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方法文章

Ex Vivo 小鼠表皮感染单纯疱疹病毒1型

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DOI：

10.3791/53046

⸱

2015年8月24日

 ,  ,  , 
1Center for Biochemistry, University of Cologne, 2Department of Dermatology, University of Cologne

本文内容

摘要

皮肤是人类病原体单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶组织之一。为探究HSV-1侵入组织的途径，我们建立了一种 离体 小鼠表皮片感染模型，表皮片代表皮肤的最外层。

摘要

为了进入人体宿主，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）必须突破黏膜表面、皮肤或角膜的屏障。HSV-1在初始侵入过程中靶向角质形成细胞，并在上皮组织中建立原发性感染，随后感染神经元并进入潜伏状态。在病毒再激活后，可在皮肤黏膜部位出现可见的病毒病灶，表现为皮肤水疱或黏膜溃疡。目前对HSV-1如何侵入皮肤或黏膜并到达其受体的过程仍知之甚少。为了在细胞水平上研究HSV-1侵入表皮组织的途径，我们建立了一种小鼠表皮组织的ex vivo感染模型，该模型可代表皮肤中原发性和复发性感染的发生部位。该检测方法包括小鼠皮肤的制备，通过dispase II处理将表皮与真皮分离。将表皮组织片漂浮于含病毒的培养基中感染后，固定组织，并可在感染后不同时间点通过针对HSV-1即刻早期蛋白ICP0的抗体染色来观察感染情况。感染后1.5小时即可在基底层角质形成细胞中观察到表达ICP0的细胞。随着感染时间延长，感染细胞在表皮上层中也被检测到，表明感染不仅局限于基底层角质形成细胞，病毒可在组织内向其他层次扩散。利用不同小鼠模型的表皮组织片，该感染方案可用于确定参与HSV-1侵入组织的宿主细胞组分。此外，该检测方法也适用于在组织水平上测试干扰病毒初始进入、细胞间传播及病毒产生的抑制剂。本文中，我们详细描述了ex vivo感染的操作流程，并展示了使用nectin-1缺陷或HVEM缺陷小鼠所获得的实验结果。

引言

单纯疱疹病毒（HSV）可导致人类多种疾病，从轻微的非复杂性黏膜皮肤病变到危及生命的感染。HSV-1 主要引起口腔面部感染和脑炎，而 HSV-2 更容易引起生殖器感染1。尽管在体外培养中对 HSV 如何进入细胞、启动感染及产生子代病毒已有显著进展，但我们对 HSV 在组织水平上以何种细胞途径入侵仍知之甚少2。在研究 HSV 皮肤或黏膜感染时，小鼠、兔子和豚鼠已被用作动物模型。通过皮内注射或在病毒存在下刮伤皮肤来建立皮肤感染，并将疾病发展与病毒复制情况进行关联。这些方法有助于理解疾病发病机制的多个方面，并被用于评估抗病毒药物。为在组织水平上研究 HSV 感染，已应用了类器官型人皮肤模型。由于此类筏式培养中感染速率受限，目前仅有限数量的研究报道了感染过程、病毒扩散以及抗病毒成分作用的相关结果3-6。

为了表征在完整上皮组织中参与 HSV-1 感染过程的细胞决定因素，我们建立了一种用于小鼠表皮组织离体感染研究的实验方案7。皮肤样本取自新生小鼠或成年小鼠的尾部。由于 HSV-1 无法感染完全 intact 的皮肤组织（即完全浸没于含病毒培养基中的样本），我们通过 dispase II 处理将表皮与真皮分离。将表皮组织片漂浮于含病毒的培养基上进行感染后，可在感染后不同时间点（p.i.）于表皮基底层中观察到被感染的细胞7。为了在单个细胞中可视化病毒感染的起始阶段（即在病毒复制和病毒颗粒产生之前），我们使用针对感染细胞蛋白 0（ICP0）的抗体进行染色，ICP0 是 HSV-1 感染早期最先表达的蛋白之一。ICP0 的细胞定位在感染早期会经历一系列明确的阶段变化：在病毒基因表达的早期阶段，ICP0 存在于细胞核内的焦点结构中；而当 ICP0 重新定位于细胞质时，则标志着感染进入后续阶段8。

我们采用来自不同小鼠模型的表皮组织片进行离体（ex vivo）感染实验，以检测多种细胞因子在感染过程中的潜在作用。为探讨Rac1作为肌动蛋白动态关键调控因子的影响，我们对具有角质形成细胞特异性rac1基因敲除的小鼠表皮进行了感染9。该模型使我们能够研究Rac1缺失对HSV-1在表皮角质形成细胞层中感染效率的影响。与对照组同窝小鼠的感染表皮相比，未观察到显著差异，表明Rac1的缺失对表皮基底层感染的起始无影响7。通过使用其他小鼠模型，我们进一步探究了介导病毒进入表皮的细胞受体。用HSV-1感染nectin-1缺陷或HVEM缺陷小鼠的表皮组织片结果显示，病毒最初进入组织高度依赖于nectin-1的存在10。此外，我们的结果表明HVEM也可作为小鼠表皮中的受体，但其介导效率低于nectin-110。

为了研究感染细胞在表皮各层中的空间分布，我们对组织切片和表皮全装片中的ICP0表达进行可视化观察（图1）。在完整皮肤的冷冻切片中，未检测到表达ICP0的细胞（图1）。相比之下，在感染后3小时（p.i.）的表皮片冷冻切片中，已在基底层观察到胞质中的ICP0表达（图1）。在后续时间点，可观察到病毒向基底上层的扩散。感染细胞在基底层中的空间分布可通过表皮全装片清晰追踪（图1）。当以100 PFU/细胞的剂量感染HSV-1时，在感染后1.5小时，约50%的毛囊间表皮基底角质形成细胞呈现ICP0表达。在此时间点，大多数感染细胞表达核内ICP0。表明早期基因表达较晚阶段的ICP0从核向胞质的重定位，在感染后3小时几乎在所有细胞中均可见（图1）。此类在离体（ex vivo）HSV-1感染条件下可视化感染细胞的方法，为研究抑制剂或缺失/突变的细胞组分对病毒进入和在组织中扩散的影响提供了强有力的实验手段。

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方案

伦理声明。

从安乐死动物制备表皮片的操作严格遵循德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz，北莱茵-威斯特法伦州）指南的建议。本研究已获北威州环境署（LANUV NRW）批准（批准编号：8.84-02.05.20.13.018）。

1. 仪器与培养基的准备

  1. 在含有谷氨酰胺二肽、10% 胎牛血清（FCS）、100 IU/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）/高糖培养基中培养表皮片（下文简称为“DMEM”）。
  2. 制备表皮片时，将dispase II粉末（5 mg/ml）小心溶解于预热的PBS（最高37 °C）中。用0.22 µm滤器过滤溶液，并立即用于处理。
  3. 为制备表皮全层铺片13，配制含0.5%奶粉、0.25%冷水鱼皮明胶和0.5% Triton X-100的TBS封闭缓冲液。将混合物在室温下于旋转混合器上孵育至少2小时 ，使各成分充分溶解。同时配制含0.2% Tween 20的PBS作为洗涤缓冲液。固定时，配制含3.4%和4%甲醛的PBS溶液。
  4. 进行冷冻切片免疫染色时，配制含5%正常山羊血清和0.2% Tween 20的PBS封闭缓冲液。固定时，配制含0.5%甲醛的PBS溶液。

2. 小鼠皮肤表皮片的制备

  1. 用于感染研究的新生小鼠背部皮肤表皮制备
    1. 将一只断头的小鼠（出生后1至3天）放入解剖皿中，从靠近躯干处剪除四肢和尾巴，以便高效地完整剥离躯干皮肤。在切除四肢时，应尽量使切口直径最小化。
    2. 用弯头精细镊子固定躯干，将钝头剪刀从头部向尾部方向轻轻插入背部皮肤下方，沿背侧推进以分离皮肤与躯干组织，然后沿背部纵向切开皮肤。
    3. 如需进行FACS分析、角质形成细胞分离或RNA制备，使用镊子夹住组织，同时用钝头剪刀推离躯干，将整张皮肤从躯干上剥离下来；若用于制备冷冻切片或整体装片，则仅取背部皮肤的小块组织。
    4. 用手术刀将背部皮肤切成约10 × 10 mm大小的1–2块组织，放入6孔板的一个孔中，加入约1 ml无菌PBS。确保真皮面朝下贴附于孔底。
    5. 用1.5 ml dispase II（5 mg/ml PBS）替换PBS，于37 °C孵育30分钟（用于整体装片）或于4 °C过夜孵育（O/N）。用PBS洗涤3次。用一把镊子固定下方的真皮组织，另一把镊子轻轻提起表皮，以完整片状剥离表皮。建议使用双目显微镜辅助操作以提高效率。将分离出的表皮片转移至DMEM中，使其基底面朝下。立即用于感染实验。
      注意：新生小鼠皮肤表皮的制备主要用于FACS分析、角质形成细胞分离或RNA制备。由于其结构脆弱，不适用于制备用于冷冻切片或整体装片的感染后表皮片。
  2. 用于感染研究的成年小鼠尾部皮肤表皮制备
    1. 通过颈椎脱位法处死1至3月龄的小鼠。选择尾部皮肤而非背部皮肤，因为背部皮肤中深埋的毛囊较长，不利于完整表皮片的分离。从死亡小鼠身上剪下尾巴，并用手术刀沿长轴纵向切开。
    2. 将皮肤从骨头上剥离，并用手术刀切成约5 × 5 mm大小的组织块。每孔最多放入4块组织，随后按照步骤2.1.5所述方法在dispase II中进行孵育。
      注意：成年小鼠尾部皮肤适用于制备冷冻切片或整体装片。作为替代方案，尾巴可在4 °C保存或运输约24小时 而不会显著降低感染效率。若保存时间达48小时，则表皮片几乎无法被HSV-1有效感染。
  3. 表皮组织解离用于FACS分析
    注意：通过FACS分析检测表面蛋白表达时，需采用适当的细胞解离技术，以避免损伤细胞表面及目标蛋白。
    1. 将新生小鼠表皮片置于6孔板中，基底面朝下，每孔加入1.5 ml基于重组胰蛋白酶的细胞解离液，室温孵育15分钟，随后在37 °C继续孵育15分钟。
    2. 加入3 ml DMEM终止孵育。使用弯头精细镊子在孔内轻轻搅动表皮组织，使角质形成细胞解离。收集细胞悬液，并重复此步骤3次，每次均使用新鲜DMEM。
      注意：该解离程序适用于检测角质形成细胞表面nectin-1的表达。
    3. 可选方案：将表皮片置于无酶细胞解离液（CDS）中，室温孵育15分钟，再于37 °C孵育15分钟。随后在室温继续孵育15分钟，通过上下吹打CDS轻柔地洗出角质形成细胞。
    4. 收集细胞悬液，并使用新鲜DMEM重复冲洗步骤3次。
      注意：该解离方法适用于检测HVEM的表面表达。CDS溶液的缺点是解离所得细胞数量少于基于重组胰蛋白酶的解离液。此外，在使用基于重组胰蛋白酶的解离液处理感染后的表皮片后，除表面蛋白外，还可通过FACS分析核内或胞质内的表达，例如ICP0的表达。
  4. 表皮组织解离用于角质形成细胞分离或RNA提取
    1. 将新生小鼠表皮片放入6孔板中，基底面朝下，每孔加入1.5 ml基于重组胰蛋白酶的细胞解离液。室温孵育30分钟。加入3 ml DMEM，并使用弯头精细镊子在孔内轻轻搅动表皮组织以促进角质形成细胞解离。
    2. 收集细胞悬液，并重复该步骤3次，每次使用新鲜DMEM。所得细胞悬液可用于RNA提取或原代小鼠角质形成细胞的培养。

3. 使用 HSV-1 感染表皮片

  1. 制备 HSV-1 野生型毒株 1711 的溶液，体积不少于 500 µl DMEM，并将漂浮着表皮片的培养基更换为该病毒溶液。此时间点定义为 0 时12。在 37 °C 条件下，于 24 孔板的一个孔中对一片表皮片进行感染。病毒滴度的计算基于每片表皮基底层中估算的细胞数量（约每 5 × 5 mm 表皮片含 2 × 105 个细胞）。
  2. 以约每细胞 100 个空斑形成单位（PFU）的剂量用 HSV-1 进行感染，并在感染后 1 小时将含病毒的培养基更换为 DMEM。 
    注意：若使用新生儿皮肤来源的表皮片，需注意在孵育过程中表皮片可能开始解离。

4. 感染细胞的观察

  1. 表皮全层铺片13
    1. 用3.4%甲醛固定表皮组织片，固定时间为2小时 在室温或过夜 在4 °C下用PBS洗涤两次，然后在室温下用含0.5%脱脂奶粉、0.25%冷水鱼皮明胶和0.5% Triton X-100的TBS溶液封闭1小时14.
    2. 将切片与小鼠抗ICP0（单克隆抗体11060）在4℃孵育过夜15 用封闭缓冲液在室温下按1:60稀释。为观察中间纤维网络，同时加入兔抗小鼠波形蛋白14多克隆抗体（100 ng/ml）进行孵育。
    3. 用 PBS-0.2% Tween 20 在室温下洗涤 4 至 5 次，每次持续 4 小时。随后在封闭缓冲液中，于室温下用 AF488 标记的抗小鼠 IgG（1 µg/ml）、AF555 标记的抗兔 IgG（1 µg/ml）和 DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）（100 ng/ml）避光孵育过夜。
    4. 用 PBS-0.2% Tween 20 洗涤 4 小时 室温下将表皮片基底面朝上置于载玻片上，用荧光封片剂封固，加盖盖玻片。
  2. 表皮冷冻切片
    1. 成年表皮组织片在含4%甲醛的PBS中室温固定20分钟，用PBS洗涤2次。将固定后的组织片包埋于组织冷冻包埋剂中，浸入液氮冷冻。使用冷冻切片机切取8–10 µm厚的切片。
    2. 用0.5%多聚甲醛在PBS中室温固定样本10分钟，用PBS洗涤2次，再用含5%正常山羊血清和0.2% Tween 20的PBS溶液在室温封闭30分钟，然后加入小鼠抗ICP0抗体（单克隆抗体11060）室温孵育60分钟进行染色15 用封闭缓冲液按1:60比例稀释，随后用封闭缓冲液洗涤3次。
    3. 然后在封闭缓冲液中加入AF488标记的山羊抗小鼠IgG（1 µg/ml）和DAPI（100 ng/ml），室温孵育45分钟，洗涤3次。将切片置于荧光封片剂中，加盖盖玻片。 

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结果

该方法的难点在于制备表皮片，使HSV-1能够从基底层侵入。关键步骤是使用dispase II处理将表皮与真皮分离，该步骤需根据小鼠品系的不同进行调整。dispase II的浓度可在2.5至5 mg/ml之间，孵育时间可在20至45分钟之间。中间丝蛋白角蛋白14（keratin 14）的染色可有效预测基底表皮层是否可被感染，或仅出现极少量感染细胞（图2）。理想情况下，表皮全层标本的角蛋白14染色应显示完整的基底细胞层（图2A）。最差情况下，dispase II处理破坏了基底层，导致间毛囊表皮中无细胞着色，表明表达角蛋白14的基底角质形成细胞已解离（图2B）。尽管C57BL/6小鼠的表皮片在37 °C下用5 mg/ml dispase II处理30分钟后可顺利分离，但相同操作会破坏B6.A2G-Mx1小鼠表皮的基底层16（图2B）。只有将dispase II浓度降低至2.5 mg/ml并孵育30分钟，才能获得完整的基底层，这一点通过角蛋白14染色得以证实（图2C

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讨论

当C57BL/6小鼠成年皮肤的表皮片在约100 PFU/细胞的感染复数下接种HSV-1时，我们在间质性表皮的基底层中几乎观察到所有细胞均被感染；而较低的病毒剂量则与较少的感染细胞数量及较慢的感染进程相关。通常情况下，毛囊中感染细胞的数量存在差异；发育中的毛囊周围排列的较小角质形成细胞大多被感染，而成年毛囊中仅毛囊胚部分被完全感染。根据dispase II处理分离表皮的温和程度不同，部分毛囊结构可能丢失。大多数情况下，皮脂腺与间质性表皮之间的角质形成细胞层缺失，外根鞘衬里层也可能出现断裂。无论如何，从真皮上分离表皮的操作过程以及感染效率可能因小鼠品系的不同而有所差异（图2）。

综上所述，这一挑战的 离体 感染实验的关键步骤是表皮片的制备与维持。组织的脆弱性要求操作必须极为小心，这直接影响表皮与真皮分离后组织的保存状态。另一个问题是表皮片在培养中的存活时间有限。由于细胞活力随时间推移而下降，感染实验应立即进行，或最迟在分离后3小时内完成 制备表皮片后。除小鼠皮肤外，表皮片还可由人皮肤或黏膜样本制备。根据表皮的性质和厚度，需调...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Peter Staeheli 提供 B6.A2G-Mx1 小鼠，以及 Semra Özcelik 提供的技术指导。

本工作由德国研究基金会通过SFB829和KN536/16项目以及科隆大学医学院科隆福图纳项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/高糖/GlutaMAXLife Technologies31966047用于表皮片的培养
dispase II 粉末Roche4942078001需溶于预热的 PBS 中
无酶细胞解离溶液SigmaC5914用于非常温和地解离表皮片
TrypLE select 细胞解离溶液Life Technologies12563-029用于解离表皮片
chelex 100 树脂Bio-Rad142-2832用于从胎牛血清中螯合多价金属离子
冷水鱼皮明胶 SigmaG7765用于最小化非特异性抗体结合
角蛋白14多克隆抗体 (AF64) (浓度：1 mg/ml)CovancePRB-155P用于可视化中间丝角蛋白14，其为表皮基底层的标志物
鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 标记 (浓度：2 mg/ml)Life TechnologiesA-11029用作二抗
兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 555 标记 (浓度：2 mg/ml)Life TechnologiesA-21429用作二抗
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI 二盐酸盐)                             (浓度：0.1 mg/ml)Sigma36670用于细胞核复染

参考文献

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