介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25 µl 血液样本中分析这些动物体内七种免疫细胞亚群。
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摘要
摘要
近年来，针对癌症的免疫疗法（如疫苗和免疫检查点抑制剂）受到广泛关注，同时人们对肿瘤微环境在治疗反应中作用的认识也不断加深，这两方面共同凸显了建立用于新疗法临床前测试的免疫健全原位模型的迫切需求。本文介绍了如何建立一种胸膜恶性间皮瘤的免疫健全原位大鼠模型。由于肿瘤位于体内深处，原位模型中疾病进展的监测面临挑战。为了对本模型及其他大鼠癌症模型中的疾病进展及其对循环免疫细胞的影响进行纵向监测，本文描述了一种仅需25 µl全血的单管流式细胞术检测方法。该方法可准确量化七项免疫参数：总淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，以及T细胞亚群CD4和CD8、B细胞和自然杀伤细胞。在不同实验条件和模型中，这些参数的不同亚群具有各自的适用性，其中中性粒细胞与淋巴细胞比值在间皮瘤模型中对监测疾病进展最具实用价值。采用这种单管法分析循环免疫细胞水平，还可有助于监测免疫治疗的反应，并加深对治疗成功或失败背后机制的理解。
引言
恶性间皮瘤（MM）是一种侵袭性恶性肿瘤，起源于覆盖肺和腹腔、心脏以及内生殖器官的膜（间皮）中的转化细胞，是胸腔或胸膜最常见的原发性肿瘤1,2。80%的恶性间皮瘤病例由接触石棉纤维引起。尽管大多数西方国家数十年前已禁止使用石棉，但石棉在社会中的广泛使用留下了致命的后遗症。世界卫生组织估计，全球每年有107,000人死于与石棉相关的疾病，且死亡率仍在持续上升。一种新的非职业性发病浪潮也正在出现，但目前尚不清楚其将在何时以及以何种程度达到高峰3。
大多数恶性胸膜间皮瘤（MM）患者在确诊时已处于晚期，此时全身化疗是唯一可行的治疗方案之一4。最有效的化疗方案即目前的“标准治疗”（培美曲塞联合顺铂5）早在十多年前就已确定。然而，该治疗方案的失败不可避免，且尚无经证实的二线治疗选择，导致患者预后极差，中位生存期仅为12个月2。因此，迫切需要开发更有效的治疗方法。尽管已有多种新型疗法在临床试验中得到评估，但均未改变临床实践。部分原因在于临床前研究结果（通常在异种移植小鼠模型中进行）向临床应用的转化率极低（仅5%）6-8。这些模型无法真实再现肿瘤微环境的复杂特征，且常在非生理部位进行研究，往往缺乏功能性免疫系统9。
同系异体原位模型相较于常用的皮下异种移植模型，能够创建更为真实的肿瘤微环境，因为肿瘤发生在正确的生理位置，且免疫系统保持完整10,11。大鼠体型较大，更适合作为啮齿类疾病模型，尤其在需要连续采血以评估治疗反应和毒性的药物研究中具有优势12。此外，在肿瘤位置难以监测疾病进展的模型中（例如胸膜腔内的肿瘤），利用循环系统中的生物因子来监测疾病进展的方法极具吸引力。本文描述了一种在免疫功能健全的大鼠中建立同系异体原位胸膜间皮瘤模型的方法。同时，还介绍了一种通过检测循环免疫细胞来简便且相对无创地监测胸膜疾病进展的方法。
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方案
所有涉及动物的实验操作均按照《澳大利亚科学用途动物护理与使用实践规范》中的建议进行。本研究的实验方案已获得皇家北岸医院动物护理与伦理委员会的批准。雌性Fischer 344大鼠（F344，150-200 g）饲养于科尔林研究所的科尔恩斯实验设施，在标准条件下维持（12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由获取食物和水）。
注意：所有实验步骤的流程图见图1。
1. 植入用细胞的制备
- 将大鼠间皮瘤II-45细胞系（亦称IL-45；通过青石棉腹腔引入法获得）在补充10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640（RPMI）培养基中培养，并置于标准条件下生长（37 °C 5% CO₂湿润培养箱2）。通过每周约1:50比例传代和继代培养两次，维持培养。2 烧瓶
- 准备细胞培养试剂，并将分装试剂置于 37 °C所需试剂包括无血清 RPMI 培养基（SFM）、含 10% FBS 的 RPMI 培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和 0.5% 胰蛋白酶-EDTA。
- 将细胞培养至约70–80%融合度后用于移植，以确保细胞处于线性生长阶段。
- 弃去培养基，用 5 ml 无菌 PBS 洗涤一次，然后加入 3 ml 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞。
- 将培养瓶放回培养箱中，孵育约 5 分钟，直至所有细胞变为非贴壁状态。
- 待细胞变为非贴壁状态后，加入 3 ml 含 10% FBS 的 RPMI 培养基以中和胰蛋白酶。收集细胞并在 300 × g 条件下离心 3 分钟。
- 用10 ml无血清培养基重悬细胞沉淀，然后在300 × g下离心3分钟。
- 用10 ml无血清培养基再次洗涤细胞沉淀，然后同上进行离心。
- 用10 ml无血清培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板或类似仪器进行细胞计数。
- 稀释细胞，使其浓度达到 100 µl 包含待移植细胞的数量。
注：已证明在低至100个细胞的剂量下可观察到肿瘤生长 100 µl 但标准剂量为 500,000 个细胞 100 µl. - 为待移植的大鼠数量准备足量的细胞悬液即， 100 µl/rat），并额外至少添加 0.5 ml 以补偿引液和针头死体积造成的损耗。
- 准备足量的无细胞 SFM，用于植入对照组大鼠即， 100 µl/rat），另需至少 0.5 ml 额外量。
注意：细胞和SFM现已准备好用于植入。应将其保持在37 oC，并在收获后2小时内植入以保持活性。
2. 在体 细胞移植
- 将F344大鼠（>13周龄）放入诱导室，通过吸入1.4%异氟烷进行麻醉（或使用机构规定的麻醉方法）。当大鼠进入睡眠状态后，将其从诱导室转移至鼻罩（持续供给1.4%异氟烷），仰卧放置，胸部朝上（腹侧朝上），以使内脏器官远离胸腔。根据机构规定的操作流程检查反射，确认大鼠已完全麻醉。
- 剃除右侧肋区（胸部）的毛发。
- 用80%（v/v）乙醇清洁剃毛区域。
- 确定注射位点：在右侧，从头侧开始找到第2个腺体。注射位点位于该腺体近端0.5 cm处，即从肋笼尾端数起的第3与第4肋骨之间。（图2A）。
- 轻轻混匀II-45细胞以重悬。将细胞悬液（对照组大鼠使用SFM）缓慢吸入1 ml无针头的注射器中。若在吸取细胞时使用针头，可能导致细胞沿针道生长。安装23G × 1¼的针头，预充针头并排除所有气泡。
- 针头预充完成后，在针管上套入一个长20 mm、直径5 mm的垫片。该垫片用于防止注射过程中针头过深刺入胸膜腔。暴露约5 mm–12 mm的针头长度足以穿过肋骨，同时避免损伤器官。
- 缓慢将针头插入肋间隙，回抽注射器以确认未刺破血管（注射器内不应出现血液），然后注入100 μl细胞悬液或SFM。（图2B）。
- 拔出针头，轻轻左右翻转大鼠，使细胞在胸腔内均匀分布。
- 将大鼠放回笼中并观察其恢复情况。大鼠通常在1分钟内苏醒并开始活动。
- 每只大鼠均使用新的针头重复上述操作。重复使用同一针头可能导致细胞沿针道生长。
- 每日监测动物的健康状况。
- 根据机构动物伦理委员会规定，在达到伦理终点时对动物实施安乐死。本实验中大鼠的伦理终点为体重减轻超过10%或出现呼吸困难。
3. 尾静脉采血
- 若需在细胞移植后立即采集血液，请保持大鼠处于麻醉状态。若在其他时间点采血，使用1.4%异氟烷吸入麻醉大鼠。根据机构规程检查反射，确保大鼠完全麻醉。
- 将大鼠侧卧放置，定位尾部外侧静脉。
- 用80%乙醇对尾部进行消毒，并标记一个0.5 ml EDTA采血管。
- 采血时，始终从尾部远端开始（约尾长三分之一处）。这样可在首次尝试失败时，允许在更靠近头端的位置进行后续尝试。切勿在已穿刺点的远端再次采血，以免引起血栓。
- 将23G × 1¼号针头平行于外侧静脉放置，并以浅角度滑入静脉，使其穿入约10 mm（图3A）。
- 注意：若静脉穿刺成功，可在针头连接端观察到血液（图3B）。
- 在针头穿刺部位的尾部会形成一滴血液。使用移液器收集该滴血液，并转移至已标记的0.5 ml（或更小）EDTA采血管中。进行免疫细胞检测时，25 μl血液已足够。在穿刺部位用纱布加压，直至出血停止。
- 轻弹采血管以混匀血液与EDTA，防止凝血。应尽量缩短采血与EDTA混合之间的时间，以防血液凝固。
- 从多只大鼠采集血液时，将含EDTA的血液样本置于室温下的试管架中保存，并在采血后2小时内完成处理。
4. 采用基于微球的方法进行免疫细胞分析的样本制备
注意：该单一平台方法依赖于使用 commercially available 的绝对计数管，每管含有已知数量的微球，用于每个样本。这些试管中含有冻干颗粒，在样本处理过程中溶解并释放出微球。微球带有荧光标记，通过圈选微球群体，可计算出绝对计数。
- 将EDTA抗凝全血样本置于缓慢旋转混匀器上混匀数分钟，确保充分混匀。为每个样本标记一支绝对计数管。在管底金属磁珠架下方应可见含有磁珠的沉淀。
- 将25 µl EDTA抗凝全血转移至已标记的绝对计数管中。加入血液后，磁珠沉淀将溶解。
- 向每支试管中加入20 µl 抗大鼠T/B/自然杀伤（NK）细胞抗体混合物、10 µl 抗大鼠CD8a PE、10 µl 抗大鼠CD4（结构域1）FITC以及10 µl 抗大鼠CD45 PE/Cy7（图4A）。荧光素定义见表1。
- 短暂离心（300 × g）试管，确保抗体和细胞沉至管底，避免粘附于管壁。涡旋混匀后于室温孵育15分钟。
- 为裂解红细胞，加入400 µl 10 mM Tris、0.15 M氯化铵缓冲液（pH 7.5），并涡旋混匀。当样本变得透明而非浑浊时，表明裂解完成（图4B和图4C）。若裂解不完全，将导致背景信号升高，并在流式细胞术分析时产生假性增高的计数结果。
5. 样品的流式细胞术处理
注意：在四色流式细胞仪上进行操作。
- 以采集模式打开软件，并创建一个包含 8 个图的新模板，如图 5所示。
- 将仪器设置调整为表 1 所列参数，并设置门控 R1（FITC [FL-1] versus APC [FL-4]），图 5Ai），用于计数荧光微球。其他门控在此采集阶段不甚重要，但在后续分析中需要使用。本方案中使用的绝对计数微球含有荧光染料，可在任意通道中检测到，但在蓝色通道中信号最弱。
- 使用已制备的对照血液样本，涡旋混匀后加载至流式细胞仪，在设置模式下以低速（12 µl/min）运行，以便调整数据采集门控。
- 设置采集参数，使 R1 微球门控中收集 10,000 个事件。
- 创建一个文件夹用于记录数据，并在采集菜单中设置文件编号并标记样本文件名。
- 将待分析的样本加载至流式细胞仪，并将流速设为中等（35 µl/min）。每个样本均应以相同流速运行。根据需要，流速可调整为低速（12 µl/min）或高速（60 µl/min），但通常使用中等流速即可。在此流速下，每个样本采集 10,000 个微球事件大约需要 90 至 120 秒。
- 样本加载后，观察散点图，确保事件出现在 R1 微球门控中。初始阶段样本压力可能存在不稳定性，导致散点图漂移，需等待其稳定。
- 待信号稳定后，点击“采集”并让样本继续运行。当流式细胞仪在 R1 门控中完成 10,000 个微球事件的采集后，仪器将自动停止采集并保存所有数据。
- 移除样本并丢弃进样管。此时流式细胞仪已准备好进行下一个样本的检测。完成所有样本检测后，进入分析模式。
6. 免疫细胞分析
注意：使用设门策略和布尔代数来定义每个细胞群。布尔代数是一种基于逻辑的分析方法，可在单个定义中实现多个运算。流式细胞仪的分析软件例如，BD CELLQuest）支持布尔代数的使用。这些方程用于主动考虑显著的阴性反应性，从而更精确地定义细胞并特异性识别各个细胞群。“区域”用于定义“门”。区域界定一个二维空间，而门可由多个区域通过代数运算符（+、*、-）连接构成，这些运算符在 表2).
- 将软件切换至分析模式。应生成一个分析模板，以匹配图5中所示的图谱和设门布局。
- 分别分析每个单独的文件（即每个单独的样本）。设置门控R1至R9，然后根据表2（也在图5中显示）定义的每种细胞类型的算法进行设置。
- 使用细胞统计计数器计算由门控和算法定义的各个细胞亚群（表2和图5）。算法将在细胞统计计数器中自动调整细胞数量。
- 使用以下公式计算细胞亚群：
注：使用上述公式对计数的细胞事件数（例如，CD4 T细胞事件）进行量化，得到每µl血液中的细胞数。示例见图5。
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结果
本文采用II-45细胞构建胸膜间皮瘤原位模型的方法，能够在可重复且快速的时间范围内使动物因间皮瘤死亡，且无大鼠因移植操作本身死亡。通过移植细胞数量的滴定实验确定，1×103 个细胞是获得完全外显率模型（100% 成瘤）所需的最低细胞数量。在大鼠体内接种不同数量的细胞会改变疾病进展的时间进程，但似乎不影响疾病的严重程度。接受 1×103、1×104 和 5×105 个细胞的动物分别在第40天、第30天和第20天达到伦理规定的实验终点 （图6）。
大鼠每周约采集两次血液，未观察到与采血相关的并发症。需要注意的是，在两周内采集的血液总量不应超过总血容量的10%（或约2 ml）。建立了一种结合门控策略与布尔代数的流式细胞术检测方法，用于鉴定淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，以及淋巴细胞亚群T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞和NK细胞。通过对照组大鼠（n=5）确定了每种细胞类型的均值和范围，并与II-45植入大鼠在实验终点时的均值和范围进行比较(...
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讨论
本文详细介绍了一种建立大鼠同系原位胸膜间皮瘤模型的方法，以及通过纵向血液采样监测疾病进展的简便方法。
II-45 模型是通过将 Fischer 344 大鼠暴露于石棉纤维而建立的13。尽管这种暴露方式能够真实反映宿主、石棉与免疫系统在间皮瘤发病过程中的相互作用，但其潜伏期较长（需数年才能形成肿瘤），且由于研究人员可能接触到石棉纤维，存在一定的安全风险。将 II-45 细胞原位植入动物胸膜腔则提供了一种安全且快速的癌症进展模型，可在免疫功能完整的宿主体内模拟人类疾病过程11。然而，目前尚无明确定义的实验操作方法和遵循原则。本文所述方法可建立一个高度可重复的模型，且该模型相对不受操作者经验的影响。关键步骤包括：1，收获处于对数生长期的 II-45 细胞，并准确计数活细胞；2，准确定位移植部位，确保穿刺针不会刺入过深而损伤肺或心脏；3，维持并监测实验动物的健康状况。
II-45 细胞系生长迅速，在培养中每 3 至 4 天需传代一次，因此在准备移植时，应进行细胞传代并每日监测生长情况。细胞应...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
同系大鼠间皮瘤II-45细胞系由瑞士苏黎世大学的Emanuela Felley-Bosco副教授惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA 采血管（0.5 ml） | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| 大鼠 T/B/NK 细胞抗体混合液 | BD Pharmingen | 558509 | 抗大鼠 CD3 APC（IgM 单克隆抗体 1F4）、抗大鼠 CD45RA FITC（IgG1 单克隆抗体 OX-33）、抗大鼠 CD161a PE（IgG1 单克隆抗体 10/78） |
| 抗大鼠 CD8a PE | Biolegend | 200608 | （IgG1v 单克隆抗体 G28） |
| 抗大鼠 CD4 FITC（结构域 1） | Biolegend | 203406 | （IgG1 单克隆抗体 OX-38） |
| 抗大鼠 CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | （IgG1 单克隆抗体 OX-1） |
| TruCount 计数管 | Becton Dickinson | 340334 | 每盒 50 支绝对计数管 |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875-119 | |
| 胎牛血清（FBS） | Scientifix | FBS500-S（批号# 010101-1） | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS 片剂 | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23G×1¼ 针头 | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml 注射器 | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 大鼠 | 澳大利亚珀斯动物资源中心（Animal Resources Centre, Perth Australia） | F344 | |
| I.S.O（异氟烷 USP） | 澳大利亚兽医公司（Veterinary Companys Australia, VCA） | B7058 | |
| II-45 大鼠间皮瘤细胞系 | 苏黎世大学（Zurich University） | 注：该细胞系为赠送品，未在 ATCC 商业化提供 | |
| FACSCalibur 四色流式细胞仪 | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| 氯化铵 | SIGMA | 9718 | |
| 麻醉机（The stinger） | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
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