mg / ml råttsvanskollagen med 50 delar av PBS. Tillsätt cirka 500 pl till varje brunn i en 24-brunnars platta och inkubera under 3-5 min vid rumstemperatur (RT). Ta kollagen och låt plattan lufttorka i huva. Upprepa åtminstone en ytterligare tid.
- Förbered LDM för analys: Tina LDM och värm till 37 ° C och justera pH till 7,4 med användning av 1 N KOH. Filtrera med 0,2 fim sprutfilter och lägg i en recirkulerande 42 ° C vattenbad.
- Varma 25 ml leverperfusion Medium till 42 ° C i recirkulerande vattenbad.
- Bered 90% kolloidal kiseldioxid belagd med polyvinylpyrrolidon-lösning: Tillsätt 1 ml 10x DPBS till 9 ml av kolloidal kiseldioxid belagda med polyvinylpyrrolidon. Justera pH till 7,4 med användning av 0,1 N HCl. Filter med en steril 0,2 | j, m sprutfilter. Förvara vid RT.
- Varm Plating Medium till 37 ° C.
2. Isolering av primär Mouse Hepatocyter
- Konfigurera peristaltisk pump, slangar och dissektion tabell: Sterilisera slangen genom spolning med 5 ml 70% etanol i destillerat vatten, följt av 10 ml sterilt vatten. Placera slangen i leverperfusion Medium och kör pumpen för att fyllahela längden av slang.
- Offra musen genom institutionellt godkänd metod.
- Dissekera öppna bukhålan: Spraya musen buken frikostigt med 70% etanol. Använda trubbig-end sax, göra en mittlinjeincision genom dermis längden av buken och reflektera sidled. Gör en liknande snitt i bukhinnan att exponera inälvor.
- Med hjälp av en trubbigt instrument, försiktigt förskjuta tarmarna för att exponera den abdominala vaskulaturen Lokalisera den abdominala vena cava inferior (IVC) och placera en sutur under blodkärlet, distalt till njurvenen
- Distalt om suturen, placera en nål och kateter i IVC, föra det utöver den nivå av suturen. Med nålen fortfarande på plats, knyta sutur runt katetern för att hålla den på plats. Försiktigt bort nålen. Om gjort rätt, blod med flöde genom katetern.
- Med hjälp av en pipett, fylla den återstående ytan i katetern med perfusionsmediet, säkerställaatt ingen luft är närvarande. Med stor omsorg, fäster slangen till katetern.
- Dissekera öppen lunghålan: försiktigt återspegla de överlägsna lever loberna att exponera membranet. Försiktigt punktera membranet med vassa spets sax, sedan göra en lateral snitt för att exponera pleurahålan, var noga med att undvika gallblåsan och lungsäckskärl. Placera en bulldog klämma runt bröst sämre hålvenen bara proximalt lever venen.
- Skär portvenen och slå på pumpen på 3 - 4 ml / min. Perfundera levern med leverperfusion Medium för 5 min med användning av ungefär 20 ml perfusionsmediet.
Obs: Levern bör omedelbart ändras från röd till grå / solbränna. Om delar av levern förblir rött, sannolikt indikerar detta dålig perfusion, och sannolikheten för en framgångsrik isolering kraftigt minskat. Under perfusion, vara noga med att se till att mediet inte springa ut och att inga bubblor in i slangen. - Efter 5 minuters inkubering, stoppapumpen och överföra slangen till Liver Digest Medium. Starta pumpen och BEGJUTA levern för ytterligare 10 - 15 min (tills mediet är slut).
- Vid slutet av perfusionen, stoppa pumpen. Levern ska ha en rosa nyans och visas något förstorad. Excidera levern genom noggrann dissekering. Ta bort gallblåsan och överföra levern till 10 cm vävnadsodlingsskål.
- I en biosäkerhet skåp, tillsätt 10 ml Plätering medium (tabell 1) till levern. Skrapa försiktigt levern med hjälp av antingen pincett eller en skalpell för att avlägsna hepatocyter. Filtrera suspensionen med användning av en 100 | j, m cellfilter och överför till en 50 ml koniskt rör. Tvätta plattan med ytterligare 10 ml plätering medium och pool i 50 ml koniska rör.
- Pellets cellerna genom centrifugering under 5 min vid 350 xg, 4 ° C.
- Aspirera medium och återsuspendera pelleten i 10 ml plätering medium och tillsätt 10 ml av 90% kolloidal kiseldioxid belagd med polyvinylpyrrolidone. Blanda försiktigt och centrifugera som i steg 2.11. Efter centrifugering, kommer ett lager av döda celler vara flytande på toppen av blandningen, medan de levande cellerna kommer pelle till botten.
- Aspirera döda celler och medium. Tvätta 2 gånger med 20 ml Plating Medium, centrifug som i 2.11.
- Resuspendera cellerna i 10 ml Plätering medium. Räkna celler med en hemocytometer och placera 9 x 10 4 celler / brunn i kollagenbehandlade 24-brunnars odlingsplattor. Inkubera i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 2 timmar. Varje platta kan användas för antingen fettsyraoxidationen prov eller lipogenes analysen.
- Eventuellt byta brunnar till underhållsmedium (tabell 1) och kulturen vid 37 ° C. Celler kan odlas i 2 - 3 dagar utan att påverka analysresultat.
3. fettsyraoxidation Assay
Varning: Användning av radioaktivitet kan vara farliga. Alla inköp, lagring, hantering och disposal av radioaktivt material bör ske i enlighet med de institutionella, statliga och federala regler och riktlinjer.
- Sexton - 20 h före analysen, tvätta cellerna 2 gånger med varm PBS. Ändra cellerna till serumfritt serumsvält medium (tabell 1) med 20 nM glukagon och inkubera över natten vid 37 ° C.
Obs! Eftersom fetalbovinserum innehåller en okänd koncentration av metaboliska hormoner (t.ex. insulin, glukagon), serum svälta cellerna för att avlägsna eventuella störande effekter detta kan få på analysen. Cellerna är livskraftiga i serumsvält Medium för> 24 timmar. Glukagon behandling används för att stimulera fettsyraoxidationen inom hepatocyterna. - På morgonen för analysen, förbereda förinkubation Mellan: Resuspendera en lämplig mängd natriumpalmitat i ultrarent vatten till en 100 mM lösning och värm till 70 ° C under 10 minuter. Under tiden, förbereda den erforderliga mängden (0,5 ml per brunn i en 24-brunnars platta)DMEM med 25 mM HEPES, 1% BSA fraktion V, och 20 nM glukagon. Värm till 37 ° C.
- När solubiliserad, lägga palmitat till en slutlig koncentration av 250 | iM till mediet. Ändra hepatocyter att förinkubation Medium och inkubera vid 37 ° C under 2 timmar. Reservera en del förinkubering medium vid 37 ° C för senare användning.
- Under inkubationen, torka en lämplig mängd 14 C-palmitat (0,5 ^ Ci / brunn) genom indunstning under kvävgas.
- Till exempel för att mäta 24 prover i en 24-brunnars platta, överför 120 pl av 0,1 | iCi / ml 14 C-palmitat till en 1,5 ml rör. Långsamt indunsta etanollösningsmedel genom att blåsa kvävgas över lösningen från ett avstånd av 3-5 cm i ett dragskåp. Lösningsmedlet bör avdunsta hos cirka 30 - 40 minuter, vilket lämnar torra 14 C-palmitat i botten av röret.
- Cirka 15 minuter före slutet av inkuberingen, resuspendera 14C-Palmitat i 0,1 N NaOH (12,5 ul / uCi). Inkubera vid 70 ° C under 10 minuter. Tillsätt tre volymer av varm förinkubering Medium och blanda genom att pipettera upp och ned.
- Spike varje brunn med 25 | il utspätt 14 C-palmitat. Blanda genom att skaka plattan och inkubera vid 37 ° C under 90 minuter. Detta är analysplattan.
- Under inkubationen, förbereda filterpappersskivan (figur 1).
- Ta bort locket från en steril 24 brunnar. Placera en 2 cm X 2 cm stycke av filterpapper i botten av var och en av brunnarna. Overlay plattan med en bit 4 "x 7" parafilm.
- Med hjälp av ett stort rektangulärt föremål, till exempel en mikropipettspets rutan gnugga parafilm på brunnarna för att perforera parafilm vid brunnen öppningarna och skapa en tätning över resten av plattan. Ta bort de perforerade cirklar av parafilm nu täcker brunnarna. Plattan bör nu tätt täckt med parafilm på alla områden utom väl openings.
- 10 minuter före slutet av inkubationen, tillsätt 200 | il av 3 N NaOH till varje brunn i filterpappersskivan, och se till att filterpapperet absorberar all vätska.
- Eventuellt före frysning, överföra medium till ett nytt 24-brunnar. Efter tvättning en gång med PBS, lysera de kvarvarande cellerna i 0,1 N HCl och beräkna proteininnehåll genom BCA-analys.
- Vid slutet av inkubationen, snap-frysa analysplattan i flytande kväve. Var noga med att se till att varje brunn är helt frusen innan du fortsätter.
- Tillsätt 100 ni 70% perklorsyra till varje brunn i analysplattan. Täck omedelbart med filterpapper Plate. Placera plattorna på en orbitalskakare och sten vid omloppshastighet på 80 varv per minut vid RT under 2 h.
- Efter inkubationen bearbeta prover:
- För att mäta CO2-fraktionen, överföra filterpappers rutorna till 4 ml flytande scintillationsvätska i en scintillationflaskan och mäta 14 C-signal.
- För att mäta syralösligt material, överföra 400 fil medium till ett 1,5 ml mikrofugrör. Centrifugera vid maximal hastighet under 10 minuter. Tillsätt 100 ni av den resulterande supernatanten till 500 ul av 2: 1 kloroform-metanol (volym / volym) och virvelkortfattat.
- Tillsätt 250 | il vatten till blandningen, och vortexa igen. Centrifugera prover för 10 min vid 3000 x g. Överföring 200 pl av den övre fasen till 4 ml flytande scintillationsvätska i en scintillationsflaska och mäta 14 C-signal.
4. lipogenes Analys
- Kvällen innan analysen påbörjas, tvätta cellerna 2 gånger med varm PBS. Ändra hepatocyterna till serumsvält Medium med 100 nM insulin. Inkubera över natten vid 37 ° C.
Obs! Eftersom fetalbovinserum innehåller en okänd koncentration av metaboliska hormoner (t.ex. insulin, glukagon), Serum svälta cellerna för att avlägsna eventuella störande effekter detta kan få på analysen. Cellerna är livskraftiga i serumsvält Medium för> 24 timmar. Insulin används vid denna analys för att stimulera lipogenes. - Gör lipogenes Medium: serumsvält Medium med 100 nM insulin, 10 iM kall acetat och 0,5 iCi 3H-acetat per brunn. Ändra celler till lipogenes medium och inkubera vid 37 ° C under 2 h. Inkludera alla föreningar av intresse som skall testas.
- Efter inkubationsperioden, tvätta cellerna 2 gånger med PBS. Lyse cellerna genom skrapning i 120 pl 0,1 N HCI. Reserv 10 pl för proteinanalys (bedöma genom BCA-analys) och överföra 100 pl till 1,5 ml mikrofugrör.
- Extrahera lipider efter tillsats av 500 ul av 2: 1 kloroform-metanol (volym / volym). Vortexa en kort stund och inkubera vid RT i 5 min. Tillsätt 250 | il vatten, vortexa och inkubera vid RT under ytterligare 5 minuter. Centrifugera prover 10 min vid 3000 x g, RT. Försiktigtöverföra undre fasen till 4 ml flytande scintillationsvätska i en scintillationsflaska och mäta 3 H-aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyt isoleringar resultera vanligtvis i 1 - 3 x 10 7 totala celler. Efter inkubation över natten, kommer cellerna att visas hexagonala, av vilka många kommer att binucleated (Figur 2). Friska celler bör sakna granuleringar eller blebs, som är indikativ för celldöd.
I allmänhet är fettsyraoxidationen analysen köras i tre till fyra replikat per testförening. Räknar för CO 2 prover är ungefär en femtedel av de som härleds från syran lösligt material. Vi beräknar typiskt förhållandet av CO2 till syralösligt material som ett mått på fullständig oxidation (det vill säga den mängd oxiderat via citronsyracykeln). Ämnen som främjar cellulär andning, såsom Carbonyl cyanid-4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) kommer att förskjuta detta förhållande mot CO2, vilket tyder på mer oxidation via TCA-cykeln. Hämmare av andningskedjan kommer att minska oxidationen på det hela(Figur 3). När lotsa denna analys, är det bäst att inkludera en icke-cellkontroll för att verifiera förfarandet producerar cellspecifik aktivitet.
Den lipogenesis analys är oftast jämfört med en noll tidpunkt kontroll (celler behandlade med substrat omedelbart före skörd). Analysen ska vara linjär funktion av tiden genom åtminstone fyra timmars inkubation. Föreningar som förstärker fettsyraoxidation, såsom FCCP, eller minska ATP-syntesen, såsom oligomycin, minskar lipogen aktivitet (Figur 4).
Figur 1: Beredning av filterplattan att förbereda filterplattan som beskrivs i steg 3,6, ta bort locket från en steril 24 brunnar. Placera en 2 cm X 2 cm stycke av filterpapper vid basen av varje brunn. Overlay hela plattan med en 7 "x 4" bit av parafilm, och gnugga plattan att tätt täta toppen av brunnarna. Detta kommer att generera perforerade kretsar parafilm över brunns öppningar, som ska tas bort. Efter tillsats av perklorsyra i steg 3,9, placera filterpappersskivan tätt över analysplattan för att producera en tätning.
Figur 2: primära hepatocyter i kultur fas kontrast bilder av friska och ohälsosamma primära mus hepatocyter 16 timmar efter plätering i kollagenbelagda 24-brunnsplattor. Skala bar, 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fettsyraoxidationen av primär Mus hepatocyter i 14 Kultur C-palmitat oxidation till (A) CO 2, (B) syralösligt material, och (C) förhållandet av CO2 till syralösligt material från primära hepatocyter inkuberade med vehikel, FCCP, eller oligomycin. Data är medelvärde ± SEM. * p <0,05, ** p <0,01 vs. fordonet genom ensidigt t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: lipogenesen i odlade primära mus Hepatocyter (A) lipogen aktivitet gentemot tid i primära hepatocyter behandlade med 3 H-acetat och (B) lipogen aktivitet i närvaro av vehikel, oligomycin, eller FCCP. Data är medelvärde ± SEM. *** p <0,001 vs. fordonet genom en-tailed t-test.
| Tabell 1 | |||
| Odlingsmedia | |||
| Plätering Medium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| FBS | 10% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexametason | 1 ^ M | ||
| Insulin | 0,1 ^ M | ||
| Underhållsmedium | |||
| DMEM | 500 ml | BSA-fraktion V | 0,2% |
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
| Dexametason | 0,1 ^ M | ||
| Insulin | 1 nM | ||
| Svält Medium | |||
| DMEM | 500 ml | ||
| BSA-fraktion V | 0,2% | ||
| Natriumpyruvat | 2 mM | ||
| Pen / Strep | 2% | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiden från offer till perfusionen bör vara mindre än 3 min för ideala perfusion och kollagenas-digerering av levern. När perfusion med perfusionsmediet inleds, bör levern omedelbart byta utseende från rött till svagt. Efter ca 10 minuter av inkubation med LDM, kommer levern att visas svullna och rosa. I händelse av att perfusion är otillräcklig, kan levern inte uppvisa dessa förändringar, och detta kommer normalt att resultera i en lägre hepatocyte avkastning.
Efter tvättstegen, kan isolerade hepatocyter lagras under flera timmar i suspension på is före plätering. När pläterade, odlade hepatocyter kräva flera timmar för att hålla sig och sprida ut. Efter 2 h inkubation i Plating Medium, kommer hepatocyter förbli små och runda. Efter inkubation över natten, kommer hepatocyter ta på sig en mer karakteristisk hexagonalt utseende, av vilka många kommer att binucleated. Om beredningen är ohälsosamt, calnar kommer att uppvisa ett flertal granuleringar och tillfällig blebbing, tyder på celldöd. För att bäst upprätthålla kultur livskraft, bör media bytas varje 24 timmar och omsorg vidtas för att minimera exponeringen för frisk luft.
Natriumpalmitat är olöslig i vatten vid RT, dock efter inkubation vid 70 ° C skall den fullständigt lösa. Exponering till RT kommer att orsaka lipiden att stelna snabbt, varför det är absolut nödvändigt att arbeta snabbt. När palmitat har upplösts i Pre-inkubationsmediet, är det kritiskt att upprätthålla mediet vid 37 ° C för att bibehålla lösligheten av lipidema.
Såsom nämnts ovan, för att säkerställa exakta resultat från fettsyraoxidation testet måste det mediet vara helt frysta i flytande kväve. Detta förhindrar varje utströmning av CO 2 under tillsatsen av perklorsyra till brunnarna. Omedelbart efter tillsatsen av perklorsyra till de frusna proven, måste analysplattan vara alltför väl covered av filterpapper tallrik, och se till att rikta in plattorna för gasöverföring mellan brunnarna. Eftersom filterpapper blötläggs med ett överskott av NaOH, är stökiometrin av reaktionen kan fånga den frigjorda CO2 såsom NaHCOs 3. Experiment efter detta protokoll har genererat reproducerbara resultat, med typiska replikat med% CV ≤ 10. Om det behövs, syralösligt material från fettsyraoxidationen analys eller cellysatet från lipogenesis analys är kan lagras vid -80 ° C och bearbetas senare utan någon märkbar effekt på resultatet. Analyserna beskrivna ovan möjliggör ett relativt enkelt och tidseffektivt mekanism för att bedöma lipidmetabolismen i primära hepatocyter isolerade från muslever. Genom användning av ex vivo kultur, tillåter dessa metoder att testa effekterna av flera villkor på fettsyraoxidation och lipogenes. Detta protokoll kan anpassas för att bedöma betydelsen av genetiska förändringar på dessa förfaSSES är emellertid isolering av hepatocyter tidsbegränsande och således in vivo-analyser kan vara mer lämpade för att undersöka vissa transgena djurmodeller. Om analys av flera hepatocyt preparat är nödvändigt, kan utföras normalisering av analysvärden till proteinnivåer som beskrivs i det valfria steget 3.7.1 och användes för normalisering. Vi rekommenderar analyser utförda i flera preparat jämföras som relativa förändringar jämfört med en lämplig styrning.
Slutligen har vi inte undersökt möjligheten att längre odlingsperioder kan dock hepatocyter uppvisa motsvarande metabola egenskaper efter flera dagar i odling. Med smärre modifieringar, kan detta protokoll anpassas för att möjliggöra flera dagars behandling innan bedöma effekterna av föreningar på lipidmetabolismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquot and store at -20 °C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Collagen | Life Technologies | A1048301 | |
| Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillin / Streptomycin | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulin | Sigma | I0516-5ML | |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumin (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| Tygon S3 Tubing | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Male Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" Catheter | SurFlo | SROX2419CA | |
| Perma-Hand Silk Suture | Ethicon | 683G | |
| Cell Strainer | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath | Fisher | 13-874-3 | |
| MasterFlex C/L Peristaltic Pump | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilize in autoclave |
| 5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilize in autoclave |
| 24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilize in autoclave |
| 4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilize in autoclave |
| 60 ml Syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50 ml conical tubes | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| Serological pipets | |||
| 1,000, 200, 20 μl pipet and tips |
References
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al. Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).
- Angulo, P.
- Adams, L. A., et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).
- Feldstein, A. E., et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).
- Day, C. P., James, O. F. Steatohepatitis: a tale of two 'hits'. Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).
- Donnelly, K. L., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).
- Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).
- Parks, E. J., Hellerstein, M. K. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).
- Befroy, D. E., et al. Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy. Nature medicine. 20, 98-102 (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malaria journal. 6, 169 (2007).
