Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53062

⸱

11 ноября 2015 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

В этой статье

Краткое содержание

Стрессоустойчивость является одним из признаков долголетия и, как известно, генетически регулируется. Здесь мы разработали метод объективную высокой пропускной для выявления мутаций, которые придают устойчивость к стрессам в ЭС клеток для разработки модели мыши для долголетия исследований.

Аннотация

Генетический скрининг на основе фенотипа у мышей является мощным методом выявления функций генов, но часто ему мешает чрезвычайно высокая стоимость, что серьезно ограничивает его потенциал. В данной работе мы описываем использование эмбриональных стволовых клеток (ЭС) мыши в качестве суррогатных клеток для скрининга интересующего фенотипа и последующего введения этих клеток в эмбрион хозяина для развития в живую мышь, несущую фенотип. Этот метод обеспечивает (1) экономически эффективную, высокопроизводительную платформу для генетического скрининга в клетках млекопитающих; (2) быстрый способ идентификации мутировавших генов и проверки причинно-следственной связи; и (3) кратчайший путь к разработке мышиных мутантов непосредственно из этих отобранных ES-клеток для исследований на всех животных. Мы продемонстрировали использование параквата (PQ) для отбора резистентных мутантов и выявления мутаций, которые придают устойчивость к окислительному стрессу. Другие стрессоры или цитотоксические соединения также могут быть использованы для скрининга устойчивых мутантов с целью выявления новых генетических детерминант различных клеточных стрессоустойчивых видов.

Введение

Стаж имеет интимные отношения с стрессоустойчивости. В общем, долгоживущие виды часто демонстрируют повышенную устойчивость к нескольким стрессовых, таких как перекись водорода, паракват (PQ), УФ, тепла и тяжелых металлов 1,2. В противоположность этому, повышенная чувствительность к стрессу, как правило, предсказать сокращению срока службы и / или более фенотип болезни подверженных. Антиоксидант вывоз мусора путь уже давно предположили, играть важную роль в придании стрессоустойчивость животному. Тем не менее, с некоторыми исключениями, исследования из различных трансгенных животных с манипуляциями в различных антиокислительных ферментов (например, SOD) показывают, что увеличение уровня окислительных ферментов, поглощающих не увеличивает продолжительность жизни или здоровья продолжительность 3. Эти данные позволяют предположить, что стресс признак устойчивости последовательно наблюдается в долгоживущих животных посредничестве других клеточных путей еще не обнаружили.

Мы взяли объективную впередгенетический подход к идентификации генов, которые при, мутировал, может придать стрессоустойчивости фенотип в культуре эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. ЭС клетки предлагают два основных преимущества в этом исследовании: (1) сложные генетических манипуляций можно изменить геном ЭС клеток; и (2) любые устойчивые стресс ЭС клетки, выделенные из экрана могут быть непосредственно использованы для производства мыши, позволяя быстро перевод на целых исследований на животных для измерения продолжительности жизни и здоровья промежуток.

В этом докладе мы описали использование клеточной линии ES С9, в котором BLM аллелей под контролем с помощью тетрациклину элемента. Лечение доксициклина (DOX) временно отключен выражение Blm ведущую к увеличению инцидента сестра хроматид обмена. Эта краткосрочная BLM нокаут, разрешенных для производства гомозиготных мутаций в популяции гетерозиготного так, что рецессивные мутации для стрессоустойчивости может быть захвачен в процессе отбора. МыТакже описано применение PiggyBac (PB) транспозона мутагенеза случайно вставить поли-ловушка кассету (ПБ-УПА) мутировать генов в геноме. Клетки с нарушением гена, по поли-ловушка стал резистентные к G418, и могут быть восстановлены, так что совокупность генов ловушки мутантов (библиотеки генов-ловушка) может быть, а затем скрининг на мутант клонов, которые были устойчивы стресса.

Стресс резистентные клоны, выделенные из выбора можно охарактеризовать достаточно быстро с помощью молекулярных методов в отношении числа вставок (КПЦР), сайт инсерции (splinkerette ПЦР), идентичность нарушенного гена (BLAST), и его уровень экспрессии ( RT-КПЦР). Вставка РВ может быть remobilized по временной экспрессии MPB транспозазы в клоне, чтобы восстановить последовательность ДНК дикого типа и, таким образом проверить за потерю стрессоустойчивости. Эти мощные способы, чтобы подтвердить причинно-следственную связь мутации, которые должны быть сделаны додорогим производства мыши. Предыдущие исследования показали, что клетки подвергаются стресс-утратили плюрипотентности 4,5. Таким образом, в этом протоколе, сохранение набора реплик мутантных клеток, которые не будут обращаться с стресса является критическим для успешного производства мыши.

Наша лаборатория инженерии линии клеток C9 ES и вектор ПБ-УПА, и доступны для других исследователей по запросу. Протокол сообщил здесь начнется генерацией De Novo библиотеки генов-ловушке ЭС клеток с PB-УПА (рис 1А), с последующим реплик и выбор напряжения для изоляции стресс устойчивых клонов (Рис 1b). Мы показали, выделение параквату, мощного генератора свободных радикалов внутри клетки. Практически любая цитотоксического соединения или токсин, например, ER стресс-(например, тапсигаргин и туникамицина), нейронная окислителем (например, МРР +, 6-гидрокси допамина и ротенон), тепло, и тяжелаяметаллы (например, Cd, Se), могут быть адаптированы к способу для отбора соответствующих устойчивых мутантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Джин-ловушке ES сотовый Библиотека Строительство Использование PiggyBac транспозонов

  1. Подготовка первичных эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ) в качестве питателей для ES культуре клеток
    1. Разморозить один флакон митомицин С инактивированной ПМЭФ (5,0 х 10 6) в водяной бане при 37 ° C. Передача клеток в 5 мл ES клеточной среде (DMEM, содержащей 15% FBS, 1000 единиц / мл, ингибирующий лейкоз факторов, 100 мкМ заменимые аминокислоты, 2 мМ глутамина, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 25 ед / мл пенициллина / стрептомицина ), и центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 30 мл среды ES клеток с последующим распространении на две колбы Т25 (5 мл каждая) и двух 100-мм пластин (10 мл каждый). Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 24 часов.
  2. Культура и расширить С9 ЭС клеток
    1. Оттепель один флакон С9 ЭС клеток (2,5 х 10 6 клеток в 0,5 мл) в водяной бане при 37 °, и перечисляетклеток в 5 мл среды ЭС клеток. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют ЭС клеток в 5 мл ЭС клеток среде с последующей металлизации в Т25 колбы фидера. Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2. Ежедневно Заменить ES клеток среду.
    3. После 2 дней культуры, стволовые клетки должны стать ~ 80% сливной и готовы к пассировать. Промыть клетки с 5 мл PBS (без Ca 2+ и Mg 2+), а затем добавить 2,5 мл предварительно нагретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. Добавить 2,5 мл ES клеток среду, чтобы остановить трипсина; пипетки вверх и вниз 15 раз, чтобы разбить скопления клеток. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин.
    4. Аспирата супернатант и ресуспендируют клеток в 4 мл среды ЭС клеток. Передача 1 мл клеток на 100 мм пластины, содержащей 9 мл ES клеточной среде; подготовить два 100-мм пластин. Это 1: 8 проход. Поток клеток ежедневно с 10 мл ES клеточной среде.
  3. Подготовка 96-а фидерных пластины для библиотеки
    1. Как описано в 1.1.1, оттепель три флакона Митомицин-C инактивированные ПМЭФ (каждый из которых содержит 5 х 10 6 клеток) и ресуспендирования клетки от каждого флакона с 33,3 мл ES клеточной среде. Смешайте клетки получением суспензии 100 мл клеток.
    2. Пластина 100 мкл клеток на лунку на десять 96-луночных планшетах. Эти фидерные 96-луночные должны быть готовы, по крайней мере за один день до трансфекции С9 ЭС клеток с PB транспозонов.
  4. Электропорация С9 ЭС клеток с вектором-УПА РВ
    1. Trypsinize и рассчитывать расширенные С9 ЭС клеток с использованием автоматизированного счетчика клеток. Вымойте каждый 100-мм пластины С9 ЭС клеток 10 мл PBS. Добавить 8 мл предварительно нагретого 0,25% трипсин-EDTA и инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Остановка трипсин, добавив 2 мл клеточной среде ES. Передача клеточной суспензии в 15 мл трубки и пипетки вверх и вниз 15 раз развалится скопления клеток. Сразу центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин, после чего надосадочную жидкость аспирацией.
    3. Ресуспендируют клетокс в 10 мл ES клеточной среде и считать ES клеток с использованием гемоцитометра. Подготовьте шесть 15-мл пробирки суспензии клеток, содержащей 5 каждый х 10 6 клеток ES. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования каждый осадок клеток в 0,8 мл PBS.
    4. Подготовьте шесть электропорации кюветы (4 мм зазора), в которой 0,8 мл клетки переносятся. Для каждого кювете, добавить 1 мкг ПБ-УПА и 20 мкг МПБ транспозаза (mPBase); аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Положите кювет на льду. Выполните электропорации с использованием электропоратора экспоненциальный параметр на 250 V, 500 мкФ и бесконечности Ом.
      Примечание: Как правило, постоянная времени составляет около 10 до 12 мс для успешного электропорации, которые дают около 1500 до 2000, резистентные к G418 трансформантов на 5 х 10 6 клеток.
    5. Получить и бассейн трансфицированных клеток в T75 колбу, содержащую 98 мл ES клеток среду. Смешайте клетки осторожно пипеткой, а затем передать клетки с резервуаром (50 мл). НамIng пипетки 12-канальный, передавать 100 мкл клеток на лунку в предварительно приготовленный фидерных 96-луночных планшетах (10 в общей сложности). Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2.
    6. Через 24 часа питания клеток в день со свежим ES клеточной среде, содержащей G418 (150 мкг / мл), чтобы выбрать для гена-ловушке клонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно каждый хорошо будет содержать около десяти G418 устойчивых колоний. Когда эти колонии растут до размера, достаточного (обычно 5-7 дней), 96-луночные планшеты (библиотеки) будет повторен в 2 комплекта для хранения и выбора, соответственно. Каждая пластина в библиотеке обозначен как «суб-библиотеки", так что в этом случае, есть 10 подбиблиотеки.

2. Библиотека репликации

  1. Репликация мастер пластины
    1. 24-48 ч до начала резистентных к G418 колоний, достигающих 50-60% слияния, оттаивают еще три пробирки с митомицином С инактивированной ПМЭФ на десять 96-луночных планшетах в качестве питателей (см раздел 1.3). ЖелатинИзе десять 96-луночных планшетах путем инкубации 0,1% желатина (100 мкл / лунку) при 37 ° С в течение не менее 15 - 30 мин; O / N инкубации является приемлемым.
    2. Подготовка одноклеточных суспензий в 96-луночных планшетах в обработкой трипсином. Отберите среду из 96-луночных планшетах и мыть один раз равным объемом PBS (без Ca 2+, Mg 2+). Добавьте 50 мкл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА, инкубировали при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 10 мин. Остановка трипсином с 50 мкл клеточной среде ES. Разбивать клеточные скопления с помощью пипетки вверх и вниз 15 раз с многоканальной пипетки.
    3. Передача 50 мкл суспензии клеток трипсином в соответствующей строке подающего пластины (Master), уже содержащего 150 мкл ES клеток среду и остальных 50 мкл в соответствующей строке желированного пластины (реплики), уже содержащего 150 мкл ES клеток среду. Процесс каждую строку ячеек к Мастер и реплики пластины. Инкубируйте пластин (теперь содержащий 200 мкл CОбъем ulture) при 37 ° С, 5% СО 2 O / N.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть в настоящее время двадцать 96-луночных планшетах.
    4. На следующий день питания клеток 100 мкл свежей среды клеток ES, содержащей 150 мкг / мл G418. Замените среду ежедневно до лунки, не 80-90% вырожденная.
  2. Замораживание Мастер пластины
    1. Когда мастер пластины около 80% сливной, Trypsinize клетки, как описано (смотрите раздел 2.1.2).
    2. Удалить пластины и остановки реакции трипсина с 50 мкл 2x морозильных среды (60% Средний ES клеток, 20% FBS, 20% ДМСО). Пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью многоканальной пипетки, чтобы обеспечить надлежащее смешение морозильной среды.
    3. Положите 96-луночных на в плотно закрытой коробке пенополистирола и поместить его в -80 ° C морозильнике до четырех месяцев хранения. Четыре месяца позволит достаточно времени, чтобы завершить выбор стресс и определить, какие из скважины Мастер пластины содержат клоны интерес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение при -80 & #176; С больше, чем 4 месяца приведет к снижению жизнеспособности клеток. Можно использовать крио-пробирок в формате 96-луночного, которые могут храниться в паровой фазе жидкого азота в течение длительного хранения.
  3. Подготовка пластин ДНК и суб-библиотеки бассейны от реплик пластин
    1. 24-48 ч до тиражирования в дальнейшем пластин ДНК и суб-библиотеки бассейнов, подготовить десять 100-мм пластин с митомицином С инактивированной ПМЭФ для суб-библиотека бассейна, и десять клейстеризованный 96-луночных планшет для репликации ДНК. Обратитесь к разделу 1.3 для общей процедуры.
    2. Trypsinize клетки в 96-и реплик пластин (обратитесь к разделу 2.1.2). В трипсином шаге 10 мин, аспирации желатин с пластин ДНК и заменить 150 мкл клеток ES-среде, содержащей G418 (150 мкг / мл). Кроме того, подготовить резервуар, содержащий 5 мл ES клеточной среде для объединения в "подбиблиотек" в 100-мм пластины питателя.
    3. После трипсинизации, перестают пытатьсяpsin с 50 мкл клеток Е. среднего по одной строке за раз с помощью пипетки 12-канальный. Внесите вверх и вниз 10 раз развалится скопления клеток.
    4. Передача 50 мкл клеточной суспензии в соответствующей строке пластины ДНК и передавать оставшиеся 50 мкл в резервуар, содержащую 5 мл среды ES клеток. После завершения одного полного 96-луночного планшета, аспирации среды из 100-мм пластины питателя, в которой объединенные клетки переносят. Эти объединенные содержащие мутации клетки обозначаются как «суб-библиотеки".
    5. Повторите для остальных девяти 96-луночных планшетах. Поток 96-а ДНК и 100-мм объединяли "суб-библиотеки« тарелки ежедневно ES клеток, содержащей G418 средней (150 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть в настоящее время десять 96-луночных '', ДНК и десять 100-мм «суб-библиотека" пластины.
  4. Замораживание пластины ДНК. Когда клетки в тарелке ДНК 80-90% сплошности, аспирации среды, промыть клетки дважды 100мкл PBS и хранить при -20 ° С для выделения ДНК позже 6 геномной. Эти пластины ДНК будут демонстрироваться с помощью ПЦР для выявления которых соответствующие лунки в «Мастер» пластины содержит клон интерес.

3. Доксициклин индуцированных Гомозиготные Мутанты

  1. Замораживание суб-библиотека бассейны и прохождение клеток для лечения доксициклина
    1. 24 ч до 100-мм «суб-библиотека» пластин, имеющих колонии достаточно большой, чтобы дать 70-80% слияния, подготовить набор из десяти желатинизированного 100-мм пластин для лечения доксициклина.
    2. Подготовка одноклеточных суспензий из каждого суб-библиотеки (см разделах 1.4.1 и 1.4.2 для деталей). Передача 5 × 10 6 клеток на желатинированный 100-мм пластины с доксициклином (1 мкг / мл); инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2. Замораживание оставшихся без доксициклина обработанные суб-библиотеки бассейны в 5 х 10 6 клеток на флакон.
  2. Прохождение клеток в присутствиидоксициклина выбить BLM
    1. Прохождение суб-библиотеки в 1: 8 каждые 2-3 дней в присутствии доксициклина (1 мкг / мл) на срок до двух недель, в течение которых DOX-индуцированной нокаут Blm будет способствовать потере гетерозиготности в клетке Население, что позволяет поколения гомозиготных мутантов.

4. Стресс Выбор и выделение устойчивых клонов

  1. Тема доксициклин-клеток, обработанных выбора напряжения
    1. 24 ч до пассажей доксициклина обработанных клеток для выбора напряжения, подготовить десять клейстеризованный 150-мм пластин, место в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе.
    2. Подготовка одного суспензии клеток каждого суб-библиотеки по трипсинизации (обратитесь к разделу 1.4.1 и 1.4.2 для деталей). Семенной 6,6 х 10 6 клеток на каждой 150-мм пластины в 30 мл общего объема культуры, распространять клетки равномерно. Инкубируйте клетки с стресс (10 мкМ параквата или бездействия -меркаптоэтанол,в клеточной среде ES, содержащий 7,5% инактивированной нагреванием FBS) в течение 7 дней, после чего заменить обычной среде ES клеток, чтобы позволить выжившие клетки расти в колонии для сбора.
    3. Дополнительно: Замораживание оставшихся доксициклин-клеток, обработанных в 5,0 х 10 6 клеток на флакон.
  2. Выберите стресс устойчивых колоний
    1. После восстановлении нормальной СМИ в течение недели, наблюдать, как многие стресс устойчивые колонии присутствуют. В зависимости от числа колоний, чтобы ее взяли, подготовить достаточно скважин с митомицином С инактивированной ПМЭФ на 96-луночных планшетах за один день заранее, соответственно (смотрите раздел 1.1 для более подробной информации).
    2. В день сбора, аспирации и заменить среду в фидерной 96-луночного планшета с 100 мкл свежей ES клеток средних, поместите обратно в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе. В это время, подготовить U-нижней 96-луночный планшет с 50 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА на лунку. Аспирируйте среду из 150-мм пластины отбора стресс и добавить екаче объем PBS.
    3. Установите микропипетку 2 мкл, и "забрать" выживших колоний в U-нижней трипсина, содержащий скважин, выбирая один колонию на лунку. Это приемлемо, чтобы пластина сидеть при комнатной температуре до тех пор, необходимое количество колоний не была выбрана. Затем инкубируют нижнюю пластину U при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мы берем 1 ч, чтобы забрать 96 колоний.
    4. Стоп трипсина реакции одну строку в то время с 50 мкл ES клеток среднего помощью многоканальной пипетки. Пипеток вверх и вниз 15 раз для получения суспензии отдельных клеток и передают 100 мкл клеток в соответствующей строке подающего пластины, уже содержащего 100 мкл ES клеточной среде. Завершить передачу для всей пластинки. Культуры клеток O / N в 200 мкл. На следующее утро, аспирация средних и заменить 100 мкл клеточной среде ES.
  3. Репликация 96-луночных на
    1. Когда скважины подобранных колоний 80-90% conflueнт, повторить на две согласующих пластин, по одному для выделения ДНК, а другой для клеток резервирования. Эти пластины желатинизированный и не содержат митомицин С инактивированной ПМЭФ.
    2. Аспирируйте среднего и промыть 100 мкл PBS. Добавить 50 мкл 0,25% трипсина-EDTA в каждую лунку, инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. Остановка трипсина с 150 мкл среды ЭС клеток, перемешать с помощью пипетки, и передавать 100 мкл клеточной суспензии в соответствующей строке двух 96-луночных планшетах. Изменить среднего ежедневно.
    3. Когда пластины 80-90% сливной, заморозить один набор пластин, как «резервного» (обратитесь к разделу 2.2 для более подробной информации). Другой набор пластин расширена, как описано ниже.
  4. Расширение клетки для изоляции геномной ДНК
    1. Подготовка суспензии отдельных клеток в пластине ДНК 96-луночного (см 2.1.2 для деталей).
    2. Передача клеточной суспензии из каждой отдельной лунке 96-луночного планшета с лунку 24-луночного планшета (4 объема) с использованием MICRopipette. Обеспечить нет перекрестное загрязнение ни клеток, как "определена" колонии "клональной 'происхождение. Культуры клеток в 0,5 мл среды ES клеток, не изменяя среду ежедневно до скважин 80-90% вырожденная.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет 24-а позволит достаточный выход геномной ДНК для ПЦР-анализа.

5. Выявление PB Insertion сайтов и захваченных генов

  1. Геномную ДНК из изоляции 24-луночного планшета: лизировать клетки в тарелке 24-луночного и выделения РНК, свободной от геномной ДНК.
  2. Выполните Splinkerette ПЦР (SpPCR) для генерации последовательности фрагментов, фланкирующие интеграции транспозонов сайт PB, как описано 7,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SpPCR является пятидневная процесс, хотя руки-на время каждый день минимальна.

6. Генетический анализ мутантных клонов

  1. Найдите господину хорошо и очистить клон интерес.
    1. При интеграции сайта ПБ былотображается, дизайн прямого праймера выше сайта интеграции для использования с обратным праймером Pb (например, PB3'-1) 8 и экран пластины ДНК, соответствующий тому же 'подбиблиотека', из которого напряжение устойчивый клон был выбран. Ожидать, чтобы найти только один положительный хорошо по всей пластине ДНК 96-а. Оттепель это точное и от «Мастер» пластины в 24-луночного планшета на фидерах и не растут клетки до 80-90% слияния.
      Примечание: В этот момент, это также содержит смесь генов-ловушке клонов.
    2. Когда 24-луночный планшет 80-90% сплошности, Trypsinize клетки и пластины 1000 ЭС клеток в 100 мм пластины питателя (обеспечить суспензии отдельных клеток). Прохождение оставшиеся клетки в Т25 колбы на питателей для расширения. Замораживание клетки от T25 колбу, когда колонии 80-90% вырожденная. Замораживание 4 флаконов в T25 колбу в качестве резервных копий.
    3. Разрешить колонии расти в течение 7 дней, а затем выбрать 96 колоний в 96-луночный FeЭдер пластины. Обратитесь к разделу 4.2 для получения процедуру. Репликация пластину, когда готовый в тарелке "ДНК" и заморозить другие, как "2-й -МАСТЕР 'пластины (обратитесь к разделу 2.2 для замораживания).
    4. Разрешить колонии достичь 80-90% слияния. Экран пластину ДНК, чтобы найти лунки, содержащие очищенный клон интерес. Expand клетки от 96-луночного 2-й -МАСТЕР пластины с 24 лунками, а затем в колбу Т25 (все от питателей). Замораживание 4 флаконов в T25 колбу.
      Примечание: В этот момент, ген-ловушке клеточной линией является клональной, не подвергается воздействию стрессора, и подходит для производства мыши.
  2. Определить количество PB вставки: Оттепель один флакон стресс устойчивостью клеточной линии и расширить клетки в клейстеризованного T25 колбу. Изолировать геномной ДНК и проверки числа копий транспозона PB. Это может быть достигнуто путем количественной ПЦР ориентации ген неомицина.
  3. Измерьте уровень экспрессии гена: После Конфиrming есть одно событие интеграция ПБ в клеточной линии интересов, измерить уровень экспрессии гена захваченного по РТ-КПЦР с использованием специфических зондов TaqMan для каждого гена.
  4. Последовательность мутантный мРНК: Создание кДНК ампликон помощью ПЦР с использованием праймеров, вверх по течению отжиг в экзоне и вниз по течению отжига праймеров к последовательности сплайсинга акцептора гена ловушки кассеты. Последовательность кДНК фрагмент, чтобы подтвердить, что ожидаемое сплайсинга происходит в ловушке гена.
  5. Remobilize в PiggyBac транспозон для проверки причинно-следственной связи между захваченного гена и стрессоустойчивости.
    1. 24-48 ч до оттаивания клеток для PB ремобилизации, оттепель и пластины питателей DR4 на одном Т25 колбы и два 100-мм пластин. По крайней мере, один день после того, как кормушки DR4 высевают на T25 колбу, оттепель один флакон клеточной линии, содержащей вставку PB и пластины клеток в T25 колбу, содержащую DR4 кормушки. Расти клетки ES клеточной средев течение 48 ч, изменение среды в день.
    2. Подготовка суспензии отдельных клеток из ЭС клеток. Граф клеток с автоматизированной счетчика клеток, и передачи 5.0 х 10 6 клеток ES в 15-мл пробирку. Центрифуга при 100 мкг, и ресуспендирования клеток в 800 мкл PBS. Перевести суспензии в 4 мм кювете.
    3. Добавить 20 мкг mPBase Puro в кювету, перемешать с помощью пипетки и электропорации клетки (обратитесь к разделу 1.4 для более подробной информации). Распределите трансфекции клеток на двух 100-мм пластин DR4 фидерных. Культуры клеток O / N в ES клеточной среде.
    4. На следующее утро, кормить клетки с ES среде с 1 мкг / мл пуромицин и культуры клеток в течение 48 часов. Вывод выбор пуромицину и продолжают культуры клеток в течение 5 дней. Когда колонии достаточно большой для сбора, выберите в питающий 96-луночного планшета (обратитесь к разделу 4.2).
    5. Когда определена клетки достигли 80-90% слияния, разделения 1/6 го пластины в пластину ДНК и 1/6 й ФЛели в G418 пластины, оставляя 2/3 выстр ячеек в оригинальной пластины должны быть заморожены (обратитесь к разделу 2.2 для замораживания).
    6. Культура пластина ДНК в ЭС клеток среда для изоляции позже ДНК, и G418 пластины в 150 мкг / мл G418, чтобы проверить на потерю устойчивости к неомицину. Скважины с не жизнеспособных клеток после 72-96 часов в культуре, содержащей G418 указывают на успешную ремобилизацию гена-захвата PB транспозонов.
    7. Соответствующие скважин в пластине '' ДНК будут демонстрироваться с помощью ПЦР, чтобы подтвердить PB транспозон был удален. Когда пластина ДНК 90% сливной, изолировать геномной ДНК в 96-луночного формата пластины 4 для ПЦР скрининга для восстановления последовательности дикого типа и отсутствием нео-IRES в качестве средства для подтверждения возвращение.
    8. Оттепель совпадающие скважин от Master пластины 24-луночного планшета и расширить до Т25 колбы (все с фидеров). Замораживание четыре флаконов в T25 колбу в качестве резервной.

    6. 7. Генерация мутантов мыши

    1. Восстановление устойчивых ES клеток от мастер пластин и использовать их для инъекций эмбрионов для получения химеры. Около 15-20 ЭС клетки вводили в индивидуальной линии C57BL / 6 бластоцисты. Передача 15 бластоцисты на мышь в матку самки псевдобеременных (штамм ICR). Mate мужской химеру (указанную в ES-клетки, специфические агути цвета пальто), извлеченного из помета с несколькими молодыми целинных C57BL / 6J женщин, чтобы проверить для передачи зародышевой линии, и создать колонию мутантных мышей.
    2. Изолировать и фибробласты тест хвост кожу от F1 мутантных мышей и дикого типа однопометница для активных форм кислорода (АФК) уровне и устойчивости к параквату 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В типичном эксперименте мутагенеза, трансфекции состоит из в общей сложности 3 х 10 7 ЭС клеток PB-УПА и МПБ транспозазы. Числа гена-ловушке ЭС клеток, полученных в двух независимых экспериментов суммированы в таблице 1. Эффективность генной захвата составляет около 0,04%. Объединенные библиотеки генов ловушки содержат 22,400 независимых мутантов, о полный охват генома мыши (23000 генов, кодирующих). Чрезмерное освещение может быть достигнуто путем создания более мутанта с помощью повторного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Прямой генетический анализ позволяет непредвзято исследовать геном на наличие генов, ответственных за определенный фенотип. Этот метод очень эффективен для раскрытия новых функций генов. Он широко используется в низших организмах, но не в млекопитающих, таких как мыши, в основном из-за чрезвычайно высокой стоимости, связанной с инфраструктурой и логистикой. Здесь мы перенесли процесс генетического скрининга на платформу ES-клеточных культур, значительно повысив эффективность и пропускную способность при создании мутан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Wellcome Trust Sanger Institute за подарки в виде транспозона piggyBac и транспозазы piggyBac. Эта работа была поддержана грантом Бутчера штата Колорадо и AG041801 NIH R01 (W.S.C.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture
500-мл Stericup фильтрыEMD MilliporeSCGPU05RE
250 мл StericupФильтры EMD MilliporeSCGPU02RE
50 мл Steriflip-GVEMD MilliporeSE1M179M6
KO DMEMLife Technologies10829-018
DMEMSigma-AldrichD6429
FBSTissue Culture Biologics104
Термоинактивированный FBSSigma-AldrichF4135-500
LIFEMD МиллипорыESG1107
заменимые аминокислотыLife Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Pen/StrepLife Technologies15140148
&бета;-меркаптоэтанолLife Technologies21985-023
Метилвиологен дихлорид ( Паракват)Сигма-Олдрич856177
диметилсульфоксид Hybri-MAXSigma-AldrichD2650
EmbryoMAX 0,1% желатинEMD MilliporeES006B
DPBS/модифицированныйHyCloneSH30028,02
0,25% трипсин-ЭДТАLife Technologies25200-056
T25 КолбаCorning353108
Колба T75Corning353135
100-мм  пластинаCorning353003
150-мм  пластинаCorning430599
96-луночная  пластинаCorning3585
96-луночная U-образная нижняя пластинаCorning3799
24-луночная пластинаCorning3526
Резервуар 50 мл Corning4870
Пробирки 15 млVWR International, LLC82050-276
Первичные эмбриональные фибробласты мышиEMD MilliporePMEF-NL
DR4 Эмбриональные фибробласты мышиПрименяемые стволовые клеткиASF-1001
Митомицин CFisher BioReagents 
Geneticin (G418)Life Technologies11811-023
Биореагенты Фишера с доксициклином 
КриопробиркиThermo Scientific377267
центрифуги EppendorfCentrifuge 5702
TC10 счетчик ячеекBio-Rad
Counting Slides (для TC10)Bio-Rad1450011
Electroporation
Gene Pulser XcellBio-Rad1652611
Gene Pulser Cuvettes (4  mm gap)Bio-Rad1652088
Molecular Biology
Thermal CyclerEppendorfMastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit BQiagen158745
Topo-TA Cloning kitLife Technologies 450030
Набор для синтеза кДНК высокой емкостиApplied Biosystems4368814
NaClFisher BioReagents BP358-212
100% этанолDecon Laboratories, Inc.2716
Вода с двойной обработкой культуры тканейSigma-AldrichW3500
Sau3A1New England BioLabsR0169L
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202T
EcoRVNew England BioLabsR3195S
96-луночный буфер для лизиса (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Соляная кислотаБиореагенты Фишера A144-212
EDTASigma-AldrichE5134
N-Lauroylsarcosine натриевая сольSigma-AldrichL5777
Proteinase-KFisher BioReagents BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GTBio-Rad170-4469EDU
LE Agarose GeneMateE3120500
Ethidium Bromide Биореактивы Фишера BP1302
Лестница для ДНК 100 BPНовая Англия BioLabsN3231S
1 КБ Лестница для ДНКНовая Англия BioLabsN3232S
2-логарифмическая лестница для ДНКНовая Англия BioLabsN3200L
BP25312BP26531

Ссылки

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310(2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Прямой генетический скринингэмбриональные стволовые клеткиселекция паракватомстратегия репликативного посевасоздание мутантных линий мышейвысокопроизводительный скринингпроцесс генного захватаустойчивость к окислительному стрессубиблиотеки ЭСК
Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.