Summary
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。したがって、商業的プローブは素晴らしいdemand.Inにプローブアセンブリは、10ドル未満のために信頼性の高い、同心、カスタムメイドの微小透析プローブを構築するために詳細に説明されているこの作品です。
Abstract
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。したがって、商業的プローブは、脳脊髄液中の、生理的薬理学的および病理学的変化を監視するための大きな需要があります。残念ながら、商業的プローブは、公的機関の研究グループのために高価です。本研究では、プローブアセンブリは、10ドル未満のために信頼性の高い、同心、カスタムメイドの微小透析プローブを構築するために詳細に説明します。微小透析プローブは、30kDaの分子カットオフを有するポリスルホン膜で構成されています。プローブは、in vitro（100-1,600ダの範囲内の）異なる分子量、異なる物理化学的特性を有する物質の回収率が比較されています 。プローブは、低分子化合物のグルコース、乳酸塩、アセチルコリンおよびATPのための約20％のin vitroでの回復をもたらす。2〜6％に1,000-1,600ダ量との間の分子量を有する神経ペプチドのためのin vitroでの回収率。したがって、より高い分子W一方神経ペプチドの8がインビトロ回復値が低下し、分子量の低い範囲（最大500ダ）中の化合物の透析は、in vitroでの回収率には大きな影響を与えません。本発明の方法は、他のカットオフ値と膜材料と透析膜の使用を可能にします。したがって、このカスタムメイドのプローブアセンブリは、広い分子量範囲の物質を透析するのに十分な柔軟性の利点を有します。ここでは、マウスとラットの脳領域における微小透析に適用可能である2mmの交換長と微小透析プローブをご紹介します。しかし、プローブの寸法は簡単に、より大きな動物で使用する大きな交換長さに適合させることができます。
Introduction
微小透析は、神経科学の研究で一般的に使用される技術です。過去50年の間に、最小限の侵襲微小透析技術は、継続的に細胞外空間に低分子量化合物の局所濃度を監視するための十分に確立された方法になるように改善されました。ほぼすべての間質組織液が自由に動く動物で調べることができます。
Gaddumは、1960年代にプッシュプル法を導入しました。彼はフェルトベルグらからのアプローチを変更しました。ツボクラリンは側脳室で終わるカニューレを通して灌流カニューレ1を介して、また流出物を収集しました。 Gaddumは、2つの同心のスチール針からなるカニューレは別個の脳領域に移植し、同時にチップ2の周囲のニューロンから放出神経伝達物質を除去しながら液で灌流されたプッシュプル法を開発しました。残念ながら、組織DAMA先端の周りにカニューレによって引き起こさGEは、この方法の適用を制限しました。この方法のさらなる前進として、尾藤と共同研究者は、収集した溶液を透析膜によって周囲の組織から分離された透析バッグ法を導入しました。彼らは犬の首の皮下組織に透析嚢を移植しました。透析袋の内容は、無タンパク質であり、イオンおよびアミノ酸のための多くの3週間後に分析することができました。次の開発は、もともと1972年4デルガドによって記述された原始的な微小透析プローブ、dialytrodeだった。それは小さく、あまり組織5を変位となるように最後に、Ungerstedtらは微小透析プローブの設計を改善しました。
同心の微小透析プローブは、毛細血管と同じように動作します。システムは常に関心のある検体を欠くながら周囲の組織液のイオン組成をフィーチャー液で灌流されます。目外液または組織にさらされる電子の透析膜は半透過性です。それは、その濃度勾配6に沿ってプローブ内の物質の受動拡散を可能にします。透過性は、そのような化合物の分子量、形状、電荷およびpHなどの多くの変数に依存しています。また、膜材料、膜および流量7の孔サイズの特性に限定されます。
図1及び図2は、同心円状微小透析プローブを示します。灌流液は、溶融シリカを囲む金属スリーブ、への入口管を介して入ります。金属スリーブの内部では、溶融シリカに沿って下方に流れ、その先端にそれを残します。透析膜とポリテトラフルオロエチレン（PTFE）（例えばテフロンなど）-tubingとの間の空間に、灌流液は、その後、上方へ流れます。ここでは、組織からの物質の拡散は、膜を包囲するが発生します。透析液は、PTFを介してプローブを残しますチューブをコンセントに接続されており、回収することができるE-チューブ。
微小透析法は、 インビボ法の他に比べていくつかの利点を有します。プローブは透析液には酵素または細胞を含まない結果に物理的障壁を構成しています。したがって、そこに分析の前に溶出液の精製の必要がなく、分析物のない酵素分解は起こりません。酸化劣化は、チューブ中の分析物の通過の間に発生することができ、これは、多くの場合、灌流液に酸化防止剤（ 例えばアスコルビン酸）を添加することによって防止することができます。代替的に、神経ペプチドの酸化的損傷は、例えば、効率透析液8を収集するために先端で出口チューブを交換することによって抑制されました。透析液は、分析方法のほぼすべての種類を直接調査することができ、複数の分析物を同時に収集することができます。このシステムは、覚醒動物において使用することができ、ほぼすべての脳領域であることができます検討しました。また、プローブを通る薬剤の注入は（retrodialysis）が可能です。しかし、微小透析技術の限界もあります。やや低時間分解能は、神経伝達物質の変化に関するリアルタイムの情報を提供していません。それは、侵襲的技術であるため、プローブの移植は、外科的外傷および麻酔を引き起こす、神経伝達物質の濃度に影響を与えることができ、このステップ7,9,10の間に必要とされます。
透析液中の化合物濃度は、細胞外液中の実際の化合物の濃度のわずかな量を含みます。細胞外液中の未知の化合物濃度を計算するため、相対的なインビトロ回復を計算しなければなりません。個々のすべてのプローブのためのin vitroでの回収率の相対的な、すべての化合物の決意は、in vivoでの実験を開始する前に必要です。この目的のために、プローブを含有する溶液に浸漬します灌流液に対し、目的の分析物は、目的の分析物を欠く同じソリューションです。透析液中の化合物濃度を決意した後、このデータは、周囲の流体中のそれらの濃度に言及する必要がある。いくつかの物質のインビトロ回復測定を同時に実施することができる9。
多くの神経科学の研究グループは、異なる脳領域の細胞外空間内の神経伝達物質および代謝物を調査するために微小透析技術を使用しています。したがって、商業プローブが神経科学の研究環境に大きな需要があります。市販されているプローブの大きな利点は、高い機能性、信頼性です。商業プローブの実験設定は十分に確立されており、多くのよく知られた神経伝達物質および代謝物のために検証されます。しかし、市販の微小透析装置は高価であり、目に、アプリケーション11が少ない柔軟性を有するのに対し任意のアプリケーションに適合させることができ、10ドル未満のために製造することができる、微小透析プローブアセンブリが詳細に示されている作業です。このカスタムメイドのプローブは、様々な脳領域8内の調査のために試験同心微小透析プローブです。
異なる分子量（100-1,600ダの範囲）で、異なる物理化学的特性を比較すると物質のin vitro でのプローブの回収では 、分子量と分子量のグルコース、乳酸およびアセチルコリンのインビトロ回復決意200Da未満、ATP約500ダおよび神経ペプチドのアンジオテンシンII、千ダ上記分子量のサブスタンスPおよびソマトスタチンが行われます。
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Protocol
1.準備PTFE、チューブ
- 2.5センチメートル片をPTFE-チューブを短くしてください。物理的寸法を推定するために、スケールの用紙を使用します。 （ 図3aを参照）
- 出口チューブの接続を容易にする角度で1エンディングをカットします。 （ 図3aを参照）
- サンドペーパーの使用によるラフPTFE-チューブはエポキシ接着剤の付着を可能にします。
溶融シリカの準備2.
- 2.25センチメートル片に溶融シリカを短くしてください。 （ 図3aを参照）
3. PTFE-チューブ内にフューズドシリカを挿入
- 平らな端1センチの距離でそれを貫通する中空のPTFE繊維に30 Gカニューレを挿入します。プロセスを簡略化するPTFE-チューブを曲げます。 （ 図3bを参照してください）
- ガイダンスとして、カニューレを使用して、PTFE、チューブに溶融シリカを挿入します。 （ 図3cを参照してください）
- ゆっくりカニューレを除去し、溶融シリカを固定します。 （参照してください。図3d）
- 溶融シリカは、平坦な端で5ミリメートル突出するようになっています。 （ 図3Eを参照してください）
- シアノアクリレート接着剤により、穿刺部位での代わりに溶融シリカを接着して、一晩硬化することができます。 （ 図3Eを参照してください）
4.準備エポキシ接着剤（二成分接着剤）
- 微細針の助けによってブラックエポキシ接着剤70部に黄色の硬化剤30部を加え、穏やかに混ぜます。これは、直接使用できるようになりました。
5.膜を適用する（すべてのさらなる工程は、顕微鏡下で行われなければならないとスケール紙は外形寸法を推定するために使用されます）
- PTFE-チューブ内に膜を引っ張り、鋭いメスを用いて5.5ミリメートルに膜を調整し、その後、溶融シリカの上に慎重にポリスルホン膜を引き出します。 （ 図3Fを参照してください）
- 2mmの交換長さを定義するために細かいペンで膜上のマーキングポイントを設定します。膜の端から。
- 微細針の助けを借りて、膜の先端部を覆うようにエポキシ接着剤の少量を適用します。 （図3グラムを参照してください）
- エポキシ接着剤で）ステップ5.3で使用したのと同じ微細針の助けにより、透析膜とPTFE繊維との間の接合部を閉鎖。 （ 図3グラムを参照してください）
- 2mmの交換長さを確保するために、マーキングポイントまで膜に十分なエポキシ接着剤を追加します。それが一晩硬化することができます。交換長さの決意する前に（ 図3gを参照 ）、膜5.5 mmです。膜上にエポキシ接着剤を塗布した後、膜の唯一の2ミリメートルは、拡散のために利用可能です。
6.金属スリーブを適用します
- 曲げペンチの助けによって、1cmの金属スリーブ片に25 G針をカットします。
- 溶融シリカの残りの部分の上に1cmの金属スリーブ（25 G）を引き出します。金属スリーブは、後MICRODIA入口とチューブの接続を可能にします溶解プローブ。 （ 図3Hを参照してください）
- 残りのエポキシ接着剤で金属スリーブとPTFE-チューブとの間の接合部をシールします。それは、少なくとも24時間硬化することができます。 （ 図3Iを参照してください）
- 追加の固定および安定化のためのプローブの分岐部の周りにホットグルーを適用します。
注：プローブの入口内部容積は0.045μLと出口の内部容積は2.5μlです。したがって、1μL/分の流速で、それは、透析液の収集を開始するために導入管を接続した後、約2.5分を要します。本プロトコルでは、プローブの組み立て手順は、95％信頼性の高い微小透析プローブをもたらします。
インビトロ回復実験の7.パフォーマンス
- 100を含有CSFに、30kDaのカットオフおよびaCSFのが別々の実験で1 mMグルコースおよび1 mMの乳酸を含むからなる原液に2mmの交換長さのプローブを浸しnmのATPおよび100 nMのアセチルコリン。
- aCSFの有するプローブを灌流。 1μL/分に流量を設定し、室温（22℃）で実験を行います。プローブは原液で1時間平衡化させ、その後、サンプルを30分毎に収集し、測定まで-80℃で保存してください。
- in vitroでの回収率の計算のために、原液の既知の検体濃度と透析液中の分析物の濃度を比較します。原液対透析液中の物質濃度の割合として結果を表現します。
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Representative Results
同心のカスタムメイドの微小透析プローブは、30kDaの分子カットオフを有するポリスルホン膜で構成されています。プローブアセンブリは、 図3に示されています。
それは、それぞれ、19.10±1.2％および21.2±1.6％の小さなエネルギー代謝グルコース（180.16ダ）と乳酸（112.06ダ）のためのin vitroでの回復を示しました。ダ181.66の分子量を有する正に荷電したアセチルコリンのためには、22.6±1.4％のin vitroでの回復値を示しました。 551.62ダと3負に帯電したリン酸残基の分子量を有するATPは、同等程度（22.4±0.7％）にin vitroでの回復を示した。小分子のインビトロ回収率を図4（a）に示されています。
小さ な分子（<500 Da）でと比較した場合、千ダ上記分子量の神経ペプチドは、in vitro回収率が低いを示した（Fiを提供して参照してください。グレ4B）。試験された神経ペプチドの中では、アンジオテンシンII（1,046.18 DA）は8個のアミノ酸を有する最小のペプチドです。これは、6.1±0.3％ のインビトロ回復を示しました。 11アミノ酸残基のサブスタンスP（1,347.63ダ）と14アミノ酸ソマトスタチン（1,637.88 DA）は、それぞれ、2.2±0.3％と2.3±0.1％のインビトロ回収値にほぼ等しい示した。私達の30 kDaのプローブのインビトロ回収率は市販の微小透析プローブ（CMAマイクロダイアリシス、ストックホルム、スウェーデン）、 例えばのin vitroでの回収率に匹敵します。 23％乳酸と13％グルコース（アプリケーションはありません注意してくださいを参照してください。1）
図1：カスタムメイドプローブの写真。
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図2：（。ELSEVIERから許可を得てからLietsche ら 、2014、再版）微小透析プローブの概略イメージ。
図3：プローブアセンブリの概略画像。詳細は（ELSEVIERから許可を得てからLietsche ら 、2014、再版）プロトコルを参照するためのステップは、愛 。
図4：小分子および神経ペプチドの回収率（A）、グルコース、乳酸塩、アセチルコリンおよびATPのインビトロ回収。ストック溶液は、グルコースおよび乳酸塩の1mMから、あるいは、100nMのATP、各実験条件について100nMのアセチルコリンを含有していました。結果は、物質conceのパーセンテージとして表されます透析液/原液中ntration。試験物質の値は、ATPに対するアセチルコリンおよびn = 13用のn =グルコース22、N = 22乳酸のために、N = 11の平均±SDです。 （B）の神経ペプチドであるアンジオテンシンII、サブスタンスPおよびソマトスタチンのインビトロ回収。ストック溶液は、各実験条件について100nMのアンギオテンシンII、サブスタンスPおよびソマトスタチンを含有しました。結果は、透析液/保存溶液中の物質の濃度の百分率として表されます。列の値は、各プローブのためのn = 6の平均±SDです。
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Discussion
図3は、例示的なプローブアセンブリを示しています。正しい内側と外側の直径寸法は、密接にチューブのために観察されなければならない（OD 1.6ミリメートル、ID 350ミクロン）、溶融シリカ（OD 105ミクロン; ID 40ミクロン）と透析膜（OD 245ミクロン; ID 210ミクロン）。これは、膜および（105ミクロン）の溶融シリカとの間の空間を維持することも重要であると同様に（105ミクロン）の膜とチューブの間。値が異なる場合、プローブ内の圧力が上昇し、膜のリークにつながることができます。
ここでは、マウスの脳領域における微小透析に適用可能である2mmの交換長と微小透析プローブをご紹介します。ただし、寸法は簡単に、より大きな動物で使用するために、より大きな交換長さに適合させることができます。
アセンブリの一部を交換することができます。例えば、それは、PTFEチューブを使用する必要はありません。ポリエチレン管の適用は、同一の外側とインも可能です直径寸法えー。 PTFE-チューブを使用した場合、チューブの荒れが必要なだけです。透析膜の交換も可能です。本発明のプローブアセンブリーは、30kDaのカットオフ膜を用いているが、他の透析膜は、同一の寸法で使用することができます。したがって、私たちのカスタムメイドのプローブアセンブリは、広い分子量範囲を有する物質を透析するのに最適な柔軟性の利点を有します。透析することができる物質の分子量より高い分子量カットオフより高い。 インビトロ回収は、通常、透析膜の分子量カットオフの増加。
膜の先端部を覆うように、エポキシ接着剤は、透析膜およびPTFE、チューブ間の接合部を閉鎖し、交換長さを決定するために必要とされます。これは透析膜に影響を与え、漏れにつながるため、シアノアクリレート接着剤を適用すると、この段階では不可能です。 PLを接着するためのシアノアクリレート系接着剤asticは、穿刺部位の代わりにチューブで溶融シリカの固定のために適用されるべきです。
これは、このプローブ設計は、ガイドカニューレを使用してテストされていないことに留意すべきです。私たちの研究室では、アストログリオーシスは、プローブの誤作動の原因となる前に、我々は実験時間の48〜72時間を持っている急性の実験のための低直径プローブを注入することを好みます。この種の実験では、ガイドカニューレは、ガイドカニューレが大きいため、利点を提供し、より多くの組織の損傷を引き起こさありません。また、偶数場所にガイドカニューレと、プローブが常に透析の分野における急性損傷を引き起こし、健康な脳組織内に挿入されなければなりません。繰り返し挿入ガイドカニューレを介してプローブの除去、 すなわち急性挿入繰り返し損傷、ワンタイムによって回避される事態を引き起こします。血液脳関門は、移植後12インタクト数時間であることが示されました。ガイドカニューレが好ましく、しかし、一連の測定さhaveが、数日または数週間にわたって行われます。注射用麻酔薬は1~2日間続く実験を妨害するため、最後に、揮発性麻酔薬は、プローブ移植のために使用されるべきです。
グルコース、乳酸塩、アセチルコリンおよびATPのためのインビトロでの回収率は全て、低分子量物質をテストするために、すなわち 、約20％であり、in vitroでの回復は、ほぼ同じです。明らかに、低い範囲（最大500ダ）で、分子量は、in vitro回収率には大きな影響を与えません。 30kDaの分子量カットオフはまた、神経ペプチドを透析することができます。これにより神経ペプチドのより高い分子量のために、in vitroでの回復値は低くなります。サブスタンスP（1348ダ）およびソマトスタチン（1,638ダ）は2〜3％のin vitroでの回復値と同程度に透析することができます。両ペプチドは、約300ダの質量シフトを有するが、in vitroでの回収率は同じまま。両方SUBSTンスP及びソマトスタチンは、水溶液中で正に荷電され、類似の物理化学的特性を示すことができます。ダ1,046の分子量を有するアンジオテンシンIIは、他の2つの神経ペプチドに比べて3倍である6％ インビトロ回復まで、 で高を明らかにする。したがって、500ダ上記の分子量は、明らかに物質が水溶液中で中性に荷電された場合も、in vitroでの回復に影響を与えます。この場合には、in vitroでの回復は透析物質の電荷によって影響されません。しかし、他の膜材料を用いて、荷電した化合物の回収率は8に影響を受ける可能性があります。
結論として、カスタムメイドの微小透析プローブのアセンブリは、商業プローブへの受け入れ可能な代案です。私たちの自作プローブは、頑丈であり、高い信頼性と優れた再現性を持っています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
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