Summary
EN varmeapparat MR-kompatible specialdesignede laserbaseret er blevet udviklet til at give lokal opvarmning af subkutane tumorer for at aktivere frigivelse af agenter fra termosensitive liposomer specifikt mod tumoren regionen.
Abstract
Liposomer er blevet ansat som lægemiddelleveringssystemer at målrette solide tumorer gennem udnyttelse af den forbedrede permeabilitet og fastholdelse (EPR) virkning der resulterer i betydelige reduktioner i systemisk toksicitet. Ikke desto mindre har utilstrækkelig frigivelse af indkapslet lægemiddel fra liposomer begrænset deres kliniske effekt. Temperaturfølsomme liposomer er blevet manipuleret for at tilvejebringe site-specifik frigivelse af lægemiddel med henblik på at overvinde problemet med begrænset tumor lægemiddelbiotilgængelighed. Vores laboratorium har designet og udviklet en varmeaktiveret varmefølsomt liposomformulering af cisplatin (CDDP), kendt som HTLC, at give udløst frigivelse af CDDP ved solide tumorer. Varmeaktiveret levering in vivo blev opnået i murine modeller ved hjælp af en specialbygget laserbaseret varmeapparat, der giver en konform opvarmning mønster ved tumorstedet som bekræftet af MR Temperaturmåling (MRT). En fiberoptisk temperaturovervågningsindretningen blev anvendt til at måle temperaturen i realtidunder hele opvarmningen periode med online justering af varme levering ved skiftevis laser magt. Lægemiddelafgivelse blev optimeret under magnetisk resonans (MR) image vejledning ved co-indkapsling af et MR-kontrastmiddel (dvs. gadoteridol) sammen med CDDP i den varmefølsomme liposomer som et middel til at validere opvarmning protokol og til at vurdere tumorakkumulering. Opvarmningen protokollen bestod af en forvarmning periode på 5 min før indgivelse af HTLC og 20 min opvarmning efter injektion. Denne opvarmning protokol resulterede i en effektiv frigivelse af de indkapslede midler med den højeste MR-signalet observeret ændringer i den opvarmede tumor i sammenligning med den uopvarmede tumor og muskler. Denne undersøgelse viste, vellykket anvendelse af laserbaserede opvarmning apparat til præklinisk termosensitive liposom udvikling og betydningen af MR-vejledt validering af opvarmningen protokol for optimering af lægemiddeladministration.
Introduction
Patofysiologien af faste tumorer resulterer i øget permeabilitet og fastholdelse (EPR), i nanoskala systemer. Dette har ført til udviklingen af mange lægemiddeladministrationssystemer, der udnytter denne virkning til at målrette tumorvævet samtidig minimere systemiske bivirkninger 1. Liposomal levering teknologier er blevet bredt undersøgt for narkotika eller billeddannelse sonder 2. Skønt liposomer betydeligt har reduceret systemisk toksicitet i forhold til konventionel kemoterapi, har der været nogle forbedringer i kliniske effekt 3,4. Undersøgelser har vist, at begrænset effekt skyldes en mangel på lægemiddelfrigivelse fra bæreren 4,5. Som følge heraf er udviklingen af liposomer, der aktiveres til frigivelse af indkapslet lægemiddel som reaktion på ydre stimuli tiltrukket sig betydelig opmærksomhed. Hypertermi har været ansat i årtier som en forholdsvis sikker behandling modalitet for kræftpatienter 6. Derfor udviklerling af termosensitive liposomer med varme som en ekstern trigger har været en logisk kombination med betydeligt potentiale for klinisk oversættelse. Faktisk har lysolipid-holdige varmefølsomt liposom formulering af doxorubicin, kendt som lTSl-DOX, nu nået klinisk evaluering 7.
De seneste kliniske data med lTSl-DOX har vist, at protokollen for varme levering er en kritisk faktor, der kan stærkt påvirke patientresultater 8. Hos mennesker er radiofrekvens, mikroovn, laser og ultralydstransducere anvendes til at påføre hypertermi lokalt ved tumor-sites 9. I prækliniske studier, der kræver opvarmning af subkutane tumorer, er opvarmning katetre 10,11 og bade vand 12,13 oftest anvendte. I dette manuskript, introducerer vi en ny metode til opvarmning subkutane tumorer under anvendelse af en specialdesignet laserbaseret opvarmning, som gør, mere konform opvarmning af tumorvolumen. Brug MR kompatible marialer, opsætningen er lille nok til at passe inden i boringen af et lille dyr MR billeddanner, tillader realtidsovervågning af ændringer i væv temperatur under laser opvarmning.
MR kontrastmiddel, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), blev co-indkapslet med CDDP til en varmefølsom liposom formulering af CDDP (HTLC), kendt som Gd-HTLC, for real-time MR billede-guided overvågning og vurdering af varme -aktiverede medikamentfrigivelse og validering af opvarmningen protokollen. Vores resultater viser, at laser-baserede varme apparat effektivt aktiveret frigivelse af indkapslede agenter fra Gd-HTLC formulering, mens overvåges gennem MR-scanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Liposomfremstilling
- Opløs lipiderne 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (MSPC eller S-lyso-PC) og N - (carbonyl- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin (mPEG 2000 -DSPE) i chloroform. For eksempel til fremstilling af 10 ml HTLC afvejes 314,4 mg DPPC, 39,4 mg MSPC, og 83,9 mg mPEG 2000 -DSPE til en ravfarvet hætteglas. Derefter opløses lipiderne i 2 ml chloroform og varme op hætteglasset i 30 sekunder i et 60 ° C vandbad.
- Fjern chloroform under anvendelse af en rotationsfordamper. Placer resulterende lipidfilm under højt tryk vakuum O / N.
- For 10 ml HTLC, hydrere lipidfilmen med 5 ml 0,1 N Tris-buffer (pH 7,4) i 1 time. Samtidig afvejes 162,4 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG) lipid og 100 mg CDDP pulver og hydrat wed 5 ml 0,1 N Tris-puffer indeholdende 30% ethanol (pH 7,4) i 1 time.
- For Gd-HTLC formulering, afvejes den samme mængde DPPG lipid og 10 mg CDDP pulver, derefter hydratisere med 2,5 ml Gd-HP-DO3A-opløsning (279,3 mg / ml) plus 2,5 ml 0,1 N Tris-puffer indeholdende 30% ethanol ( pH 7,4) i 1 time. Under hydrering, skal blandingerne holdes i brune hætteglas og anbragt på en varmeplade ved 70 ° C under konstant omrøring og omhvirvling hver 10 min.
- Kombiner lipidblandingen og lipid medikamentblandingen, og igen hydratisere i 1 time. Vortex hver 15-20 min.
- Saml 10 ml ekstruder med to stabler af 200 nm polycarbonatfiltre. Tilslut termocylinderekstruder af ekstruderen til et cirkulerende vandbad ved 70 ° C, og tilslut ekstruderen til en komprimeret nitrogen tank.
- Umiddelbart efter hydrering, overføre blandingen i ekstruder kammeret. Åbn nitrogenstrøm (indstillet tryk til 200 psi) at ekstrudere liposomerne gennem membranerne. Opsaml liposomes i en 50 ml rør. Hold røret i et varmt vandbad (70 ° C) på alle tidspunkter under ekstruderingsprocessen. Gentag denne proces 5 gange.
- Adskil ekstruder og skifte til to stakke af 100 nm polycarbonatfiltre. Saml ekstruder og indstil trykket til 400 psi. Gentag trin 5, bortset fra ekstrudere liposomerne 10 gange. Prøven opsamles fra den endelige ekstrudering i et 15 ml rør.
- Køle liposomerne til stuetemperatur og centrifugeres ved 1000 xg i 3 min for at udfælde uopløseligt CDDP.
- Dialyse liposomerne O / N mod 0,9% saltvand i dialyserør med en 15.000 molekylvægt (MWCO) under sterile betingelser.
- Fortynd 10 pi liposomerne i 990 pi destilleret vand. Brug dynamisk lysspredning at måle størrelsesfordelingen af HTLC og Gd-HTLC. Udfør 3 målinger med 10 kørsler hver.
- Fortynd 40 pi liposomerne i 3.960 pi destilleret vand. Lav 5-6 standardopløsninger af platin og gadoliniumi koncentrationsområdet fra 0,1 til 20 ug / ml. Mål platin- og gadolinium koncentrationer ved hjælp af induktivt koblet plasma-emission spektrometer atomare (ICP-AES) ved 3 forskellige bølgelængder. Udfør 3 målinger ved hver bølgelængde for gennemsnitlige resultat.
- Bestem gelen til flydende krystallinsk faseovergangstemperatur (T m) af HTLC liposomformulering anvendelse af et differentielt scanning kalorimeter (DSC). Load 5-10 mg HTLC til en DSC-pande og bruge en tom gryde som reference. Brug en scanningshastighed på 5 ° C / min til rampe op temperatur fra 0 ° C til 60 ° C.
- Wrap liposomerne i aluminiumfolie for at forhindre udsættelse for lys og opbevares ved 4 ° C.
2. In vitro Frigivelse fra Liposomer
- Forbered spin-søjler.
- Inkuber 50 g gel filtration perler i 400 ml 0,9% saltvand ved stuetemperatur i 3-4 timer. Rul et stykke glasuld, våd med 0,9% saltvand og læg det i spidsen af en 1 ml sprøjte. Tryk på glasuld til at fylde ca. 0,05-0,1 ml af sprøjten. Brug et glas pipette til gradvist tilsættes ca. 1 ml gelfiltreringsmedier ind i sprøjten.
- Placer sprøjten i en 15 ml rør og centrifugeres ved 1.000 xg i 3 min. Fjern spinkolonne og placere den i et 15 ml rør.
- Prøve 400 pi HTLC eller Gd-HTLC i 8 1 dram glashætteglas og inkuber i et temperaturstyret vandbad ved enten 37 ° C eller 42 ° C. Tag et hætteglas ved hvert tidspunkt (dvs. 5, 15, 30 og 60 min), og straks placere den på is.
- Tilsæt 100 pi 0,9% saltvand i den klargjorte spinkolonne derefter tilsættes 100 pi HTLC eller Gd-HTLC før inkubation (kontrol) eller efter inkubation i et vandbad i spinkolonne. Centrifuger ved 1000 x g i 3 min. Fjern sprøjten fra røret og fortynde opløsningen i rør til ICP-AES analyse.
3. Implantation af subkutan xenograft af livmoderhalskræftSvulst
- Alle dyr blev udført i henhold til dyr brug protokoller godkendt af Animal Care udvalg fra University Health Network (UHN).
- Udfør alle dyreforsøg i et biosikkerhed kabinet (BSC). Autoklavér alle kirurgiske værktøjer, før en operation. Efter hver operation, tørre de kirurgiske værktøjer med 70% ethanol og sterilisere igen med en varm perle sterilisator.
- For eutanasi, placere dyret i et isoleret CO 2 kammer, derefter udføre cervikal dislokation.
- For generelle anæstesi ved hjælp af 100% ilt, bruge 5% isofluoran til induktion og 2% til vedligeholdelse. For at sikre anæstesidybden, pres med en pincet til palmar overflade af trædepuden at observere dyrs respons. Anvend øjensalve at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- For et dyr, som har undergået kirurgi, dyret i et rent bur uden selskab med andre dyr. Overvåg indtil tilstrækkelig bevidsthed er genvundet.
- KulturME-180 celler i alfa-minimalt essentielt medium (MEM-α) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika.
- Cellerne høstes og holde cellerne i komplette medier før podning. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Podes hver donor mus til at bære en intramuskulær (im) ME-180 (humane livmoderhalskræft celler) tumor.
Bemærk: Vækst på im websted er blevet udvalgt med henblik på at sikre udviklingen af godt vaskulariserede tumorer. Køb SCID-mus (i alderen 6-8 uger, ca. 20 g) fra en in-house opdrætsanlæg.- Bedøver en SCID mus og injicere 1 x 10 6 ME-180-celler i musculus gastrocnemius af bagbenet under anvendelse af en 27 G nål.
- Mål tumorstørrelse ved hjælp af en skydelære, indtil tumorerne har nået 9-12 mm i deres længste dimension. Afslut undersøgelsen, hvis svulsten har oversteget 12 mm, eller hvis tumormassen kompromiser normal adfærd, ambulation, mad og vand indtag.
- Implant tumor stykker fra donor mus i recipientmus.
- Bedøver en donor mus ved anvendelse af 5% isofluoran. Aflive musen ved hjælp af cervikal dislokation under anæstesi. Fjern donor tumor fra donor mus. Skær tumor i kubiske fragmenter på 2-3 mm3.
- Bedøver en modtager mus ved anvendelse af 5% isofluoran. Indsprøjtes 100 pi 0,5 mg / ml meloxicam subkutant før operation. Anvend iod kirurgisk krat løsning, så 70% ethanol, og endelig iodopløsning til den barberede hud. Barbere venstre bagben Modtagerens musen. Lave et snit på niveau med huden. Indsæt én donor tumor stykke subkutant gennem snittet. Lukke snittet under anvendelse af 1-2 såret clip (s).
- Fjern clips 3-5 dage efter implantation. Subkutan tumor er påkrævet for at bruge varme setup den laserbaserede.
- Tillad tumorer at vokse i 2-3 uger før varmebehandling.
4. Design, AssemBly og kalibrering af en konform Laser Levering Illuminator til in vivo Opvarmning
- Opnå opvarmning af væv under anvendelse af en 763 nm laser diode er koblet til en konform illuminator anvendelse af en optisk fiber.
- Den illuminator giver en ensartet overfladiske laser belysning af xenograft tumor. Det består af en 30 x 20 x 17 mm blok af stærkt reflekterende materiale, der indeholder tre støder lys integrere kammer kugler med et kammer i midten (16 mm i diameter) og 2 små kamre på hver side (16 mm i længden og 5 mm i diameter) (figur 1).
- For lys at passere fra det ene kammer til det andet blev to små huller med en diameter 5 mm skåret mellem de små ydre kamre og det større midterste kammer. Light leveres fra laseren i den ydre kamre ved hjælp af en 400 um cut-ende fiber forbundet til laseren, der føres ind i kammeret gennem et hul 600 um diameter.
- På grund af lysets natur interaction med kammervæggene, lys leveres til en af de små kamre er rumligt homogeniseres derefter passerer gennem det indre havne i det store kammer, hvor det er yderligere rumligt homogeniseres. Lys forlader derefter diameter port 10 mm på den midterste kammer.
- Kalibrere reflektorlyset levering i forhold til lasereffekten indstilling ved hjælp af en NIST kalibreret 50 mm integrerende kugle at måle den leverede strøm.
- Beregn lysfordeling i tumoren ved hjælp af Monte Carlo simuleringer baseret på en forenklet geometri tumoren. Generer Monte Carlo-koden i en brugerdefineret algoritme skrevet med en kommerciel beregningsmæssige softwarepakke og base på standard kode Monte Carlo modellering af lys transport i flere lag væv af Jacques et al. 14.
- Model tumoren som halvkugle liggende på en flad hud linje med en diameter, der svarer den gennemsnitlige tumor dimension på 7 mm ved hudoverfladen og en hanight på 5 mm. Model homogen belysning af overfladen ved tilfældigt lancere fotoner hele den eksponerede halvkugle og direkte i midten af kuglen.
- Brug optiske egenskaber, herunder absorption, u a = 0,025 mm -1, spredning, μ s = 10 mm -1, anisotropi faktor, g = 0,9 og brydningsindeks n = 1,4. Brug en million fotoner i beregningen.
- Udfør disse målinger før nogen in vivo opvarmning eksperimenter uden yderligere ændringer efter indledende kalibrering.
5. Conformal Opvarmning af Tumor hjælp Brugerdefineret-designet Laser Chamber opsætning
- Forbind den ene ende af en laser fiber til laserenheden og den anden ende til illuminator.
- Bedøver dyret under anvendelse af 5% isofluoran. Sæt en 27 G injektion kateter i den laterale halevene på musen. Sæt en 22 G kateter i tumorens centrum. Placer en fiberoptisk temperatur probe ind i det hule kateter til overvågning af temperaturændring.
- Dække hele tumoren med illuminator (figur 2). Indstil først magt til 0,8-1 W. Tænd laseren og vente på at temperaturen til at stige. Holde temperaturen af tumoren ved 42 ° C ved manuel justering lasereffekten mellem 0,1-0,8 W.
6. Temperatur Distribution evalueret gennem MR Temperaturmåling (MRT)
- Mål temperaturen fordeling af den opvarmede tumor ved hjælp af opvarmning setup den laserbaserede gennem proton resonans frekvens skift (PRF-shift) MRT på en 7 Tesla MR præklinisk imaging system 15 i forbindelse med fiberoptiske temperatursonde målinger.
- Erhverve Temperaturmåling billeder på 10 sek intervaller under anvendelse af en 2D-FLASH pulssekvens (ekkotid 4,5 msek; gentagelsestid 156,25 ms) med 312 x 312 um i planet opløsning og 2 mm snittykkelse i en enkelt skive på niveau med den fiberoptiske temperatur provære.
7. MR Overvågning af Agent Frigivelse
- Udfør T 1 vægtede billeddannelse før og 20 minutter efter administration af Gd-HTLC.
- Implant to tumorer, en på hver af de bagben, af en kvindelig SCID mus ved hjælp af ovenstående beskrevet i afsnit 3 for implantation metoden. Forvarm tumoren på venstre bagben i 5 minutter ved 42 ° C før injektion af Gd-HTLC i en dosis på 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A og 1,4 mg / kg CDDP, derefter opvarme tumoren i yderligere 20 min post-injektion. Udfør injektion under varmebehandling. Brug tumoren på højre bagben som en uopvarmet kontrol.
- Anskaf dynamiske MR-billeder (36 x 20 mm field-of-view, 200 x 200 um in-plane opløsning, 2 mm skive tykkelse MR sekvens protocol) til at overvåge Gd-HP-DO3A frigivelse ved 12 sek intervaller for hele 20 min efter administration af Gd-HTLC, der begynder 30 sekunder før injektion.
- Kontur tumoren (opvarmet og uopvarmet) og muskel volumen.Beregne middelværdien MR-signalet for alle voxel indenfor hver kontureret volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De HTLC liposomer er fremstillet ved hjælp af fælles metoder, herunder lipid filmdannelse, hydrering, ekstrudering og dialyse. Under trin, der involverer CDDP, bør der udvises forsigtighed for ikke at udsætte CDDP til ethvert aluminium materiale, som CDDP deaktiveres gennem dannelsen af en sort depositum. En illustration af HTLC er vist i figur 3. De fysisk-kemiske egenskaber HTLC blev sammenfattet i et manuskript for nylig offentliggjort i Journal of Controlled Release 16. Gadolinium og platin koncentrationer af Gd-HTLC formulering er 1,87 ± 0,28 mg / ml og 0,10 ± 0,02 mg / ml.
Den illuminator opvarmning setup den laserbaserede anvender tre små, forbundet kamre, der giver en homogen lysfordeling (± 15%) på 10 mm i diameter udgangsport. Afhængigt af effektindstillingen af laseren, er strøm leveret inden for området fra 0,5 til 1,7 W / cm2, som foranstaltningd hjælp af en kalibreret integrerende kugle. Resultaterne er vist i figur 4 som et tværsnit gennem tumoren. Antages en samlet effekt på 1 W, den maksimale hastighed fluens på ethvert punkt i tumoren er 70 mW / cm2. Lasereffekten falder med en faktor 2 på huden niveau i forhold til den maksimale fluens lige under tumoren overflade.
Varme hjælp opvarmning setup laser-baserede genererer en relativt ensartet temperaturfordeling kort, hvilket bekræftes af PRF-shift MRT (figur 5). PRF-shift MRT sporer den relative temperatur ændring fra et absolut basismåling erhvervet før opvarmning af punktkilde (dvs. fiberoptisk temperaturføler).
Fra MR-signal analyse (figur 6C), den opvarmede tumor viser den højeste relative stigning signal i forhold til den uopvarmede tumor og muskler efter administration af Gd-HTLC, som opretholdes indtil udgangenaf opvarmningsperioden.
Figur 1. Design af illuminator. (A) Dimensioner på illuminatoren. (B) dimensioner af de indre kamre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Illustration af opvarmning setup den laserbaserede sammen med en temperaturovervågningsindretningen. En laser fiber (blå linie) leverer lys til illuminator. En fiberoptisk temperaturføler (gul linje) blev anbragt i midten af tumoren gennem en 22 G kateter til overvågning af temperaturændring. Real-time temperamentperaturen aflæsninger vises på computerskærmen. Modificeret fra Journal of Controlled Release 2014 178, 69-78. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk tegning af HTLC formulering (ikke målfast). Lipidsammensætningerne, CDDP koncentration og størrelse af HTLC liposomer er illustreret. Modificeret fra Journal of Controlled Release 2014 178, 69-78. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Modeling let levering til tumoren ved hjælp af små integrerende kugle. (A) Skematisk model viser tumor hævet over det normale underliggende væv. Røde pile repræsenterer dækning og retning af de oprindelige fotoner i beregningen. Belysning dækker hele overfladearealet af den hævede tumor. (B) resultaterne af beregningen viser lys fluens fordeling i tumoren. (C) Tværsnitsundersøgelse plot af lys fluens versus dybde, langs den hvide stiplede linie vist i (B). Fluence sats i tumoren på huden dybde er 50% af den maksimale fluens sats. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. temperaturfordeling evalueret gennem MR termometri. &# 160;. (A) T2-vægtede billede, der viser den anatomiske placering af de to bilateralt implanterede tumorer (B) temperaturfordeling kort genereres fra opvarmning af venstre tumor til 42 ° C under anvendelse af opvarmning setup laser-baserede, mens den højre tumor forblev uopvarmet. Data, re-analyseret fra Journal of Controlled Release 2014 178, 69-78. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. MR overvågning af gadoteridol frigivelse fra Gd-HTLC liposomer upon varmeaktivering. T 1-vægtede MR-billeder (samme vindue, der blev anvendt), i en mus bærer to subkutane ME-180 tumorer, med en på hver af de bagben ( A) præ-injektion af Gd-HTLC og(B) 20 minutter efter injektion af Gd-HTLC (dvs. efter at hele opvarmningsperioden). (C) Relativ MR-signal ændrer normaliseret til det første tidspunkt i den dynamiske MR erhvervelse af musen vist i (A) og ( B). Data viser middelværdien + SD. Data, re-analyseret fra Journal of Controlled Release 2014 178, 69-78. 16 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Liposomer blev først udviklet i 1960'erne som drug delivery køretøjer, der bærer hydrofile lægemidler i deres interne vandige volumen og hydrofobe stoffer inden for deres lipiddobbeltlag 2. Ud over anvendelse i terapeutiske anvendelser, har liposomer blevet udforsket til diagnostiske anvendelser, når mærket med radionuklider eller fyldt med billeddannende kontrastmidler 17. I de seneste år, Theranostics og terapeutiske-diagnostiske par er blevet forfulgt for at skabe muligheder for billedbehandling vejledt patienten lagdeling og drug delivery 17,18. Den aktuelle undersøgelse bygger på begrebet billedet-guidet lægemiddeladministration at evaluere udløst medikamentfrigivelse fra termosensitive liposomer ved hjælp af en specialdesignet laserbaseret opvarmning setup under MR vejledning.
Som nævnt ovenfor har vandbade eller opvarmning katetre været almindeligt anvendt til at opvarme subkutane tumorer. Vandbadet metode kræver nedsænkning af hele ekstremiteten i varmt water, hvilket resulterer i ikke-specifik lægemiddelfrigivelse i hele lemmet udover at frigive ved tumorstedet. Anvendelse af en opvarmning kateter kræver placering af en 18 G kateter i tumorens centrum, og har vist sig at kræve opvarmning i en relativ lang periode (15 min) med henblik på at nå termisk steady state 11.
I den foreliggende undersøgelse, den nydesignede laserbaseret opvarmning setup giver en konform måde at levere varme til tumorvolumen som påvist ved MR-vurdering af temperaturfordelingen kort (figur 5). Heterogenitet i PRF-shift kortet i den uopvarmede ret bagben og højre ben tumor i figur 5 kan afspejle en kombination af lavt signal-støj i nærheden af modtagelighed artefakter og små fysiologiske eller varme-induceret bevægelser, som direkte kan kompromittere opvarmning og baseline billedregistrering men også indføre små variationer i inducerede felter omkringregioner offset magnetisk susceptibilitet. Desuden blev det konstateret, at termisk stabil tilstand kunne opnås inden for 1-2 minutter for at indlede opvarmning. Også det punkt fiberoptisk temperaturføler tilladt for real-time justering af laser magt for at holde temperaturen ved 42 ° C og for at minimere temperatursvingninger. Det er dog vigtigt at placere den fiberoptiske temperaturføler i en relativt centrale placering i tumoren. MR-billeddannelse kan anvendes til at validere snittet punkt for sensoren. Under opvarmningen bør lasereffekten justeres omhyggeligt for at holde temperaturen ved 42 ° C med en indledende strøm på 0,8 W.
Opvarmningen protokol blev optimeret gennem real-time overvågning af Gd-HP-DO3A udgivelse som et surrogat for stoffet CDDP. Den effektive frigivelse af indkapslede agenter fra HTLC liposomer oversat til forbedret effektivitet, med det opvarmede HTLC gruppen hvilket resulterer i en betydelig terapeutisk AdvanTage i forhold til andre behandlings- og kontrolgrupper 16.
Belysningen af opvarmningsapparatet er designet til at opvarme tumorer på 5-7 mm i den største dimension. Udformningen af illuminator kunne modificeres til at opvarme større tumorer og flere fiberoptiske temperaturfølere kan indsættes i hele tumoren volumen til at overvåge temperatur i forhold til det nuværende single-point baseret måling. Eftersom den bærbare enhed er fremstillet af MR-kompatible materialer, 3-dimensionelle MR termometri kunne udføres for at vurdere temperaturfordeling gennem hele tumorvolumen.
Konklusionen er, laserbaserede opvarmning apparatet giver et værdifuldt redskab til præklinisk udvikling af termosensitive liposomformuleringer. Billede-styrede lægemiddelafgivelsessystemer tilgange, såsom den, der anvendes i denne undersøgelse, har et betydeligt potentiale for klinisk oversættelse og implementering af personlig medicin, herunder real-time monitorering af terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG | Laborota 4000 | |
| High pressure extruder | Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml thermobarrel |
| Heating circulator | VWR International LLC. | 11305 | Connected to extruder |
| Polycarbonate membrane filter | Whatman | 110605;110606 | |
| Differential scanning calorimeter (DSC) | TA Instruments | Q100 | |
| Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) | PerkinElmer | Optima 7300DV | |
| Zetasizer | Malvern Instruments Ltd. | Nano-ZS | |
| Cell incubator | NuAire Inc. | NU-5800 | |
| Autoclip wound clip applier | Becton Dickinson | 427630 | |
| Autoclip wound clip remover | Becton Dickinson | 427637 | |
| Wound clips | Becton Dickinson | 427631 | 9 mm |
| 763 nm Laser device | Biolitec | Ceralas CD 403 laser | |
| Laser probe | Thorlabs Inc. | FT400EMT | With SMA and flat cleave connectors |
| Spectralon (illuminator) | Labsphere Inc. | FAST-SL-5CMX5CM | |
| CSTM-SL-5CMX5CM | |||
| 7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system | Bruker Corporation | Biospec 70/30 | |
| Fiber optic temperature sensor | LumaSense Technologies Inc. | Luxtron FOT Lab Kit | |
| Integrating sphere | Newport Corporation | 819C | |
| Optical power meter | Newport Corporation | 1830-R |
References
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65 (1-2), 271-284 (2000).
- Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. , American Scientific Publishers. (2007).
- O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15 (3), 440-449 (2004).
- White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95 (7), 822-828 (2006).
- Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11 (19), 6944-6949 (2005).
- Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. , Springer Science. (2006).
- Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
- Celsion Corporation. , Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27 (8), 1750-1754 (2010).
- Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51 (6), 1153-1162 (2004).
- Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99 (1), 53-63 (2007).
- Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60 (24), 6950-6957 (2000).
- Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26 (5), 485-498 (2010).
- Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
- Rieke, V., Butts Pauly, K.
- Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7 (6), 1899-1912 (2010).
- Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. , (2012).
