Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات واستخدام حيوانات التجارب رعاية الحيوان واستخدام اللجان المؤسسية في جامعة ياماناشي وجامعة واسيدا. وقد أجريت رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
1. إعداد CPEC
- إعداد الأجهزة والمواد التالية: المجهر ستيريو، ويفضل أن يكون قادرا على نقل الإضاءة من الأسفل. زوج من ملقط ساعاتي (دومون # 3 أو رقم 4)، تعقيم اللهب، مقص التشغيل على التوالي، تعقيم اللهب. اثنين العقيمة أطباق 10 سم من البلاستيك تحتوي على 20 مل الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة. أطباق أسفل الزجاج 35 ملم يحتوي على 2 مل RT يبوفيتش L-15 متوسطة. كوب 100 مل تحتوي على 70٪ من الإيثانول. الجراء الماوس حديثي الولادة.
- لفترة وجيزة تزج ماوس الأطفال حديثي الولادة في 70٪ من الإيثانول والموت ببطء بسرعة عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص التشغيل.
- وضع رئيس الفور في الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة في العقيمة 10 سم ديش.
- إزالة الجلد من calvaria باستخدام زوج من ملقط ساعاتي، وقطع فتح الجمجمة لفضح الدماغ، ومن ثم قطع الأعصاب القحفية لعزل الدماغ كله.
- نقل الدماغ على طبق جديد يحتوي على الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة ومراقبة تحت المجهر ستيريو، والتأكد من أن الدماغ هو مغمورة تماما في المتوسط.
- تعيين الجانب الظهري من المخ مواجهة، وتوجيه الدماغ بحيث بصيلات الشم الموجودة في الموضع 03:00 (للأشخاص اليد اليمنى). عقد الدماغ بلطف مع ملقط في اليد اليسرى.
- باستخدام ملقط تشريح غرامة (دومون # 3 أو رقم 4) في اليد اليمنى، وقطع الجسم الثفني وتحت لحمة يربط بين نصفي الكرة المخية، وعلى طول الشق الطولي للمخ.
- دفع بلطف نصفي الكرة المخية بعيدا إلى الجانبين الجانبية وفضح الشق الدماغي عرضية.
- فصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق معسر من عشرالبريد حمة بين نصف الكرة الأرضية والمهاد.
- سحب للخارج برفق الجانبية الضفيرة المشيمية البطين أن تعلق على الجانب الوحشي من الحصين من قبل affixa الصفيحة.
- نقل الضفيرة المشيمية معزولة إلى 35 مم طبق زجاج القاع التي تحتوي جديدة يبوفيتش L-15 متوسطة، وتراكب على وزن (قائمة المواد) بلطف لعقد الأنسجة في المكان.
2. تصوير لايف CPEC سيليا
- تأكيد الأشعة فوق البنفسجية السليم (UV) ومرشح الاستدلال (IR) قطع (ق) لمنع يتم إدراج ضوء أقصر من 400 نانومتر، وأطول من 700 نانومتر، والتي محايدة الكثافة (ND) مرشحات (25٪ و 6٪) في مسار الضوء المجهر المقلوب.
- ضبط بؤرة العدسة الشيئية تقريبا بالعين، ومن ثم ضبط مكثف بحيث الوسط والتركيز لتتماشى مع إضاءة كوهلر. إدراج المقابل تدخل الفرق المناسب (DIC) موشور، وهو عنصر مدينة دبي للإنترنت، وكذلك محلل والمستقطب العناصر في ليمسار GHT لتتوافق مع البصريات DIC.
- ضبط تباين الرأي موقف المنشور DIC ذلك أن هيكل سطح النسيج هو الأكثر تميزا. إذا كان كل أهداب الخلايا المستهدفة هي متحركة، رؤية واضحة للأهداب متحركة لا يمكن الحصول عليها عن طريق العين بسبب حركتهم.
- تغيير مسار الضوء لكاميرا الفيديو، وإزالة مرشحات ND لزيادة قوة الضوء.
- استخدام الكاميرا في وضع التركيز على ضبط مجال الرؤية والتركيز. خلال التركيز، حيث يتم عرض صور الفيديو في الوقت الحقيقي على شاشة العرض، ورؤية واضحة للأهداب متحركة غير متوفر.
- استخدام الكاميرا في 200 هرتز مع ومدة التعرض من 0.1 مللي ثانية للفترة المطلوبة (ثواني إلى دقائق). بعد الحصول على صورة كومة، والأطر واحد عرض هياكل الهدبية واضحة. إذا حواف الهدبية غير واضحة، وزيادة معدل الإطار أو استخدام وقت التعرض أقصر.
- تسجيل حركة CPEC أهداب داخل 25-60 دقيقة بعد القتل الرحيم في يبوفيتشL-15 متوسطة.
3. تحليل الهدبية الحركة
- تتبع يدويا بفوزه على أنماط من كل هدب على شاشة الكمبيوتر. علامة مواقف الهدبية طرف في كل إطار مع مؤشر الماوس، التي يتم تجميعها للحصول على معلومات مسار كل هدب. أما تحليل المعلومات مساره باستخدام نفس البرنامج أو تصديرها إلى تطبيقات أخرى أكثر عمومية لمزيد من التحليل. يوصف كفاءة هذه الخطوة التحليل في مناقشة.
- تصنيف مسارات إلى وضعين للحركة، ذهابا وإيابا أو التناوب، من خلال العين.
- حساب التردد الهدبية الضرب (البرازيلي) باستخدام الصيغة التالية: [الاتحاد البرازيلي = (عدد الإطارات في الثانية) / (متوسط عدد الإطارات للفوز واحد)] 14، والتي يمكن الحصول عليها من رسم تخطيطي الهدبية طرف الحركة (الشكل 3 ). كرر هذه العملية الحسابية لعدة دورات الهدبية الضرب، لأن الأهداب الأخرى على نفس الخلية يمكن أن تتداخل مع حركة كل ciliuم، مما أدى إلى عدم انتظام.
- لتحليل التوحيد الزاوي للالهدبية الضرب محاور داخل خلية واحدة، وتحديد θ زاوية الضرب لكل مسار (الشكل 4). لمسارات ذهابا وإيابا، تناسب المواقف من طرف أهداب إلى خط مستقيم، وتحديد θ كما زاوية خط يجعل مع x -axis. لمسارات التناوب، وتناسب المواقف إلى القطع الناقص، وتحديد θ كما زاوية محور رئيسي من القطع الناقص يجعل مع x -axis. ووصف تفاصيل المناسب في القسم ممثل النتائج.
- لوصف كمي لكل مسار، وحساب المعمم نسبة الارتفاع AR. لفترة وجيزة، وتناوب على مسار من قبل - θ وتحديد AR كما النسبة بين الاعراض من التوزيع على طول س - و-axes ص (الشكل 4B). وترد التفاصيل في القسم ممثل النتائج، وتفسيروأهميتها، وصفت القيود المفروضة على والمعلمة في مناقشة.
4. إعداد نموذج لSEM
ملاحظة: SEM هو طريقة مهمة لتقييم وضع أهداب على CPECs بطريقة شاملة. لإعداد العينات للSEM، أفاد الإجراء القياسي السابق 15 يعمل مع تعديلات طفيفة.
- قبل تشريح الأنسجة من الدماغ، وإعداد تثبيتي في قنينة زجاجية 5 مل مع غطاء البولي ايثيلين. يتكون تثبيتي من 2٪ امتصاص العرق، 2.5٪ غلوتارالدهيد (نصف حل Karnovsky ل16) في 0.1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4.
- تشريح خارج أنسجة من المخ كما هو موضح في الخطوة 1.
- شطف لفترة وجيزة الأنسجة المعزولة مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) في طبق جديد ثم إصلاح الأنسجة في تثبيتي في قارورة زجاجية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصات نقل المتاح والتعامل مع العينات جنرال الكتريكntly. بعد الشطف في HBSS، وتصبح الأنسجة لزجة.
- لنقل العينات إلى حل تثبيتي، وطرد ببطء على كمية صغيرة من محلول يحتوي على الأنسجة من ماصة نقل بمثابة قطرة وإضافة إلى تثبيتي.
- بعد التثبيت، تجاهل تثبيتي، وشطف الأنسجة مع العازلة الفوسفات ثلاث مرات.
- تزج النسيج في محلول السكروز 10٪ لتغسل الألدهيدات المتبقية. لضمان القضاء الكامل على الألدهيدات، تزج العينات في حل لمدة 10 دقيقة ثم كرر مرتين مع السكروز النقي 10٪. هذه الخطوة مهمة لتحقيق الصحيح بعد التثبيت في الخطوات اللاحقة.
- تزج النسيج في محلول 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن الفوسفات لمدة 30 دقيقة ثم ضع على الجليد لمرحلة ما بعد التثبيت. الحكم على درجة من المعاملة بالأوزميك من لون عينة: عندما تتم إزالة الألدهيدات تماما، وعينة سوداء.
- غسل الأنسجة عينات ثابتة آخر على نطاق واسع مع مقطر مزدوجد الماء عدة مرات.
- يذوى العينات عن طريق الغمر في تركيزات متدرجة من الإيثانول، عادة 65٪، 75٪، 85٪، 95٪، 99٪، و 100٪، لمدة 10 دقيقة لكل منهما. الحصول على الايثانول اللامائي من خلال وضع المناخل الجزيئية إلى 99.5٪ من الإيثانول من زجاجة شراؤها حديثا. تكرار الجفاف مع اللامائية الإيثانول ثلاث مرات.
- وضع العينات المجففة في خلات الأميل، كاشف استبدال لتجفيف نقطة حرجة، لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين. هذا كاشف يتبخر بسرعة ويمكن أن تصبح العينة الجافة، مما أدى إلى تدمير التوتر السطحي. ولذلك، لا تجف العينة تماما.
- بعد تبادل النهائي من خلات الأميل، وإزالة معظم المذيبات، وعلى الفور التفاف قارورة زجاجية مفتوحة مع رقائق الألومنيوم، ووضع قنينة على الثلج الجاف. باستخدام إبرة أو ملقط غرامة، وجعل عدة ثقوب في احباط تغطية الفم من القارورة، بحيث يتدفق ثاني أكسيد الكربون السائل بسهولة إلى القارورة في مجفف نقطة حرجة. انتقل إلى الخطوة التاليةباسرع ما يمكن.
- في هذه الخطوة، والتقليل من المرحل من خلات الأميل في الغرفة مجفف، ولكن لا تدع العينة تجف تماما قبل التجفيف نقطة حرجة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تترك العينة على الثلج الجاف لفترة طويلة دون داع لتجنب تشكيل الصقيع على القارورة.
- نقل قوارير زجاجية ملفوفة احباط تحتوي على عينات الأنسجة إلى مجفف نقطة الأهمية بمكان أن يضمن بنية سطح الأنسجة لا تزال سليمة في حين إزالة المياه الوارد في الأنسجة. يمكن الحصول على معلومات مفصلة عن تشغيل مجفف نقطة حرجة من تعليمات الشركة الصانعة.
- التعامل مع العينات بعناية باستخدام المسواك لتقليل الأضرار الميكانيكية. ينتج عن ذلك من عينات الأنسجة المجففة هشة. جبل العينات على بذرة المعادن ومعطف مع الذهب والبلاديوم استخدام تفل أيون.
5. مراقبة من قبل SEM
- مراقبة من قبل SEM وتسجيل الصور مع كاميرا رقميةمجهزة لالمجهر الإلكتروني الماسح.
- نقل بيانات الصور الرقمية إلى جهاز كمبيوتر لتحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر لمحة عامة عن سير العمل في الشكل 1، بما في ذلك الصور من الأجهزة.
ملاحظات الحركة الحية من CPECs
فيلم 1 يظهر الفيلم من CPECs معزولة عن ماوس فترة ما حول الولادة، وفيلم 2 يبين وجهة نظر موسعة من الصور في الفيلم 1. وتجدر الإشارة إلى أن نصائح الهدبية الفردية هي أقل وضوحا في الصور الثابتة مقارنة مع تلك الموجودة في الأفلام. ويبين الشكل 2 تتبع حركة أهداب مع اثنين من وسائط مختلفة من الحركة، ذهابا وإيابا، والحركات الدورانية، من البيانات الواردة في أفلام 1 و 2. ويبين الشكل 3 تحليل بسيط من مسارات أهداب، الذي فرق الطور في الإحداثيات اثنين هو واضح في حركة دورانية.
تحليل CPEC مسارات الهدبية طرف
دي ويبين طرق الذيل لتحليل كمي كل مسار في الشكل (4) مع الرسوم التوضيحية التخطيطي التعاريف زاوية الضرب θ (A) والرسم البياني التحليل مع نتائج ممثلة (B).
لتحديد زاوية θ الضرب لمسارات ذهابا وإيابا، تناسب المواقف من طرف الهدبية خلال دورات متعددة إلى خط مستقيم ص = الفأس + ب، وتحديد الاتجاه الضرب على الوجه الذي على طول الخط المجهزة. تحديد زاوية الضرب هنا كما θ = قوس تان. لأن الخط المناسب غالبا ما يفشل في انتزاع الاتجاه في حالات الحركة الدورانية، تناسب مسارات دوران لقطع ناقص، وتحديد الاتجاه كما أن طول محور طويل من القطع الناقص المجهزة. بتعبير أدق، يتم تركيبها في مواقع طرف (س، ص) خلال دورات الضرب متعددة إلى وظيفة أدناه.
1.JPG "العرض =" 310 "/>
أين 
ويشمل تركيب القطع الناقص خمس معلمات المناسب: س 0، ص 0، أ، ب، وθ. س - والإحداثيات -spatial ص من مركز القطع الناقص هي س 0 و y 0، على التوالي. كعبرة الأكبر والأصغر من القطع الناقص هي أ و ب، على التوالي. زاوية θ هي الزاوية أن محور رئيسي يجعل مع س -axis، أو زاوية الضرب. ويرد التمثيل التخطيطي من هذه المعلمات في اللوحة اليمنى من الشكل 4A. ويتم تركيب خارج باستخدام ايغور برو البرمجيات من خلال تحديد وظيفة واضحة هو موضح أعلاه. ثم، رسم بياني لضرب زاوية θ لجميع أهداب مراقبةيتم رسم د في نفس الخلية كما رسم بياني دائري (الشكل 2 في مطار ناريتا وآخرون. 8). وتيرة تطبيع لعدد من النصائح الهدبية تحليلها. تجدر الإشارة إلى أن يتم تفسير كل هدب أن يكون اثنين من θ القيم في الرسم البياني دائري، مثل π / 4 و 3π / 4، مما يؤدي إلى توزيع متماثل من الاتجاه.
لتحديد المعمم نسبة الارتفاع AR، يتم تدوير المناصب من طرف الهدبية خلال دورات متعددة - θ (الشكل 4B). وفقا لمبدأ التناوب، سواء ذهابا وإيابا، ومسارات دوران تصبح توزيع حوالي موازية لس -axis، التي الاعراض من توزيع ألف وباء، وعلى طول X- و y محاور، على التوالي، وتعرف بأنها نصف الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى. لذلك، هذه المعايير هي أكثر ملاءمة للكعبرة الأكبر والأصغر من القطع الناقص، أ و ب. AR ثم يتم تعريفها على أنها النسبة بين A و B التي كتبها AR = B / A.
ملاحظات المشيمية الضفيرة ظهارة بواسطة SEM
SEM يسمح بملاحظة بنية سطح ناعم من العينات. وأكدت وجود أهداب على CPECs طوال الوقت التنموي. لوحظ ظهور أهداب متعددة على CPECs بعد يوم الجنينية (E) 13، بعد وقت قصير من بدء تطوير المشيمية الضفيرة في البطينات الجانبية حول E11. في هذه المرحلة، وخلايا صغيرة مع مظهر غير ناضجة متغير، ونصائح الهدبية تشير نحو مختلف الاتجاهات. في E15، يتم تأسيس خصلة من أهداب متعددة على رأس السطح القمي، والتي يقف خارجا من زغيبات المحيطة بها. في يوم ما بعد الولادة (P) 2، يتم إصلاح العديد من أهداب في موقف عازمة، مما يعكس الحركة الهدبية التي لاحظها التصوير الحي. في P14، معظم الخلايا تمتلك أهداب المتعددة التي هي غير متحركة وكذلك زغيبات ث إيث نسيج دقيقة مقارنة مع المراحل السابقة. الشكل 5 معارض الصور SEM من CPECs مع أهداب في هذه المراحل. بناء على الأفلام هو مبين في الشكل (1) والفيلم 1، فمن الواضح أن أهداب متحركة يتم التعرف بسهولة عن طريق التصوير الحي. ومع ذلك، فإنه من الصعب التمييز بين أهداب غير متحركة بواسطة DIC المجهري. ونتيجة لذلك، SEM أمر لا غنى عنه لفهم الدول الهدبية الشاملة.
الشكل 1: لمحة عامة عن سير العمل (أ) مجهر ستيريو. (ب) مجهر مقلوب مجهزة بجهاز اتهم الديناميكي (CCD) الكاميرا. (ج) شاشة الكمبيوتر أثناء التحليل. (د) ايون تفل. (ه) عينة لSEM. (و) الضوئي المجهر الالكتروني.
فيلم 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "الهدف =" _ فارغة "> الفيلم من وجهة نظر العلوي من CPECs وأهداب من الجرو P2 الماوس في فيديو عالي السرعة المجهري. ونظرا لعدم انتظام سطح الأنسجة المشيمية الضفيرة، تحتوي هذه اللقطة . على حد سواء في التركيز والطائرات خارج نطاق التركيز يتم توسيع منطقة في منطقة الجزاء، ويظهر في الفيلم 2 شريط مقياس: 2 ميكرون.
فيلم 2. الفيلم من وجهة نظر الموسع لعينة الأنسجة في الفيلم 1. أظهر الضرب أهداب الحركات إما التناوب أو ذهابا وإيابا. شريط النطاق: 1 ميكرون.
الشكل 2: إعادة تشكيل مسار CPEC أهداب من الوقت الفاصل بين الصور في الفيلم 2 (A) سيليا مع حركة ذهابا وإيابا (أعلى) وحركة دورانية (القاع). مدينة دبي للإنترنت وتعرض صور من بيانات الفيلم في 50 ميللي ثانية فترات (1-8، شريط النطاق: 1 ميكرون). يشار إلى موقف من طرف الهدبية الهدف عن طريق رأس السهم. ومضافين (B) ومسارات (كسر خط) ومواقف نصائح الهدبية (دوائر ملونة) هو مبين في الصور.
يتم عرض وضعين من حركة CPEC الهدبية طرف تشكيلها من بيانات الفيلم الممثل حركات الهدبية طرف، وحركة ذهابا وإيابا (A) وحركة دورانية (B)، عبر دورات متعددة كما مسارات (أعلى والحانات على نطاق و: الرقم 3. 0.5 ميكرون). يتم رسم الدورات وقت X- و y الإحداثيات للموقف طرف، على التوالي (وسط). للتدليل على بعد مرحلة التحول بين الإحداثيات اثنين، كانت X- و y الإحداثيات تطبيع [-1،1] ومضافين (أسفل، وخطوط حمراء وزرقاء، على التوالي).
igure 6 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
الرقم 4: الرسوم التوضيحية تخطيطي واصفا تحليل الهدبية مسارات طرف (A) تعاريف زاوية θ الضرب لذهابا وإيابا (اللوحة اليسرى) والتناوب (اللوحة اليمنى) مسارات. ، يتم عرض المعلمات في صيغة تصف القطع الناقص المجهزة، أ، ب، س 0، و y 0 في اللوحة اليمنى. (B) تدفق الرسم البياني التحليل المناسب من مسارات لتحديد θ زاوية الضرب وAR. يتم عرض النتائج الفعلية لتركيب مسارات التمثيلية في لوحات اليمين.
الشكل 5: SEM صورة أهداب. الميكروسكوب SEM تمثيلية من CPECs في E13، E15، P2، وP14. وخلال الوقت، ازداد CPECs في الحجم، وضعت microviLLI وأهداب على سطح القمي. خصلة من أهداب في E13 هي حتى الآن للحصول على الحركة. في P2، عندما بلغت نسبة أهداب مع حركية أعلى نقطة، لوحظ العديد من أهداب منحنية. في P14، أهداب تفقد القدرة على الحركة. شريط النطاق: 5 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وجهات النظر هذه الطريقة
على الرغم من أن تقنية الموضحة هنا لا تقدم تحليلا أكثر تفصيلا للأهداب من الطرق التي تم نشرها مسبقا، وأهمية هذه التقنية تكمن في بساطة النظام والفعالية من حيث التكلفة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة على فحص أي نوع من الحركة الهدبية خارج الحي. على وجه الخصوص، TI طاولة العمل يوفر واجهة بسيطة وسهلة الاستعمال تمكن الباحثون إلى رصد وتحليل الهدبية الحركة أكثر سهولة. لم يتم وضعها فعالة طرق تتبع الآلي للكائنات التباين المنخفض مثل أهداب غير ملوثين في محسنة الفيديو على النقيض من مدينة دبي للإنترنت. على الرغم من أن طريقة لتتبع الحركة الهدبية هو دليل في هذه التقنية، وعلى النحو الأمثل خفضت مقارنة مقدار الجهد في الهدبية تحليل تتبع الحركة باستخدام حزم البرامج للأغراض العامة لتحليل الصور.
عينة تشريح
لإعداد البريدس الجسم الحي CPEC العينات، التلاعب السريعة ورقيقة ضرورية للحفاظ على حيوية الأنسجة، والتي تضمن الحركة من أهداب خارج الحي. بسبب التلوث الكريات الحمراء يطمس مجال المراقبة، ويوصى بشدة الشطف لطيف ولكن معقدة من أنسجة تشريح مع الفوسفات مخزنة المالحة. لتجنب النزيف، يجب الحرص على تجنب تمزق الشريان الخلفي المشيمية التي يمكن تحديدها على أنها تشبه موضوع المحمر هيكل بارزة انضمت إلى الصفيحة المثبتة من الضفيرة الغروانية.
مجهر
مجهر مقلوب مجهزة البصريات DIC ونقل مصدر الضوء عالية الطاقة أمر ضروري لهذا الأسلوب. لأن مصابيح الزئبق وعادة ما تكون في كثير من الأحيان غير قادرة على تبديل وخارجها، ومصراع أمام السكن مصباح ضروري. إما مصراع اليدوي أو الكهربائي يمكن أن تستخدم لهذا الغرض. لحماية العينات وعيون الاب المراقبالأشعة فوق البنفسجية أوم وضوء الأشعة تحت الحمراء، يطلب من المرشحات الضوئية للسماح للضوء المرئي فقط (400-700 تمرير الفرقة أو مزيج من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء قطع مرشحات). فلاتر ND ضرورية لتغيير السلطة الخفيفة التي تختلف وفقا للحالة أيضا: رصد من العين، مع التركيز مع كاميرا الفيديو، وعالية السرعة لتسجيل مرور الزمن. عدسة موضوعية مع فتحة عددية عالية ضرورية لدقة عالية. هناك بعض المسافة بين الجزء العلوي من ساترة والنقطة المحورية بسبب التشكل وسمك الأنسجة. لذلك، يفضل عدسة الغمر بالماء بدلا من عدسة غمر النفط لتحسين جودة الصورة. الاهتزاز العزلة ضرورية أيضا لانتاج مستقرة مداخن صورة. الهواء شاحنة من نوع الجداول مفيدة لهذا الغرض، ولكن توسيد أبسط المجهر عن طريق إدخال كرات التنس تحت قاعدة المجهر مع جدول ثابت قد تعمل أيضا.
كاميرا فيديو
كاميرا CCD قادرة على في مرجةشارع 200 لقطة / ثانية ضروري لتتبع حركة الأهداب. خلال العقد الماضي، أصبحت كاميرات CCD مع أسرع معدلات الإطار من (25-30 هرتز) معدل الفيديو القياسية المتوفرة تكاليف أقل بكثير. نماذج الكاميرا قادرة على أقصر الأوقات فضح من الإطار الزمني مفيدة للحد من عدم وضوح بسبب حركة أهداب دون زيادة كمية البيانات. ومدة التعرض من 0.1 ميللي ثانية، والإطار الزمني 5 مللي ثانية (200 هرتز) الحد الأدنى من الشروط للحصول على صور الهدبية من CPECs ذات جودة كافية.
البرمجيات
تحليل لتتبع حركة كل هدب هو مضيعة للوقت، وخصوصا عندما تستخدم العامة حزم البرامج غرض تحليل الصور لتتبع كل طرف الهدبي. الحد من الخطوات من المهام المتكررة، مثل النقر بالماوس على موقف الهدبية طرف على الشاشة، واختيار قائمة لتسجيل موقف النقر عليها، والنقر على زر للانتقال إلى القادم إطار الصورة، والنتائج في إعادة هامةالدرفلة الجديد من الوقت والجهد. في هذه الدراسة، تمت إضافة روتين خاص لبرنامج TI منضدة مصنوعة خصيصا. في وضع تتبع الهدبية من البرنامج TI طاولة العمل، وتبقي المستخدم على حلقات بسيطة عملية من خطوتين التالية: تحريك مؤشر الماوس إلى الحافة الهدبية والضغط على مفتاح السهم على لوحة المفاتيح للمضي قدما في الإطار، والتي لا تتطلب تحريك مؤشر الماوس أو عيني المستخدم لتحويل (إلى القوائم والأزرار الموجودة على شاشة الكمبيوتر) من النصائح الهدبية على شاشة الكمبيوتر. البرنامج بتتبع المواقع طرف الهدبية، يعرض مسار المسجلة لمساعدة المستخدم، وبإنشاء جدول المعلومات الهدبية الحركة لمزيد من التحليل. معظم برامج عامة لتحليل الصور يسمح وحدات الماكرو برمجة لتجهيز دفعة من هذه المهام المتكررة. ويوصى بشدة مثل هذه برمجة مخصصة للحد من الخطوات المتكررة.
تحليل مسارات
استخراج trajectoriوفاق نفذت باستخدام برنامج TI منضدة حسب الطلب، كما هو موضح أعلاه. وأجريت تحليل بسيط نسبيا ومعالجة الصور أيضا باستخدام نفس البرنامج. للتحليلات المناسب، تم نقل مسار كل طرف الهدبية لايغور برو البرمجيات. يمكن أيضا غيرها من برامج التحليل المتقدمة مثل MATLAB أن تستخدم لهذا الغرض.
في الدراسة الحالية، بسبب صعوبات في تصنيف مسارات إلى ذهابا وإيابا أو مسارات التناوب، تم تصنيف مسارات بالعين بطريقة أعمى، والتي تم تأكيدها من قبل مراقب آخر، مما أدى إلى تصنيف ثابت. ومع ذلك، فإن أكثر صرامة رياضيا تدابير لتصنيف مسارات دون أي تعسف من الممكن أن يكون الأفضل. القطع الناقص تركيب مسارات يبدو أن المثل الأعلى، والتي يمكن قياس مدى الإهليليجية باعتباره نسبة الجانب من القطع الناقص المجهزة () في كلا ذهابا وإيابا، والحركات الدورانية. لكن، كانت محاولة لاستخدام توزيع نسبة الارتفاع إلى تحديد قيمة الحد الأدنى لتصنيف غير فعالة. تركيب غالبا ما فشلت لمسارات ذهابا وإيابا، في كثير من الأحيان فشل المعلمات أن تتلاقى، وكان من المناسب المتقاربة يبدو صعب المنال. ولذلك، لم يعتمد تركيب القطع الناقص لتصنيف تلقائيا مسارات أو قياس الإهليليجية كل مسار. وجرى تركيب خارج لاستخراج الاتجاه الضرب من النصائح تتحرك بالتناوب كمحور رئيسي من القطع الناقص المجهزة.
في الدراسة الحالية، واقترح AR لقياس درجة أن ينحرف مسار من الخطية مثالية ذهابا وإيابا الحركة. المعلمة هي نسبة عرض توزيع عمودي على اتجاه الضرب إلى أن طول اتجاه. يجب أن تكون القيمة صفر عندما المسار هو خط مستقيم، واحدة عندما المسار هو دائرة، تشبه نسبة أبعاد القطع الناقص المذكورة أعلاه.
في الممارسة العملية، والحصول على قيمة AR يمكن أن يكون سهلا نسبيا من خلال تناوب مسار، بحيث يصبح الاتجاه الضرب الموازي إلى x -axis (الشكل 4B). هذا الكمي يؤدي إلى قيم واضحة إلى حد كبير عن وضعي للحركة، مما يشير إلى إمكانية استخدام المعلمة ليس فقط لتحديد خصائص كل مسار، ولكن أيضا لتصنيف أكثر صرامة مسارات. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الاتجاه الضرب في حد ذاته هو بالفعل نتيجة لعمليات تركيب متميزة عن وضعي في الطريقة الحالية.
مزيد من التحسن في التحليل، مثل خوارزمية تركيب أكثر تقدما، قد يحل مشاكل من الممكن التعسف.
ومن الجوانب المتعلقة الإهليليجية من مسار هو أن الضرب من كل هدب CPEC لا يجوز تجري في طائرة عمودية بدقة ه - و
استعدادا لSEM
أثناء الإعداد لمراقبة SEM، هناك العديد من النقاط الهامة التي تضمن الحصول على صور ذات جودة عالية. لأول مرة، بعد تثبيت من قبل رباعي أكسيد الأوزميوم يجب إجراء بعناية، بما في ذلك ما قبل الغسيل بمحلول السكروز 10٪. دون تثبيت الصحيح قبل إجراء المعاملة بالأوزميك، يمكن للخطوات اللاحقة لا تحافظ على أو استعادة حالة من العينات، مما يؤدي إلى انخفاض جودة إعداد. لأن مثبتات ألدهيد والحد من وكلاء، أي الألدهيدات المتبقية ضمن العينة تمنع نشاط رباعي أكسيد الأوزميوم، كاشف مؤكسدة قوية. لضمان القضاء على الألدهيدات زائدة في العينات، غسل حذرا مع محلول السكروز أمر حتمي. في حالات بو الأمثلST-التثبيت، لا يغير لون عينة من البني إلى الأسود. ثانيا، يجب أن يكون حجم رباعي أكسيد الأوزميوم ما لا يقل عن 50 أضعاف أكبر من أن العينة. خلاف ذلك، لا يمكن توقع تثبيت كافية. ثالثا، من المهم تجنب جفاف كامل للعينات، ولا سيما خلال عملية الجفاف الذي يستخدم الإيثانول النقي للغاية وخلات الأميل. تجفيف العينة يدمر البنى السطحية الدقيقة مثل أهداب، مما أدى إلى الصور الفقيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. تهدف هذه الورقة إلى تقديم التقارير منهجية مفصلة لمراقبة الحركة من أهداب في الأنسجة الضفيرة المشيمية معزولة. وقد تم الإبلاغ عن المستجدات العلمية في الدراسات السابقة 1،8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
