Summary
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono in gran demand.In questo lavoro un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10.
Abstract
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono molto richiesti per monitorare i cambiamenti fisiologici, farmacologici e patologici nel liquido cerebrospinale. Purtroppo, le sonde commerciali sono costosi per i gruppi di ricerca nelle istituzioni pubbliche. In questo lavoro, un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10. La sonda microdialisi costituito da una membrana in polisulfone con un cut-off molecolare di 30 kDa. Sonda in vitro recuperi di sostanze aventi diverso peso molecolare (nell'intervallo 100-1,600 Da) e diverse proprietà fisico-chimiche sono confrontati. La sonda produce un recupero in vitro di circa il 20% per il piccoli composti glucosio, lattato, acetilcolina e ATP. In vitro recuperi per neuropeptidi con un peso molecolare tra 1.000-1.600 Da pari a 2-6%. Così, mentre il w molecolare superioreotto dei neuropeptidi abbassato in valori di recupero vitro, la dialisi di composti nell'intervallo inferiore (fino a 500 Da) di pesi molecolari non ha grande impatto sul tasso di recupero in vitro. Il presente metodo permette l'utilizzo di una membrana di dialisi con un altro valore di cut-off e materiale della membrana. Pertanto, questo gruppo sonda misura ha il vantaggio di flessibilità sufficiente per dializza sostanze in un ampio intervallo di peso molecolare. Qui, si introduce una sonda microdialisi con una lunghezza scambio di 2 mm, che è applicabile per microdialisi in topo e ratto regioni del cervello. Tuttavia, le dimensioni della sonda possono essere facilmente adattati per lunghezze di cambio più grandi per essere utilizzato in animali più grandi.
Introduction
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Nel corso degli ultimi 50 anni, la tecnica della microdialisi minimal-invasiva è stato continuamente migliorato per diventare un metodo consolidato per monitorare le concentrazioni locali di piccole composti con peso molecolare nello spazio extracellulare. Quasi ogni fluido tessuto interstiziale può essere indagato in animali liberi di muoversi.
Gaddum introdotto la tecnica push-pull nel 1960. Ha modificato un approccio da Feldberg et al. In cui tubocurarina stato perfuso attraverso una cannula che termina nel ventricolo laterale e raccolta dell'effluente anche tramite una cannula 1. Gaddum sviluppato la tecnica push-pull in cui una cannula costituito da due aghi acciaio concentrici stato impiantato in aree cerebrali distinte e perfuso con una soluzione contemporaneamente rimuovendo i neurotrasmettitori rilasciati dai neuroni circostanti la punta 2. Purtroppo, dama tessutoge causata dalla cannula attorno alla punta limitato l'applicazione di questo metodo. Come ulteriore avanzamento di questo metodo, Bito e collaboratori hanno introdotto un metodo del sacchetto di dialisi in cui la soluzione raccolta è stato separato dal tessuto circostante da una membrana di dialisi. Hanno impiantato una sacca di dialisi nel tessuto sottocutaneo del collo del cane. Il contenuto del sacchetto dialisi è privo di proteine e può essere analizzato molte settimane più tardi per ioni e aminoacidi 3. Lo sviluppo successivo è stato il dialytrode, una sonda microdialisi primitivo, che in origine era descritto da Delgado nel 1972 4. Infine, Ungerstedt e colleghi hanno migliorato il design della sonda di microdialisi in modo che fosse più piccolo e spostato meno tessuto 5.
Una sonda microdialisi concentrica comporta in modo simile ad un capillare di sangue. Il sistema è costantemente perfuso con una soluzione con la composizione ionica del fluido tessuto circostante mentre manca l'analita di interesse. Thmembrane di dialisi e esposto alla soluzione o tessuto esterno è semi-permeabile. Permette diffusione passiva di sostanze nella sonda lungo il loro gradiente di concentrazione 6. La permeabilità dipende da molte variabili quali il peso molecolare, la forma, carica e pH del composto. Esso è anche limitata a causa delle proprietà del materiale della membrana, dimensioni dei pori della membrana e della portata 7.
Le figure 1 e 2 mostrano una sonda microdialisi concentrica. Il liquido di perfusione entra attraverso un tubo di ingresso nel manicotto metallico, che circonda la silice fusa. All'interno del manicotto metallico, esso flussi giù lungo la silice fusa e lascia sulla sua punta. Nello spazio tra la membrana di dialisi e il politetrafluoroetilene (PTFE) -tubing (come Teflon) il liquido di perfusione fluisce poi verso l'alto. Qui, la diffusione di sostanze dal tessuto si verifica che circondano la membrana. Il dializzato lascia la sonda attraverso il PTFE-tubo, che è collegato alla presa tubo e possono essere raccolti.
La microdialisi ha diversi vantaggi relativi ad altre tecniche in vivo. La sonda costituisce una barriera fisica con la conseguenza che il dializzato contiene enzimi o cellule. Pertanto, non vi è alcuna necessità di purificazione del eluato prima dell'analisi, e nessuna degradazione enzimatica di analiti avviene. Degradazione ossidativa può verificarsi durante il passaggio di analiti nel tubo, ma questo spesso può essere prevenuta con l'aggiunta di un antiossidante (ad esempio acido ascorbico) al perfusato. In alternativa, il danno ossidativo ai neuropeptidi, per esempio, è stato efficacemente soppressa sostituendo il tubo di uscita con una punta per raccogliere il dializzato 8. Il dializzato può essere indagato direttamente con quasi ogni tipo di metodo analitico e più analiti possono essere raccolti simultaneamente. Questo sistema può essere utilizzato in animali svegli, e quasi tutte le regioni del cervello può essereesaminato. Inoltre, l'infusione di farmaci attraverso la sonda è possibile (retrodialysis). Tuttavia, ci sono anche limiti della tecnica microdialisi. La risoluzione temporale un po 'bassa non fornisce informazioni in tempo reale per quanto riguarda i cambiamenti di neurotrasmettitori. Poiché si tratta di una tecnica invasiva, sonda impianto provoca trauma chirurgico e l'anestesia, che può influenzare le concentrazioni di neurotrasmettitori, è necessario in questa fase 7,9,10.
La concentrazione del composto nel dializzato comprende soltanto una piccola quantità di concentrazione del composto effettiva nel fluido extracellulare. Per il calcolo della concentrazione composto sconosciuto nel fluido extracellulare, relativa ripresa in vitro deve essere calcolato. Determinazione dei singoli relativa recuperi vitro per ogni sonda e ogni composto è necessaria prima di iniziare l'esperimento in vivo. A questo scopo, la sonda è immersa in una soluzione contenente ilanalita di interesse, mentre il liquido di perfusione è la stessa soluzione manca l'analita di interesse. Dopo la determinazione delle concentrazioni di composti nel dializzato, questi dati va riferito alla loro concentrazione nel fluido circostante. In vitro determinazioni del recupero di diverse sostanze possono essere implementate contemporaneamente 9.
Molti gruppi di ricerca delle neuroscienze utilizzano la tecnica della microdialisi di indagare neurotrasmettitori e metaboliti nello spazio extracellulare delle aree cerebrali distinte. Pertanto, le sonde commerciali sono molto richiesti nell'ambiente della ricerca neuroscientifica. Un grande vantaggio di sonde disponibili in commercio è l'elevata affidabilità funzionale. Il set-up sperimentale per sonde commerciali è ben consolidata e convalidato per molti neurotrasmettitori e metaboliti noti. Tuttavia, mentre l'apparecchiatura microdialisi in commercio è costoso e ha meno flessibilità di applicazione 11, in thè lavorare un gruppo sonda microdialisi è presentato in dettaglio, che può essere adattato a qualsiasi applicazione e può essere prodotto per meno di $ 10. Questa sonda misura è una sonda microdialisi concentrica testato per le indagini in diverse aree cerebrali 8.
In recuperi sonda vitro di sostanze a diverso peso molecolare (gamma di 100-1,600 Da) e sono confrontati con differenti proprietà chimico-fisiche. In vitro determinazione del recupero del glucosio, lattato e acetilcolina con un peso molecolare inferiore a 200 Da, ATP con un peso molecolare del viene eseguita a circa 500 Da e neuropeptidi angiotensina II, sostanza P e somatostatina con un peso molecolare sopra 1.000 Da.
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Protocol
1. Preparazione PTFE-tubing
- Accorciare PTFE tubo nel 2,5 centimetri pezzo. Utilizzare una carta scala per stimare le dimensioni fisiche. (Si veda la Figura 3a)
- Tagliare una desinenza ad angolo per facilitare il collegamento del tubo di uscita. (Si veda la Figura 3a)
- Irruvidire PTFE-tubi mediante l'uso di carta vetrata per consentire aderente della colla epossidica.
2. Preparazione silice fusa
- Accorciare silice fusa in 2,25 centimetri pezzo. (Si veda la Figura 3a)
3. Inserimento della silice fusa in PTFE-tubing
- Inserire una cannula di G 30 nella fibra PTFE cava perforarlo ad una distanza di 1 cm dall'estremità piatta. Piegare il PTFE-tubo per semplificare il processo. (Vedi figura 3 b)
- Inserire la silice fusa in PTFE tubo con la cannula come guida. (Vedi figura 3c)
- Rimuovere delicatamente la cannula e fissare la silice fusa. (VediFigura 3d)
- La silice fusa dovrebbe Progetto 5 mm all'estremità piatta. (Vedi figura 3e)
- Incollare la silice fusa in luogo nella sede della puntura da colla cianoacrilato e farlo indurire durante la notte. (Vedi figura 3e)
4. Preparare Epoxy Glue (due componenti Colla)
- Aggiungere 30 parti di indurente giallo al 70 parti di colla epossidica nera con l'aiuto di un ago sottile e mescolare delicatamente. È direttamente pronto all'uso.
5. Applicazione della membrana (gli ulteriori passi sono svolte sotto il microscopio e un Libro Scale viene utilizzato per stimare Dimensioni fisiche)
- Estrarre la membrana polisulfone attentamente sopra la silice fusa, poi tirare la membrana in PTFE tubo e regolare la membrana a 5,5 mm, utilizzando un bisturi affilato. (Vedi figura 3 septies)
- Impostare un punto di contrassegno sulla membrana con una penna fine di definire la lunghezza scambio di 2 mmdalla fine della membrana.
- Applicare una piccola quantità di colla epossidica a coprire la punta della membrana con l'aiuto di un ago sottile. (Vedi figura 3g)
- Chiudere il giunto tra la membrana di dialisi e fibra PTFE con l'aiuto dello stesso ago sottile utilizzato nel passaggio 5.3) con la colla epossidica. (Vedi figura 3g)
- Aggiungere colla epossidica sufficiente sulla membrana fino al punto di marcatura per garantire una durata scambio di 2 mm. Permettono di indurire durante la notte. (Vedi figura 3g) prima della determinazione della lunghezza di cambio, la membrana è di 5,5 mm. Dopo aver applicato la colla epossidica sulla membrana, 2 mm della membrana è disponibile per la diffusione.
6. Applicare il manicotto di metallo
- Tagliare un ago da 25 G in 1 centimetro pezzi manica di metallo con l'aiuto di una pinza di piegatura.
- Estrarre il manicotto metallico da 1 cm (25 G) sulla parte restante della silice fusa. Il manicotto metallico consente successivamente il collegamento del tubo di ingresso con il MicrodiaSonda lisi. (Vedi figura 3h)
- Sigillare giunzione tra manicotto metallico e PTFE tubo con la colla epossidica rimanente. Lasciare indurire per almeno 24 ore. (Vedi figura 3i)
- L'applicazione di colla a caldo intorno alla biforcazione della sonda per la fissazione e la stabilizzazione supplementare.
NOTA: Il volume interno ingresso della sonda è 0.045 ml e il volume interno della presa è 2,5 microlitri. Pertanto, con una portata di 1 ml / min, ci vogliono circa 2,5 min dopo aver collegato il tubo di ingresso per iniziare la raccolta del dializzato. Con il presente protocollo, la procedura di montaggio della sonda produce sonde microdialisi che sono il 95% affidabile.
7. Prestazioni di esperimenti in vitro di recupero
- Immergere la sonda con un cut-off di 30 kDa e una lunghezza scambio di 2 mm in una soluzione madre composto aCSF contenenti glucosio 1 mM e 1 mM di lattato e, in un esperimento separato, in un CSF contenente 100ATP nM e 100 nM acetilcolina.
- Profumato le sonde con aCSF. Impostare portata di 1 ml / min e realizzare esperimenti a temperatura ambiente (22 ° C). Lasciare le sonde per equilibrare per 1 ora nella soluzione di riserva, e raccogliere i campioni ogni 30 minuti dopo e conservare a -80 ° C fino a quando la misura.
- Per il calcolo dei recuperi in vitro, confrontare le concentrazioni di analiti nel dializzato con concentrazioni note di analita nella soluzione madre. Esprimere i risultati come percentuali di concentrazione della sostanza in dializzato vs soluzione madre.
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Representative Results
La sonda microdialisi misura concentrica costituito da una membrana in polisulfone con un cut-off molecolare di 30 kDa. Il gruppo sonda è illustrato nella figura 3.
E 'mostrato un recupero in vitro per la metaboliti piccola energia glucosio (180.16 Da) e lattato (112.06 Da) di 19.10 ± 1,2% e 21,2 ± 1,6%, rispettivamente. Per acetilcolina carica positiva con un peso molecolare di 181.66 Da, ha mostrato un valore di recupero in vitro di 22,6 ± 1,4%. ATP con un peso molecolare di 551,62 Da e tre residui fosfato carica negativa ha un recupero in vitro in misura paragonabile (22,4 ± 0,7%). In vitro recuperi di piccole molecole sono mostrati nella Figura 4A.
Neuropeptidi con peso molecolare sopra 1.000 Da mostrato inferiore recuperi vitro rispetto alle molecole più piccole (<500 Da) (vedi Fi figura 4B). Tra i neuropeptidi testati, l'angiotensina II (1,046.18 Da) è il più piccolo peptide con 8 aminoacidi. È mostrato un recupero in vitro di 6,1 ± 0,3%. Il 11 amino sostanza residuo di acido P (1,347.63 Da) e la somatostatina 14 di acido ammino (1,637.88 Da) mostravano approssimativamente uguale in valori di recupero vitro di 2,2 ± 0,3% e 2,3 ± 0,1%, rispettivamente. In vitro recuperi della nostra sonda 30 kDa sono paragonabile a recuperi in vitro di sonde da microdialisi in commercio (CMA microdialisi, Stoccolma, Svezia), ad es. lattato 23% e 13% glucosio (vedi applicazione nota n. 1)
Figura 1: Fotografia di una sonda su misura.
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Figura 2: immagine schematica di una sonda da microdialisi (Ristampato da Lietsche et al, 2014, con il permesso di Elsevier.).
Figura 3: Immagine schematica di un gruppo sonda; passo ai di per dettagli vedere il protocollo (Ristampato da Lietsche et al., 2014, con il permesso di ELSEVIER).
Figura 4: Recuperi di piccole molecole e neuropeptidi (A) recuperi in vitro di glucosio, lattato, acetilcolina e ATP.. La soluzione madre conteneva 1 mM di glucosio e lattato e, in subordine, 100 Nm e 100 ATP acetilcolina nM per ogni condizione sperimentale. I risultati sono espressi come percentuale di sostanza concentration in dializzato / soluzione madre. Valori di sostanze di prova sono medie ± SD di n = 22 per il glucosio, n = 22 per lattato, n = 11 per acetilcolina e n = 13 per ATP. (B) nei recuperi in vitro della neuropeptidi angiotensina II, sostanza P e la somatostatina. La soluzione madre conteneva 100 nM angiotensina II, sostanza P e la somatostatina per ogni condizione sperimentale. I risultati sono espressi come percentuale di concentrazione di sostanza in dializzato / soluzione madre. I valori di colonne sono medie ± SD di n = 6 per ogni sonda.
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Discussion
La Figura 3 mostra un gruppo sonda esemplare. Correggere le dimensioni interne ed esterne di diametro devono essere strettamente monitorati per tubo (OD 1,6 millimetri; ID 350 micron), silice fusa (OD 105 micron; ID 40 micron) e la membrana di dialisi (OD 245 micron; ID 210 micron). E 'anche importante mantenere uno spazio tra la membrana e silice fusa (105 micron) e tra la membrana e il tubo (105 micron) pure. Se i valori differiscono, la pressione nella sonda può salire e causare perdite della membrana.
Qui introduciamo una sonda microdialisi con una lunghezza scambio di 2 mm, che è applicabile per microdialisi nelle regioni del cervello del mouse. Tuttavia, le dimensioni possono essere facilmente adattati per lunghezze di cambio più grandi per essere utilizzato in animali più grandi.
Alcune parti del complesso possono essere sostituiti. Ad esempio, non è necessario utilizzare PTFE-tubing. Applicazione del tubo di polietilene è possibile anche con identici esterno e inner quote diametro. Irruvidire la tubazione è necessario solo quando si utilizza un PTFE tubo. La sostituzione della membrana di dialisi è anche possibile. Per la presente gruppo sonda, viene utilizzata una membrana cut-off 30 kDa, ma qualsiasi altra membrana di dialisi può essere utilizzato con dimensioni identiche. Pertanto, il nostro gruppo sonda misura ha il vantaggio di una grande flessibilità per dializza sostanze con un ampio intervallo di peso molecolare; maggiore è il peso molecolare di cut-off, maggiore è il peso molecolare della sostanza, che può essere dializzato. recuperi In vitro solito aumenta con il peso molecolare di cut-off della membrana di dialisi.
Per coprire la punta della membrana, colla epossidica è necessario per chiudere la giunzione tra membrana di dialisi e PTFE tubo e per determinare la lunghezza di cambio. Applicando l'adesivo cianoacrilato non è possibile in questa fase, perché colpisce la membrana di dialisi e porta a perdite. Un adesivo cianoacrilato per incollare plastic deve essere applicato per la fissazione di silice fusa con il tubo in atto presso il sito di puntura.
Va notato che questo disegno sonda non è stato testato con cannule guida. Il nostro laboratorio preferisce impiantare sonde basso diametro per esperimenti acuti in cui abbiamo 48-72 ore di tempo sperimentale prima della astrogliosis provoca il malfunzionamento della sonda. Per questo tipo di esperimento, una cannula guida non offre un vantaggio perché cannule di guida sono più grandi e causano più danni ai tessuti. Inoltre, anche con una cannula guida in posizione, la sonda deve sempre essere inserito nel tessuto cerebrale sano, causando danni acuta nella zona della dialisi. Inserimento e la rimozione della sonda attraverso cannule guida ripetuta provoca danni ripetuto, una situazione che viene evitata una volta, cioè inserimento acuta. La barriera ematoencefalica è rivelata intatte poche ore dopo l'impianto 12. Cannule Guida sono preferibili, tuttavia, quando le misure seriali have di essere fatto per diversi giorni o settimane. Infine, anestetici volatili dovrebbero essere utilizzati per la sonda impianto perché farmaci anestetici iniettabili interferiscono con gli esperimenti successivi per 1-2 giorni.
In recuperi in vitro per il glucosio, lattato, l'acetilcolina e ATP sono circa il 20%, vale a dire per tutti testati piccole sostanze peso molecolare, il recupero in vitro è quasi uguale. Evidentemente, nel campo inferiore (fino a 500 Da), il peso molecolare ha un grande impatto sul tasso di recupero in vitro. Il peso molecolare di cut-off di 30 kDa consente anche dializza neuropeptidi. A causa del peso molecolare più elevato dei neuropeptidi, il valore di recupero in vitro è inferiore. Sostanza P (1.348 Da) e la somatostatina (1.638 Da) possono essere dializzati nella stessa misura con valori di recupero in vitro di 2-3%. Sebbene entrambi i peptidi hanno uno spostamento di massa di circa 300 Da, nei recuperi vitro rimanere lo stesso. Entrambi substANCE P e somatostatina sono positivamente pagano in soluzione acquosa e possono esibire simili proprietà fisico-chimiche. L'angiotensina II con un peso molecolare di 1.046 Da rivela un elevato recupero in vitro fino al 6%, che è tre volte più grande rispetto agli altri due neuropeptidi. Quindi, pesi molecolari sopra 500 Da influenzano chiaramente la ripresa in vitro, anche se quando le sostanze pagano neutro in soluzione acquosa. In questo caso, il recupero in vitro non è influenzato dalla carica delle sostanze in dialisi. Tuttavia, con l'impiego di altri materiali di membrana, recuperi di composti cariche possono essere influenzati 8.
In conclusione, il montaggio di una sonda microdialisi misura è un'alternativa accettabile per sonde commerciali. Le nostre sonde self-made sono robusti, hanno alta affidabilità e buona riproducibilità.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H.
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C.
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- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
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