Summary
Mikrodialyse er en mye brukt teknikk i nevrovitenskap forskning. Derfor kommersielle prober er i stor demand.In dette arbeidet en sondeenhet blir forklart i detalj for å bygge en pålitelig og konsentrisk skreddersydd mikrodialyseprobe for mindre enn $ 10.
Abstract
Mikrodialyse er en mye brukt teknikk i nevrovitenskap forskning. Derfor kommersielle prober er svært etterspurt for å overvåke fysiologiske, farmakologiske og patologiske forandringer i spinalvæsken. Dessverre, kommersielle prober er dyrt for forskningsmiljøer i offentlige institusjoner. I dette arbeidet, er en sonde montering forklart i detalj for å bygge en pålitelig, konsentrisk, skreddersydde mikrodialyseproben for mindre enn $ 10. Mikrodialyseproben består av en polysulfonmembran med en molekylær cut-off på 30 kDa. Probe in vitro inngang av stoffer med forskjellig molekylvekt (i området fra 100-1,600 Da) og ulike fysiokjemiske egenskaper er sammenlignet. Sonden gir en in vitro utvinning av omtrent 20% for små bestanddeler glukose, laktat, acetylkolin og ATP. In vitro-inngang for nevropeptider med en molekylvekt mellom 1,000-1,600 Da utgjør 2-6%. Således, mens høyere molekyl wåtte av de nevropeptider senket in vitro-gjenvinnings-verdier, dialyse av forbindelser som i det nedre område (opptil 500 Da) av molekylvekter ikke har noen stor innvirkning på in vitro utvinningsgrad. Den foreliggende fremgangsmåte muliggjør anvendelse av en dialysemembran med andre cut-off-verdi og membranmaterialet. Derfor har denne skreddersydde probe montering fordelen av tilstrekkelig fleksibilitet til dialyser stoffer i et bredt molekylvekt i området. Her introduserer vi en mikrodialyseproben med en utveksling lengde på 2 mm, som er aktuelt for mikrodialyse i muse- og rottehjerneregioner. Imidlertid kan dimensjonene til sonden lett tilpasses for større utvekslingslengder som skal anvendes i større dyr.
Introduction
Mikrodialyse er en mye brukt teknikk i nevrovitenskap forskning. I løpet av de siste 50 årene har minimal-invasiv mikrodialyse teknikken blitt kontinuerlig forbedret for å bli en veletablert metode for å overvåke lokale konsentrasjoner av små molekylære forbindelser i det ekstracellulære rom. Nesten hver interstitiell vev væske kan undersøkes i fritt bevegelige dyr.
Gaddum introduserte push-pull teknikk i 1960. Han modifiserte en tilnærming fra Feldberg et al., Hvor tubokurarin ble perfusert gjennom en kanyle som ender i den laterale ventrikkel og oppsamling av avløpet også via en kanyle 1. Gaddum utviklet push-pull-teknikk hvor en kanyle bestående av to konsentriske stålkanyler ble implantert i forskjellige områder av hjernen og perfusert med en løsning under samtidig fjerning av nevrotransmittere som frigjøres fra nerveceller som omgir spissen 2. Dessverre, vev damage forårsaket av kanylen rundt tuppen begrenset anvendelsen av denne metoden. Som en videre utvikling av denne fremgangsmåte, Bito og medarbeidere innført en dialysepose fremgangsmåte hvor den oppsamlede løsningen ble separert fra det omgivende vev av en dialysemembran. De implantert en dialyse sac i subkutant vev av hunden halser. Innholdet av dialyseposen er proteinfritt og kunne analyseres mange uker senere for ioner og aminosyrer tre. Den neste utvikling var dialytrode, en primitiv mikrodialyseproben, som opprinnelig ble beskrevet av Delgado i 1972 4. Endelig Ungerstedt og kolleger forbedret design av mikrodialyseproben slik at det var mindre og fortrengt mindre vev 5.
En konsentrisk mikrodialyseprobe oppfører seg på samme måte som en blodkapillært. Systemet er konstant perfusert med en løsning med den ioniske sammensetning av det omgivende vev væske mens mangler analytten av interesse. The dialysemembran utsettes for eksterne løsningen eller vev er semi-permeable. Det tillater passiv diffusjon av stoffer inn i sonden langs sin konsentrasjonsgradient 6. Permeabiliteten er avhengig av mange variabler slik som molekylvekt, form, ladning og pH av forbindelsen. Det er også begrenset på grunn av egenskapene til membranmaterialet er porestørrelsen i membranen og strømningsrate 7.
Figurene 1 og 2 viser en konsentrisk mikrodialyseprobe. Perfusjon fluid kommer inn via en innløpsrøret inn i metallhylse, som omgir smeltet silisiumdioksid. Inne i metallhylse, bekker det ned langs smeltet silisiumdioksid og etterlater det på spissen. I rommet mellom dialysemembranen og polytetrafluoretylen (PTFE) -tubing (slik som Teflon) i perfusjonsvæsken strømmer deretter oppover. Her skjer diffusjon av stoffer fra vev som omgir membranen. Dialysatet forlater sonde gjennom PTFE-rør, som er forbundet til utløpet rør og kan samles opp.
Mikrodialyseteknikken har flere fordeler i forhold til andre in vivo-teknikker. Sonden utgjør en fysisk barriere med det resultat at dialysatet ikke inneholder enzymer eller celler. Derfor er det ikke behov for rensing av eluatet før analysen, og ingen enzymatisk nedbrytning av analytter finner sted. Oksidativ nedbrytning kan forekomme under passasje av analytter i røret, men dette kan ofte forebygges ved å tilsette en antioksidant (for eksempel askorbinsyre) til perfusatet. Alternativt oksidativ skade på nevropeptider, for eksempel, ble effektivt undertrykt ved å erstatte utløpsrøret med en spiss for å samle dialysatet 8. Dialysatet kan undersøkes direkte med nesten alle slags analysemetode og flere analytter kan samles samtidig. Dette systemet kan brukes i våken dyr, og nesten alle områder av hjernen kan væreundersøkt. Videre er infusjon av medikamenter gjennom sonden mulig (retrodialysis). Det er imidlertid også begrensninger av mikrodialyseteknikken. Den noe lav tidsoppløsning gir ikke informasjon i sanntid om nevrotransmitter endringer. Fordi det er en invasiv teknikk, probe implantasjon fører kirurgisk traume og bedøvelse, noe som kan påvirke nevrotransmitter-konsentrasjoner, er nødvendig i løpet av dette trinnet 7,9,10.
Forbindelsen konsentrasjonen i dialysatet utgjør bare en liten mengde av den aktuelle forbindelsen konsentrasjonen i den ekstracellulære væske. For beregning av den ukjente konsentrasjon av forbindelsen i ekstracellulær væske, har relative in vitro utvinningen kan beregnes. Bestemmelse av individuelle relative in vitro-inngang for hver sonde og hver forbindelse som er nødvendig før den in vivo eksperimentet. For dette formål er sonden dyppes i en løsning inneholdendeanalytten av interesse, mens den perfusjonsvæsken er den samme løsningen mangler analytten av interesse. Etter bestemmelse av forbindelseskonsentrasjonene i dialysatet, har disse dataene til å bli henvist til deres konsentrasjon i den omgivende væske. In vitro-bestemmelse av gjenvinning av flere stoffer kan gjennomføres samtidig ni.
Mange nevrovitenskap forskningsgrupper bruker mikrodialyse teknikk for å undersøke nevrotransmittere og metabolitter i det ekstracellulære rom for forskjellige hjerneområder. Dermed kommersielle prober er i stor etterspørsel i nevrovitenskap forskningsmiljø. En stor fordel med kommersielt tilgjengelige prober er høy funksjonssikkerhet. Den eksperimentelle oppsett for kommersielle prober er godt etablert og validert for mange kjente signalstoffer og metabolitter. Imidlertid, mens det kommersielt tilgjengelige mikrodialyseutstyr er kostbart og har mindre fleksibilitet i anvendelsen 11, i ther arbeidet en mikrodialyseproben montering er presentert i detalj, som kan tilpasses alle bruksområder og kan produseres for mindre enn $ 10. Denne skreddersydde probe er en konsentrisk mikrodialyseproben testet for undersøkelser i ulike hjerneområder 8.
In vitro-probe gjenvinninger av stoffer med forskjellig molekylvekt (spekter av 100-1,600 Da) og med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper er sammenlignet. In vitro gjenvinning bestemmelse av glukose, laktat og acetylkolin med en molekylvekt mindre enn 200 Da, ATP med en molekylvekt på omtrent 500 Da og neuropeptider angiotensin II, substans P og somatostatin med en molekylvekt over 1.000 Da blir utført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klar PTFE-rør
- Forkorte PTFE-rør inn 2,5 cm stykke. Bruk en skala papir for å estimere fysiske dimensjoner. (Se figur 3a)
- Skjær en avslutning i en vinkel for å lette innkopling av utløpsrøret. (Se figur 3a)
- Ru PTFE-rør ved anvendelse av sandpapir for å tillate man følger av epoksy-lim.
2. Forbereder Fused Silica
- Forkorte smeltet silisiumdioksid inn 2,25 cm stykke. (Se figur 3a)
3. Sette inn smeltet silisiumdioksid inn i PTFE-rør
- Sette inn en 30 G kanyle inn i den hule fiber PTFE til å stikke det i en avstand på 1 cm fra den flate enden. Bøye PTFE-røret for å forenkle prosessen. (Se figur 3b)
- Sett smeltet silisiumdioksid inn i PTFE-rør ved hjelp av kanyle som veiledning. (Se figur 3c)
- Fjern forsiktig kanylen og sikre smeltet silisiumdioksid. (SeFigur 3d)
- Det smeltede silika er ment for å projisere 5 mm på den flate enden. (Se figur 3E)
- Lim smeltet silisiumdioksid på plass ved stikkstedet ved cyanoakrylatlim og la det stivne over natten. (Se figur 3E)
4. Klar Epoxy lim (to-komponent lim)
- Legg 30 deler gul herder til 70 deler av svart epoxy lim ved hjelp av en tynn nål og bland det forsiktig. Det er direkte ferdig til bruk.
5. Påføring av membran (all videre trinnene må utføres under mikroskopet og en Scale papir brukes til å anslå Fysiske mål)
- Trekk polysulfonmembran forsiktig over det smeltede silika, og deretter trekke membranen og inn i PTFE-røret og justere membranen til 5,5 mm ved hjelp av en skarp skalpell. (Se figur 3f)
- Still et markeringspunkt på membranen med en fin penn for å definere utveksling lengde på 2 mmfra enden av membranen.
- Påfør en liten mengde av epoksylim for å dekke toppen av membranen ved hjelp av en fin nål. (Se figur 3G)
- Stenge forbindelsen mellom dialysemembranen og PTFE-fiber ved hjelp av den samme fin nål som anvendes i trinn 5.3) med epoksylim. (Se figur 3G)
- Legg nok epoksylim på membranen opp til merkingen punkt for å sikre en utveksling lengde på 2 mm. La det stivne over natten. (Se figur 3G) før bestemmelse av utvekslingen lengde, er membranen 5,5 mm. Etter påføring av epoksylim på membranen, er kun 2 mm av membranen er tilgjengelig for diffusjon.
6. Anvendelse av Metal Sleeve
- Skjær en 25 G nål i en cm metallhylse stykker ved hjelp av et bøyetang.
- Trekk 1 cm metallhylse (25 g) på den resterende del av det smeltede silisiumdioksyd. Den metallhylse muliggjør senere tilkobling av innløpsrøret med MICRODIAlyse probe. (Se figur 3h)
- Forsegle skjøten mellom metallhylse og PTFE-rør med de resterende epoxy lim. La det stivne i minst 24 timer. (Se figur 3i)
- Påføring varmt lim rundt delinger av sonden for ekstra fiksering og stabilisering.
MERK: Innløps interne volumet av sonden er 0.045 ul og utløpet interne volumet er 2,5 pl. Derfor, med en strømningshastighet på 1 mL / min, tar det ca. 2,5 minutter etter tilkobling av innløpsrøret for å starte samlingen av dialysatet. Med dagens protokollen, gir sonden forsamlingen prosedyren mikrodialyse sonder som er 95% pålitelig.
7. Utførelse av In Vitro Deknings Experiments
- Dypp sonde med en cut-off på 30 kDa og en utveksling lengde på 2 mm til en stamoppløsning bestående av aCSF inneholdende 1 mM glukose og 1 mM laktat og, i et separat eksperiment, inn i en CSF inneholdende 100nM ATP og 100 nM acetylkolin.
- Perfuse sondene med aCSF. Sett strømningshastigheten til en mL / min, og utfører eksperimenter ved romtemperatur (22 ° C). Tillat sondene bringes til likevekt i 1 time i stamløsningen, og samle prøver hvert 30 min senere og oppbevar ved -80 ° C inntil måling.
- For beregning av in vitro-inngang, sammenligne konsentrasjonene av analytter i dialysates med de kjente analyttkonsentrasjoner i stamløsningen. Uttrykke resultatene som prosenter av stoffet konsentrasjon i dialyse vs. stamløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den konsentriske skreddersydde mikrodialyseprobe består av en polysulfonmembran med en molekylær cut-off på 30 kDa. Sondeenheten er vist i figur 3.
Den oppviser en in vitro-utvinning for den lille energi metabolitter glukose (180,16 Da) og laktat (112,06 Da) på 19,10 ± 1,2% og 21,2 ± 1,6%, henholdsvis. For de positivt ladede acetylkolin med en molekylvekt på 181,66 Da, det viste en in vitro gjenvinning verdi på 22,6 ± 1,4%. ATP med en molekylvekt på 551,62 Da og tre negativt ladede fosfatester ga en in vitro gjenoppretting til en sammenlignbar grad (22,4 ± 0,7%). In vitro-gjenvinninger av små molekyler er vist i figur 4A.
Neuropeptider med en molekylvekt over 1.000 Da viste nedre inngang in vitro sammenlignet med mindre molekyler (<500 Da) (se Fi figur 4B). Blant de testede neuropeptider, angiotensin II (1,046.18 Da) er den minste peptid med 8 aminosyrer. Den oppviser en in vitro-gjenvinning på 6,1 ± 0,3%. Den 11 aminosyrerest substans P (1,347.63 Da) og den 14 aminosyre-somatostatin (1,637.88 Da) viste omtrent lik in vitro-gjenvinnings-verdier på 2,2 ± 0,3%, og 2,3 ± 0,1%, henholdsvis. In vitro inngang på vår 30 kDa probe er kan sammenlignes med in vitro inngang på kommersielt tilgjengelige mikrodialyse prober (CMA mikrodialyse, Stockholm, Sverige), f.eks. laktat 23% og glukose 13% (se program note nr. 1)
Figur 1: Fotografi av en skreddersydd probe.
8 / 53048fig2.jpg "/>
Figur 2: Skjematisk bilde av en mikrodialyseproben (Gjengitt fra Lietsche et al, 2014, med tillatelse fra ELSEVIER.).
Figur 3: Skjematisk bilde av en sondeenhet; trinn ai for mer informasjon se protokollen (Gjengitt fra Lietsche et al., 2014, med tillatelse fra ELSEVIER).
Figur 4: Inngang til små molekyler og nevropeptider (A) In vitro-inngang på glukose, laktat, acetylkolin og ATP.. Forrådsoppløsningen inneholdt 1 mM glukose og laktat og, alternativt, 100 nM ATP, og 100 nM acetylkolin for hver forsøks tilstand. Resultatene er uttrykt som prosent av substans concentration i dialyse / stamløsning. Verdier av teststoffer er middel ± SD for n = 22 for glukose, n = 22 for laktat, n = 11 for acetylcholin og n = 13 for ATP. (B) In vitro-inngang på den nevropeptider angiotensin II, substans P og somatostatin. Forrådsoppløsningen inneholdt 100 nM angiotensin II, substans P og somatostatin for hver eksperimentell tilstand. Resultater er uttrykt som prosentandeler av stoffkonsentrasjon i dialyse / stamløsning. Verdier av kolonner er middel ± SD for n = 6 for hver sonde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 3 viser et eksempel på en sondeenhet. Riktig indre og ytre diameter dimensjoner har å observeres nøye for slanger (OD 1,6 mm; ID 350 mikrometer), smeltet silisiumdioksid (OD 105 mikrometer; ID 40 mikrometer) og dialysemembran (OD 245 mikrometer; ID 210 mikrometer). Det er også viktig å holde en avstand mellom membran og smeltet silisiumdioksyd (105 um), og mellom membranen og produksjonsrøret (105 um) i tillegg. Hvis verdiene er forskjellige, kan trykket i sonden stige og føre til lekkasje av membranen.
Her introduserer vi en mikrodialyseproben med en utveksling lengde på 2 mm, som er aktuelt for mikrodialyse i mus hjerneregioner. Imidlertid kan dimensjonene lett kan tilpasses for større utvekslingslengder som skal anvendes i større dyr.
Noen deler av sammenstillingen kan skiftes. For eksempel er det ikke nødvendig å bruke PTFE-slange. Anvendelse av polyetylen rør er også mulig med identisk ytre og inner diameter dimensjoner. Rue opp slangen er bare nødvendig når du bruker en PTFE-rør. En erstatning av dialysemembranen er også mulig. For den foreliggende sondesammenstillingen, er et 30 kDa cut-off-membran anvendes, men hvilken som helst annen dialysemembran kan brukes med identiske dimensjoner. Derfor har våre skreddersydde probe montering fordelen av stor fleksibilitet til dialyser stoffer med en bred molekylvekt i området; Jo høyere molekylvekt cut-off, jo høyere molekylvekten av stoffet, som kan dialyseres. In vitro-gjenvinninger som regel øker med molekylvekt cut-off av dialysemembranen.
For å dekke toppen av membranen, er epoksylim som kreves for å stenge av forbindelsen mellom dialysemembranen og PTFE-rør, og for å bestemme lengden utveksling. Anvendelse av cyanoacrylate limet ikke er mulig i dette trinnet, fordi det påvirker dialysemembranen og fører til lekkasje. En cyanoacrylate lim til å lime plastic bør brukes for fiksering av smeltet silisiumdioksid med slangen på plass på stikkstedet.
Det bør bemerkes at denne proben utforming ikke har blitt testet med førings kanyler. Vår lab foretrekker å implantere lav diameter sonder for akutte eksperimenter hvor vi har 48-72 timer av eksperimentell tid før astrogliosis fører til driftsforstyrrelser av sonden. For denne type forsøk, ikke en guide kanyle tilbyr ikke en fordel fordi guide kanyler er større og forårsake mer skade på vev. Dessuten, selv med en guide kanyle på plass, har sonden alltid til å bli satt inn i friskt hjernevev, forårsaker akutte skader i området for dialyse. Gjentatt innsetting og fjerning av sonden gjennom føringskanyler forårsaker gjentatt skade, en situasjon som unngås ved hjelp av én-gang, dvs. akutt innsetting. Blod-hjerne-barrieren ble vist å være intakte få timer etter implantasjon 12. Guide kanyler er å foretrekke, men når serie målinger have gjøres over flere dager eller uker. Endelig bør flyktige anestetika brukes for implantering probe fordi injiserbare Bedøvelse interferere med etterfølgende eksperimenter i 1-2 dager.
In vitro-inngang for glukose, laktat, acetylkolin og ATP er ca 20%, dvs. for alle testet med liten molekylvekt stoffer, er in vitro-utvinningen tilnærmet like. Øyensynlig, i det nedre området (opp til 500 Da), har molekylvekt ingen stor innvirkning på in vitro utvinningsgrad. Molekylvekt cut-off på 30 kDa gjør det også mulig å dialyser neuropeptider. På grunn av den høyere molekylvekt av neuropeptider, er in vitro-verdi lavere utvinning. Substans P (1348 Da) og somatostatin (1638 Da) kan dialyseres i samme grad med in vitro-gjenvinnings-verdier på 2-3%. Selv om begge peptidene har en masseforskyvning på omtrent 300 Da, in vitro-gjenvinninger forbli den samme. Både substgen P og somatostatin er positivt ladet i vandig oppløsning og kan fremvise lignende fysisk-kjemiske egenskaper. Angiotensin II med en molekylvekt på 1046 Da viser en høy in vitro utvinning opp til 6%, som er tre ganger større enn med de to andre nevropeptider. Derfor molekylvekt over 500 Da tydelig påvirke in vitro utvinning, selv om når stoffene belastes nøytral i vandig oppløsning. I dette tilfellet blir in vitro utvinningen ikke er påvirket av ladningen av det dialyserte stoffer. Imidlertid, med bruk av andre membranmaterialer, gjenvinninger av ladede forbindelser kan påvirkes 8.
I konklusjonen, er monteringen av en skreddersydd mikrodialyseproben et akseptabelt alternativ til kommersielle sonder. Våre selvlagde prober er solid, har høy pålitelighet og god reproduserbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H.
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C.
- Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
- Neurochem, J.
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
