Лактоферрин человека (hLF) является компонентом иммунной системы. В этом исследовании иммунофлуоресцентные анализы были использованы для демонстрации как гепатоцеллюлярного поглощения hLF, так и качественного снижения репликации вируса гепатита С при лечении hLF.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммунофлуоресценции для мониторинга клеточного поглощения лактоферрин человека и его противовирусной активностью против вируса гепатита С
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммунофлуоресценции является метод лабораторной обычно используется для изучения многих аспектов биологии. Это, как правило, используется для визуализации распределения и / или локализации молекулы-мишени в клетках и тканях. Иммунофлуоресценции зависит от специфики флуоресцентных-меченых антител против антигенов, соответствующих их в клетке. Прямые и косвенные подходы иммунофлуоресцентные может быть использован, которые основаны на использовании антител, связанных с флуорохромом. Прямой иммунофлюоресценции менее часто используется, поскольку обеспечивает низкую сигнал, включает высокую стоимость и меньшую гибкость. В противоположность этому, непрямой иммунофлуоресценции чаще используется из-за его высокой чувствительностью и обеспечивает усиленный сигнал, так как более одного вторичного антитела можно прикрепить к каждому первичного антитела. В этой рукописи, и эпифлуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии для контроля интернализации лактоферрина человека, важный компонент иммуннойСистема, в печеночных клетках. Кроме того, мы наблюдали за ингибирующее потенциал чЛФ на внутриклеточного репликации вируса гепатита С с использованием иммунофлуоресценции. Оба обсудили преимущества и недостатки, связанные с этими подходами.
Введение
Иммунофлуоресценция — это метод, который использует флуоресцентный микроскоп для визуализации распределения и/или локализации молекулы-мишени в биологическом образце. Иммунофлуоресценция основана на специфичности меченых флуоресцентными антителами против соответствующих антигенов в клетке1. Обычно он используется на срезах тканей и культивируемых клеточных линиях для анализа распределения/локализации различных биологических молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и гликаны. Следует отметить, что иммунофлуоресценция часто используется в сочетании с другими методами флуоресцентного окрашивания, не содержащими антител, такими как красители 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), которые обычно используются для мечения ДНК2. Более того, эта методика предполагает фиксацию клеток, что позволяет проводить анализ клеток в определенное время.
Для анализа иммунофлуоресцентных образцов можно использовать различные типы микроскопов. Самым простым является эпифлуоресцентный микроскоп (рис. 1), для которого возбуждение флуорохрома и детектирование флуоресценции осуществляется через один и тот же световой тракт3. Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет может достичь объектива вместе с излучаемым светом. Такой подход, к сожалению, приводит к частому высокому соотношению сигнал/шум. В отличие от этого, конфокальная микроскопия (рис. 2) дает явное преимущество для повышения оптического разрешения и контраста за счет добавления пространственного точечного отверстия, расположенного в конфокальной плоскости линзы, для устранения расфокусированного света4. Такой подход позволяет реконструировать трехмерные структуры по полученным изображениям. Однако, поскольку значительная часть света от образца блокируется в точечном отверстии, часто требуются длительные выдержки.
Существует два класса иммунофлуоресцентных методов: первичные (или прямые) и вторичные (или косвенные). Прямая иммунофлюоресценция включает в себя первичное антитело, связанное с флуорохромом (Рисунок 3). Этот метод используется реже, потому что он обеспечивает более низкий сигнал, более высокую стоимость и меньшую гибкость1. Более того, такие антитела, как правило, труднее найти в коммерческих целях. С другой стороны, непосредственное присоединение флуорохрома к антителу значительно сокращает количество этапов процедуры, экономя время и часто снижая неспецифический фоновый сигнал. Это также ограничивает возможность перекрестной реактивности антител.
Непрямая иммунофлуоресценция включает в себя первичное немеченое антитело, специфичное для интересующего эпитопа1. Вторичное антитело, несущее флуорохром, затем распознает первичное антитело и связывается с ним (рис. 3). Несмотря на то, что непрямая иммунофлюоресценция является более сложной и трудоемкой, чем прямая иммунофлюоресценция, она часто используется из-за своей высокой чувствительности, а также обеспечивает усиленный сигнал, поскольку к каждому первичному антителу может прикрепляться более одного вторичного антитела. Кроме того, доступен широкий спектр коммерческих вторичных антител по доступным ценам.
Вирус гепатита С (ВГС) является серьезной проблемой общественного здравоохранения, 130-170 миллионов человек хронически инфицированы во всем мире. Для того чтобы остановить эпидемию, терапия против ВГС должна быть эффективной и широко доступной. Исследования, посвященные безопасному и доступному природному продукту, активному против ВГС, выявили противовирусную активность белка лактоферрина человека (hLF), который связывает и нейтрализует циркулирующийвирион5. В настоящем исследовании изучение активности hLF в субгеномной системе репликона ВГС, которая не зависит от проникновения вируса и его выделения, выявило отчетливую антирепликативную активность hLF в отношении ВГС. В данной рукописи представлено исследование, в котором иммунофлуоресцентные анализы проводились для мониторинга интернализации hLF, важного компонента иммунной системы6, в клетки печени. Кроме того, мы проводили мониторинг ингибиторного потенциала hLF на внутриклеточную репликацию вируса гепатита С (ВГС).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клетки подготовки и обработки
- В 24-луночный планшет, поставить стеклянную крышку в нижней части лунки. Промыть каждую лунку фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Семенной Ха-7 клетки, поддерживающие HCV субгеномного репликон в каждой лунке до плотности 5 × 10 4 клеток / лунку. Если нет обработка сделать, клетки могут быть посеяны на более высокой плотностью. Культуральную среду Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 250 мг / мл G-418 (для поддержания репликон).
- Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, лечения клеток с 3 мкМ чЛФ очищенного из грудного молока.
2. Параформальдегид / сахарозы Подготовка (12% СУП и 12% сахарозы)
- Поместите 500 мл PBS в химический стакан и нагреть его в пределах от 20 ° С до 30 ° С. Растворить 60 г сахарозы в PBS в. Растворите 60 г paraformalвого альдегида (СУП) в растворе сахарозы / PBS. Медленно добавить NaOH 2N (от 3 до 7 мл) до получения прозрачного раствора.
- Доведения рН до 7,4 с помощью HCl. Полный объем до 500 мл с PBS. Фильтр по тяжести на Ватман фильтра. Перед использованием разбавить раствор с PBS до конечной концентрации 4% PAF и 4% сахарозы (хранение 4 ° С в течение 1 недели максимум).
3. Иммунофлуоресценции
- В нужное время (0 ч, 2 ч или 24 ч лечения), промыть клетки дважды (1 мин) с PBS и зафиксировать PBS / 4% PAF / 4% сахарозы в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки, как правило, на 30-40% слияния и 1.5X10 5 клеток используются.
- Клетки проницаемыми с 0,15% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и блок в 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS в течение 20 мин.
- Развести первичных антител из интересующего белка в 10% NGS (например: первичная мышиное анти-антитела чЛФ разводили 1: 1000). Применение первичное антитело к клеткам.
- Через 4 ч при комнатной температуре или O /N при 4 ° С, промыть клетки три раза в течение 5 мин с 10% NGS. Пятно клетки с вторичным антителом, меченным флуорохромом, разведенного в 10% NGS (например: Флуорохром с длиной волны возбуждения 488 нм, связанного с антителом против мыши 1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Промыть клетки один раз в течение 5 мин с PBS и окрашивают клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Промыть клетки дважды в течение 5 мин с PBS. Установить крышку очки на SlowFade монтажа среду до визуализации через микроскопии. Клетки готовы для анализа эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
- Используйте различные элементы управления, чтобы обеспечить специфичность обнаружения. Например, все антитела могут быть опущены, чтобы обнаружить флуоресценции. Первичные антитела могут быть опущены, чтобы определить неспецифическое окрашивание вторичным антителом. Наконец, если это возможно, контролировать клеток или тканей, которые не делаютвыразить интерес молекула также могут быть использованы.
- Представьте образцы, используя подходящий флуоресцентный микроскоп (эпифлуоресцентной или конфокальной) и наборы фильтров, подходящий для флуоресцентной метки используются. Слайды также могут быть сохранены в виде слайд-поле в <-20 ° C для последующего анализа.
4. флуоресцентной микроскопии
- Держите образцы в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Включите источник света выбранной микроскопом (эпифлуоресцентной или конфокальной).
- Включите микроскопа. Включите камеру для микроскопа. Положите слайд на микроскопе для визуализации. Добавить иммерсионное масло на слайде, чтобы увеличить числовую апертуру объектива.
- Выберите соответствующие фильтры. Отрегулируйте фокусировку и подходящий цели. Отрегулируйте жалюзи в целях выявления соответствующего флуорохром но предотвратить фотообесцвечивания. Держите накладные огни, чтобы минимизировать фоновый свет, глядя на образец.
- Изменить йе фильтров для визуализации различных флуорохромов (например DAPI и для длине волны возбуждения 488 нм). Возьмите фотографии с камеры.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Способность печени Ха-7 клеточной линии интернализации экзогенно администрируемых чЛФ контролировали с помощью иммунофлуоресценции на конфокальной miscroscope. чЛФ был добавлен в культуральной среде и интернализации давали в течение 24 ч, после чего внеклеточный чЛФ промывали PBS и остаточного мембраной чЛФ деградировала с 5 мин обработки трипсином (1 мл). Клетки пересевали и позволило повторно придерживаться в течение 18 часов перед иммунофлуоресцентного. Для того, чтобы наметить цитоплазматические пределы клетки мембр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эпидемия гепатита остается глобальной угрозой, с 80% вновь инфицированных пациентов развивающихся хроническую инфекцию, положить их на риск цирроза, печеночной недостаточности или гепатоцеллюлярной карциномы. Прямого действия противовирусных препаратов, направленные репликацию HCV и созревание представляют простые агенты анти-HCV, как недавно продемонстрировано нормативного утверждения двух NS3 N-концевых ингибиторов протеазы (Boceprevir и Telaprevir). Анти-ВГС активность чЛФ настоящее время считается, вести себя, как в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была профинансирована как Канадским институтом исследований в области здравоохранения и естественных наук, так и Советом по инженерным исследованиям Канады. М. Бисайон является старшим преподавателем Chercheur Boursier из Фонда исследований в области здравоохранения Квебека, а также членом Центра клинических исследований в Университетском центре госпиталя Шербрука. Мы благодарим доктора Ральфа Бартеншлагера за щедрый подарок в виде системы репликона ВГС. Мы также благодарим доктора Чарльза Райса и доктора Даниэля Ламарра за любезно предоставленную линию печеночных клеток. Мы также хотим поблагодарить Гийома Трембле за техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Легковоспламеняющиеся твердые вещества, раздражающие кожу, легкие и глаза |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | без Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-меченый анти-мышиный | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-меченый анти-кроличий | Invitrogeb | A21069 | |
| Агглютинин зародышей пшеницы Alexa Fluor 488 конъюгат (WGA) | Invitrogen | W11261 | Потенциально мутагенный |
| анти-NS5A кролик | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF мышь | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Потенциально Мутагенный и канцерогенный |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse видимый/эпифлуоресцентный микроскоп | Nikon | TE2000-E | |
| эпифлуоресцентный/конфокальный микроскоп | Olympus | FV1000 |
Ссылки
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
- Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
