Summary
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. Derfor kommercielle sonder er i stor demand.In dette arbejde en sondekonstruktion er forklaret i detaljer at bygge en pålidelig, koncentriske, skræddersyet mikrodialysesonde for mindre end $ 10.
Abstract
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. Derfor kommercielle sonder er i stor efterspørgsel til at overvåge fysiologiske, farmakologiske og patologiske forandringer i cerebrospinalvæske. Desværre, kommercielle sonder er dyre for forskergrupper i offentlige institutioner. I dette arbejde, er en sonde forsamling forklaret i detaljer at bygge en pålidelig, koncentriske, skræddersyet mikrodialysesonde for mindre end $ 10. Den mikrodialysesonde består af en polysulfon membran med en molekylær afskæring på 30 kDa. Probe in vitro genfindelse af stoffer med forskellig molekylvægt (i intervallet 100-1,600 Da) og forskellige fysisk-kemiske egenskaber sammenlignes. Sonden giver en in vitro inddrivelse af ca. 20% for små forbindelser glukose, laktat, acetylcholin og ATP. In vitro-inddrivelser for neuropeptider med en molekylvægt mellem 1,000-1,600 Da udgør 2-6%. Medens højere molekylære wotte af de neuropeptider sænket in vitro recovery værdier, dialyse af forbindelser i det nedre område (op til 500 Da) molekylvægte ikke har større indvirkning på in vitro recovery rate. Den foreliggende fremgangsmåde muliggør udnyttelse af en dialysemembran med andre afskæringsværdi og membranmateriale. Derfor er denne skræddersyet sondekonstruktion har den fordel tilstrækkelig fleksibilitet til at dialysere stoffer i et bredt molekylvægtsområde. Her introducerer vi en mikrodialysesonde med en længde på 2 mm udveksling, der finder anvendelse for mikrodialyse i mus og rotte hjerneområder. Dog kan dimensionerne af sonden nemt tilpasses til større veksel- længder, der skal anvendes i større dyr.
Introduction
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. I løbet af de sidste 50 år har den minimale-invasiv mikrodialyse teknik løbende blevet forbedret til at blive en veletableret metode til at overvåge de lokale koncentrationer af små molekylvægt i det ekstracellulære rum. Næsten hver interstitiel vævsvæske kan undersøges i frit bevægelige dyr.
Gaddum introducerede push-pull teknik i 1960'erne. Han modificeret en tilgang fra Feldberg et al., Hvori tubocurarin blev perfunderet gennem en kanyle ender i den laterale ventrikel og opsamling af spildevand også via en kanyle 1. Gaddum udviklet push-pull teknik, hvor en kanyle, der består af to koncentriske stål nåle blev implanteret i særskilte hjerneområder og perfunderet ved en opløsning under samtidig fjernelse af neurotransmittere frigivet fra neuronerne omgiver spidsen 2. Desværre, væv damage forårsaget af kanylen omkring spidsen begrænset anvendelsen af denne metode. Som en yderligere fremføring af denne fremgangsmåde, Bito og medarbejdere indført en dialysepose fremgangsmåde, hvor den opsamlede opløsning blev adskilt fra det omgivende væv ved en dialysemembran. De implanterede en dialyse sac i det subkutane væv af hunde halse. Indholdet af dialyseposen er protein-fri og kunne analyseres mange uger senere for ioner og aminosyrer 3. Den næste udvikling var dialytrode, en primitiv mikrodialysesonde, som oprindeligt blev beskrevet af Delgado i 1972 4. Endelig Ungerstedt og kolleger forbedret design af mikrodialysesonde, så det var mindre og mindre forskudte væv 5.
En koncentrisk mikrodialysesonde opfører sig på samme til en blod kapillær. Systemet er konstant perfunderes af en opløsning med den ioniske sammensætning af det omgivende vævsvæske mens mangler analytten af interesse. The dialysemembran udsat for den eksterne opløsning eller væv er semipermeabel. Den tillader passiv diffusion af stoffer ind i sonden langs deres koncentrationsgradient 6. Permeabiliteten er afhængig af mange variable, såsom molekylvægt, form, ladning og pH af forbindelsen. Det er også begrænset på grund af egenskaberne af membranmaterialet porestørrelsen af membranen og strømningshastigheden 7.
Figurerne 1 og 2 viser en koncentrisk mikrodialysesonde. Perfusionsfluidet træder via et indløb slangen i metalbøsningen, som omgiver kvartsglas. Inde i metal ærme, det strømmer ned langs kvartsglas og efterlader det på sin spids. I rummet mellem dialysemembranen og polytetrafluorethylen (PTFE) -tubing (såsom Teflon) perfusionsfluidet strømmer derefter opad. Her, diffusion af stoffer fra væv indtræffer, som omgiver membranen. Dialysatet forlader sonden gennem PTFE-slange, som er forbundet til udløbsslangen og kan opsamles.
Mikrodialysen teknik har adskillige fordele i forhold til andre in vivo teknikker. Sonden udgør en fysisk barriere med det resultat, at dialysatet ikke indeholder enzymer eller celler. Derfor er der ikke behov for oprensning af eluatet før analyse, og ingen enzymatisk nedbrydning af analytter finder sted. Oxidativ nedbrydning kan forekomme under passage af analytter i slangen, men dette kan ofte forhindres ved tilsætning af en antioxidant (f.eks ascorbinsyre) til perfusatet. Alternativt oxidative skader på neuropeptider, for eksempel, var effektivt undertrykt af udløbsslangen erstatte med en spids til opsamling af dialysatet 8. Dialysatet kan undersøges direkte med næsten alle slags analysemetode og multiple analytter kan indsamles samtidigt. Dette system kan anvendes i vågne dyr, og næsten alle hjerneregioner kan væreundersøgt. Endvidere infusion af lægemidler gennem sonden er mulig (retrodialysis). Der er dog også begrænsninger af mikrodialyse teknikken. Den noget lave tidsopløsning ikke giver real-time information om neurotransmitter ændringer. Fordi det er en invasiv teknik, probe implantation forårsager kirurgisk trauma og anæstesi, hvilket kan påvirke neurotransmitter koncentrationer, der kræves i dette trin 7,9,10.
Koncentrationen af forbindelsen i dialysatet omfatter kun en lille mængde af den faktiske forbindelse koncentrationen i den ekstracellulære væske. Til beregning af den ukendte forbindelse koncentrationen i den ekstracellulære væske, relative in vitro opsving skal beregnes. Fastsættelse af individuelle forhold in vitro inddrivelser for hver probe og hver forbindelsen er nødvendig, før du starter in vivo forsøg. Til dette formål er sonden dyppes i en opløsning indeholdende detanalyt henviser perfusionsfluidet er den samme opløsning mangler analytten af interesse. Efter bestemmelse af sammensatte koncentrationer i dialysat, denne data skal henvises til deres koncentration i den omgivende væske. In vitro-bestemmelser af flere forskellige stoffer inddrivelse kan gennemføres samtidigt 9.
Mange neurovidenskab forskergrupper bruge mikrodialyse teknik til at undersøge neurotransmittere og metabolitter i det ekstracellulære rum af distinkte områder i hjernen. Således kommercielle sonder er i stor efterspørgsel i neurovidenskab forskningsmiljø. En stor fordel ved kommercielt tilgængelige prober er den høje funktionssikkerhed. Den eksperimentelle opstilling til kommercielle prober er veletableret og valideret til mange kendte neurotransmittere og metabolitter. Men mens den kommercielt tilgængelige mikrodialyse udstyr er dyrt og har mindre fleksibilitet i anvendelsen 11, ther arbejde en mikrodialysesonde samling præsenteres i detaljer, som kan tilpasses enhver applikation og kan fremstilles for mindre end $ 10. Dette skræddersyede sonde er en koncentrisk mikrodialyse testet for undersøgelser i forskellige hjerneområder 8 sonde.
In vitro sonde genfindelse af stoffer med forskellig molekylvægt (område for 100-1,600 Da) og med forskellige fysisk-kemiske egenskaber sammenlignes. In vitro bestemmelse af genfinding af glucose, lactat og acetylcholin med en molekylvægt på mindre end 200 Da, ATP med en molekylvægt omtrent 500 Da og neuropeptider angiotensin II, substans P og somatostatin med en molekylvægt over 1.000 Da udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse PTFE-slange
- Forkorte PTFE-slangen i 2,5 cm stykke. Brug en skala papir til at estimere fysiske dimensioner. (Se figur 3a)
- Skære en slutning i en vinkel for at lette tilslutning af udløbsslangen. (Se figur 3a)
- Ujævn PTFE-slangen ved anvendelse af sandpapir for at tillade klæbning af epoxylim.
2. Forberedelse Fused Silica
- Afkort kvartsglas i 2,25 cm stykke. (Se figur 3a)
3. Indsættelse af kvartsglas i PTFE-slange
- Indsæt en 30 G kanyle ind i det hule PTFE-fiber til at gennembore det i en afstand af 1 cm fra den flade ende. Bøj PTFE-slange at forenkle processen. (Se figur 3b)
- Indsæt kvartsglas i PTFE-slangen ved hjælp af kanylen som vejledning. (Se figur 3c)
- Fjern forsigtigt kanylen og sikre kvartsglas. (SeFigur 3d)
- Den smeltet silica formodes at projicere 5 mm ved den flade ende. (Se figur 3e)
- Lim kvartsglas på plads ved punkturstedet ved cyanoacrylat lim og lad det hærde natten over. (Se figur 3e)
4. Forberedelse Epoxy Lim (To Component Lim)
- Tilføj 30 dele gul hærder til 70 dele sort epoxy lim ved hjælp af en bøde nål og bland det forsigtigt. Det er direkte klar til brug.
5. Anvendelse af Membrane (Alle Yderligere trin skal udføres under mikroskop og en Scale Papir anvendes til at estimere Fysiske dimensioner)
- Træk polysulfonmembran forsigtigt over kvartsglas, træk derefter membranen ind i PTFE-slange og justere membranen til 5,5 mm med en skarp skalpel. (Se figur 3f)
- Indstil en mærkning punkt på membranen med en fin pen til at definere udvekslingen længde på 2 mmfra enden af membranen.
- Anvende en lille mængde epoxy lim til at dække spidsen af membranen ved hjælp af en fin nål. (Se figur 3g)
- Luk off samlingen mellem dialysemembran og PTFE-fiber ved hjælp af det samme fin nål anvendes i trin 5.3) med epoxylim. (Se figur 3g)
- Tilsæt så epoxy lim på membranen op til markeringen punkt at sikre en længde udveksling af 2 mm. Lad det hærde i løbet af natten. (Se figur 3 g) Før bestemmelse af udvekslingen længde, membranen er 5,5 mm. Efter påføring af epoxy lim på membranen, kun 2 mm af membranen er tilgængelig for diffusion.
6. Anvendelse af Metal Sleeve
- Skær en 25 G nål i 1 cm metal ærme stykker ved hjælp af en bøjning tang.
- Træk 1 cm metalbøsningen (25 G) på den resterende del af kvartsglas. Metalmuffen senere muliggør tilslutningen af indløbsrøret med microdialysis probe. (Se fig 3h)
- Tætne samlingen mellem metalhylster og PTFE-slange med den resterende epoxy lim. Lad det hærde i mindst 24 timer. (Se figur 3i)
- Anvende varm lim omkring tvedeling af probe til yderligere fiksering og stabilisering.
BEMÆRK: indløb indre volumen af sonden er 0,045 pi og det interne volumen udløb er 2,5 pi. Derfor, med en strømningshastighed på 1 ul / min, det tager cirka 2,5 minutter efter tilslutning indløbsrøret for at starte indsamlingen af dialysatet. Med den nuværende protokol, sondesamlingen procedure giver mikrodialyse sonder, der er 95% pålidelige.
7. Udførelse af in vitro Recovery Eksperimenter
- Dyp sonden med en afskæring på 30 kDa og en længde på 2 mm udveksling i en stamopløsning sammensat af aCSF indeholdende 1 mM glucose og 1 mM lactat, og i et separat eksperiment, i en CSF indeholdende 100nM ATP og 100 nM acetylcholin.
- Perfundere proberne med aCSF. Indstillet strømningshastighed til 1 pl / min og udføre eksperimenter ved stuetemperatur (22 ° C). Lad sonderne at komme i ligevægt i 1 time i stamopløsningen, og indsamle prøverne hver 30 min bagefter og opbevares ved -80 ° C indtil måling.
- Til beregning af in vitro inddrivelser, sammenligne koncentrationerne af analytter i dialysater med de kendte analytkoncentrationer i stamopløsningen. Udtrykke resultaterne som procentdele af koncentration stof i dialysat vs. stamopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den koncentriske skræddersyede mikrodialysesonde består af en polysulfon membran med en molekylær afskæring på 30 kDa. Sondesamlingen er illustreret i figur 3.
Det udviste en in vitro-opsving for den lille energi metabolitter glukose (180,16 Da) og laktat (112,06 Da) på 19,10 ± 1,2% og 21,2 ± 1,6%, hhv. For det positivt ladede acetylcholin med en molekylvægt på 181,66 Da, det viste en in vitro recovery værdi på 22,6 ± 1,4%. ATP med en molekylvægt på 551,62 Da og tre negativt ladede phosphatrester gav en in vitro nyttiggørelse til en sammenlignelig grad (22,4 ± 0,7%). In vitro-genfindelse af små molekyler er vist i figur 4A.
Neuropeptider med en molekylvægt over 1.000 Da viste lavere in vitro inddrivelser sammenlignet med mindre molekyler (<500 Da) (se Fi figur 4B). Blandt de testede neuropeptider, angiotensin II (1,046.18 Da) er den mindste peptid med 8 aminosyrer. Den udviste en in vitro genvinding på 6,1 ± 0,3%. Den 11 aminosyrerest substans P (1,347.63 Da) og 14 aminosyrer somatostatin (1,637.88 Da) viste omtrent lig in vitro recovery værdier på 2,2 ± 0,3% og 2,3 ± 0,1% hhv. In vitro-genfindelse af vores 30 kDa probe er sammenlignes med in vitro inddrivelser af kommercielt tilgængelige mikrodialyse sonder (CMA Mikrodialyseforsøg, Stockholm, Sverige), f.eks. lactat 23% og glucose 13% (se ansøgning note nr. 1)
Figur 1: Fotografi af en skræddersyet sonde.
8 / 53048fig2.jpg "/>
Figur 2: Skematisk billede af en mikrodialysesonde (Gengivet fra Lietsche et al, 2014 med tilladelse fra ELSEVIER.).
Figur 3: Skematisk billede af en sondekonstruktion; trin ai for detaljer se protokol (Gengivet fra Lietsche et al., 2014 med tilladelse fra ELSEVIER).
Figur 4: Inddrivelse af små molekyler og neuropeptider (A) In vitro inddrivelser af glukose, laktat, acetylcholin og ATP.. Stamopløsningen indeholdt 1 mM af glucose og lactat og alternativt 100 nM ATP og 100 nM acetylcholin for hver eksperimentel betingelse. Resultater er udtrykt som procent af stoffets koncentration i dialysat / stamopløsning. Værdier af teststoffer er middelværdier ± SD af n = 22 for glucose, n = 22 for lactat, n = 11 for acetylcholin og n = 13 for ATP. (B) In vitro inddrivelser af neuropeptider angiotensin II, substans P og somatostatin. Stamopløsningen indeholdt 100 nM angiotensin II, substans P og somatostatin for hver eksperimentel betingelse. Resultaterne er udtrykt i procent af koncentrationen stof i dialysat / stamopløsning. Værdier af søjler er middel ± SD af n = 6 for hver probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 3 viser et eksempel på sondekonstruktionen. Korrekte dimensioner indre og ydre diameter skal observeres nøje for slanger (OD 1,6 mm ID 350 um), smeltet silica (OD 105 um, ID 40 um) og dialyse membran (OD 245 um, ID 210 um). Det er også vigtigt at holde et mellemrum mellem membran og kvartsglas af (105 um) og mellem membranen og røret (105 um) samt. Hvis værdierne er forskellige, kan trykket i sonden stige og føre til lækage af membranen.
Her introducerer vi en mikrodialysesonde med en længde på 2 mm udveksling, der finder anvendelse for mikrodialyse i mus hjerneregioner. Dog kan dimensioner let tilpasses til større veksel- længder, der skal anvendes i større dyr.
Nogle dele af samlingen kan udskiftes. For eksempel er det ikke nødvendigt at anvende PTFE-slange. Anvendelsen af polyethylenrør er også mulig med identiske ydre og innis dimensioner diameter. Ru af slangen er kun nødvendigt, når du bruger en PTFE-slange. En udskiftning af dialysemembranen er også mulig. Til den foreliggende sondekonstruktionen, anvendes en 30 kDa cut-off membran, men enhver anden dialysemembran kan anvendes med identiske dimensioner. Derfor er vores skræddersyede sondekonstruktion har den fordel, stor fleksibilitet til at dialysere stoffer med en bred molekylvægtsfordeling interval; jo højere molekylvægt cut-off, jo højere molekylvægten af det stof, som kan dialyseres. In vitro inddrivelser normalt stige med molekylvægt afskæring af dialysemembranen.
At dække spidsen af membranen, er epoxylim kræves for at lukke samlingen mellem dialysemembran og PTFE-slanger og for at bestemme udvekslingen længde. Anvendelse af cyanoacrylatklæbestof er ikke mulig i dette trin, fordi det påvirker dialysemembran og fører til lækage. En cyanoacrylatklæbemiddel at lime plASTIC bør anvendes til fiksering af smeltet silica med slangen på plads ved indstiksstedet.
Det skal bemærkes, at denne probe design ikke er testet med guide kanyler. Vores lab foretrækker at implantere sonder lav diameter for akutte forsøg, hvor vi har 48-72 timers eksperimentelle tid før astrogliose forårsager fejlfunktion af sonden. For denne type forsøg, går en guide kanyle ikke tilbyde en fordel, fordi guide kanyler er større og forårsage mere vævsbeskadigelse. Selv med en guide kanyle på plads, sonden altid skal indsættes i sundt hjernevæv, der forårsager akut skade på området dialyse. Gentagen indsættelse og fjernelse af sonden gennem vejledning kanyler forårsager gentagen skade, en situation, der undgås ved engangs-, dvs. akut indsættelse. Blod-hjerne-barrieren blev vist at være intakte få timer efter implantation 12. Guide kanyler er at foretrække, men når serielle målinger have at ske over flere dage eller uger. Endelig bør flygtige anæstetika anvendes til probe implantation, fordi injicerbare anæstetika forstyrre senere eksperimenter i 1-2 dage.
In vitro genfindelse for glucose, lactat, acetylcholin og ATP er cirka 20%, dvs. for alle testede lille molekylvægt stoffer, in vitro opsving er næsten ens. Åbenbart, i det nedre område (op til 500 Da), molekylvægten ikke har større indvirkning på in vitro recovery rate. Molekylvægten afskæring på 30 kDa også muligt at dialysere neuropeptider. På grund af den højere molekylvægt af neuropeptider, in vitro recovery værdi er lavere. Substans P (1.348 Da) og somatostatin (1.638 Da) kan dialyseres i samme omfang med in vitro recovery værdier på 2-3%. Selvom begge peptider har en masseskift på ca. 300 Da, vitro tilbagebetalinger forblive i samme. Både subststemmelse P og somatostatin er positivt ladede i vandig opløsning og kan udvise lignende fysisk-kemiske egenskaber. Angiotensin II med en molekylvægt på 1.046 Da afslører en høj in vitro recovery op til 6%, hvilket er tre gange større end med de to andre neuropeptider. Derfor molekylvægte over 500 Da klart påvirker in vitro opsving, selv om når stofferne bliver opkrævet neutral i vandig opløsning. I dette tilfælde er den in vitro nyttiggørelse ikke påvirket af ladningen af dialyserede stoffer. Dog med anvendelse af andre membranmaterialer, genfindelse af ladede forbindelser kan påvirkes 8.
Afslutningsvis, samling af et skræddersyet mikrodialysesonde er et acceptabelt alternativ til kommercielle prober. Vores self-made sonder er robuste, har høj pålidelighed og god reproducerbarhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H.
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C.
- Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Neurochem, J.
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
