ストレス耐性は、長寿のための顕著な特徴の一つであり、遺伝的に支配されることが知られています。ここでは、寿命試験のためのマウスモデルを開発したとのES細胞におけるストレス耐性を付与する突然変異をスクリーニングするために公平な高スループットの方法を開発しました。
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方法論記事
ES細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ
この記事について
サマリー
要約
>jove_content<マウスにおける表現型駆動型遺伝子スクリーニングは、遺伝子機能を明らかにするための強力な技術ですが、しばしば非常に高いコストによって妨げられ、その可能性は著しく制限されています。 ここでは、マウス胚性幹細胞(ES)細胞を代理細胞として使用して目的の表現型をスクリーニングし、その後、これらの細胞を宿主胚に導入して、表現型を持つ生きたマウスに成長させる方法について説明します。 この方法は、(1)哺乳類細胞の遺伝子スクリーニングのための費用対効果の高いハイスループットプラットフォームを提供します。(2)変異した遺伝子を特定し、因果関係を検証するための迅速な方法。(3)全動物研究のために、これらの選択されたES細胞から直接マウス変異体を開発するための近道。 パラコート(PQ)を使用して耐性変異体を選択し、酸化ストレス耐性を付与する変異を特定することを実証しました。 他のストレッサーや細胞毒性化合物も、耐性変異体のスクリーニングに使用され、さまざまな細胞ストレス耐性の新規遺伝的決定要因を明らかにすることができます。
概要
長寿はストレス耐性との親密な関係を持っています。一般的には、長寿命の種は、多くの場合、過酸化水素、パラコート（PQ）、UV、熱、及び重金属1,2のような複数のストレスに向かって抵抗が増大し実証します。対照的に、ストレスに対する感受性の増大を短縮寿命および/または複数の疾患を起こしやすい表現型を予測する傾向があります。抗酸化掃気経路は長く、動物にストレス耐性を付与するに主要な役割を果たしていると推測されています。しかし、いくつかの例外を除いて、様々な抗酸化酵素 （例えば、SOD）での操作とトランスジェニック動物の多様からの研究では、酸化剤捕捉酵素のレベルを増加させると、寿命や健康スパン3を増加させないことを示しています。これらのデータは、一貫して長寿命の動物で観察されたストレス耐性形質がまだ発見される他の細胞経路によって媒介されることを示唆しています。
我々は公平な前進を取りました上に変異遺伝子を同定するための遺伝学的アプローチは、培養された胚性幹（ES）細胞におけるストレス耐性表現型を付与することができました。 ES細胞は、この研究において二つの大きな利点を提供する：（1）高度な遺伝子操作は、ES細胞のゲノムを改変するために利用可能です。 （2）画面から回収ストレス耐性ES細胞を直接全動物試験への急速な変換が寿命及び健康スパンを測定することができ、マウスの製造に使用することができます。
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プロトコル
1.ジーン・トラップされたES細胞ライブラリーの構築のpiggyBacトランスポゾンを使用します
- ES細胞培養用フィーダー等の一次マウス胚線維芽細胞（PMEF）を準備
- 37℃の水浴中でマイトマイシンC不活性化PMEF（5.0×10 6）の1バイアルを解凍します。 15％FBS、白血病阻害因子1,000単位/ ml、100μMの非必須アミノ酸、2mMグルタミン、55μM2-メルカプトエタノール、25単位/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有するES細胞培地（DMEM 5mlのに細胞を移します）、5分間100×gで遠心します。
- 上清を吸引除去し、2 T25フラスコ（それぞれ5ml）と2つの100 mmプレート（各10ml）の中に分散させることによって、続いてES細胞培地30mlに細胞を再懸濁。 24時間37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- C9 ES細胞を培養し、拡大
- 37℃の水浴中でC9 ES細胞の1バイアル（0.5 mlの2.5×10 6細胞）を解凍し、転送ES細胞培地5mlに細胞。 5分間100×gで遠心分離します。
- T25フィーダフラスコにプレーティングすることによって、その後上清およびES細胞培地5ml中に再懸濁したES細胞を吸引します。 37℃、5％CO 2でインキュベート....
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結果
典型的な突然変異誘発実験では、トランスフェクションは、PB-UPAとMPBトランスポゼースで3×10 7 ES細胞の合計で構成されています。 2つの独立した実験で生成された遺伝子トラップされたES細胞の数を表1に要約されている。遺伝子取り込みの効率は約0.04％です。組み合わせ遺伝子トラップライブラリは、マウスゲノム（23000コードする遺伝子）を完全にカバー約22,400の独立した変異体を含みます。過剰なカバレッジを繰り返し変異誘発を介して複数の変異体を生成し、および/またはプロセスをスケールアップすることによって達成することができます。
遺伝子トラップライブラリーは、ランダム変異を含むので、ストレス耐性の表現型を有する変異体の数を予測することは不可能です。 PQ抵抗のための2つの独立した選択を行いました。 22440独立した遺伝子トラップ突然変異の組み合わせスクリーニングはPQに対する細胞の抵抗（0.08％）（ 表1）を付与する17の変異を発見しました。
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ディスカッション
フォワード遺伝子解析により、特定の表現型に関与する遺伝子についてゲノムを偏りなく調べることができます。 この方法は、新しい遺伝子機能を明らかにするのに非常に強力です。 これは、主にそれに伴うインフラストラクチャとロジスティクスに関連する非常に高いコストのために、低等生物では広く使用されていますが、マウスなどの哺乳類では広く使用されていません。 ここでは、遺伝子スクリーニングプロセスをES細胞培養プラットフォームに移行し、変異体の生成と変異の同定における効率とスループットを大幅に向上させました。
耐性変異体を効果的に選択するには、致死量のストレッサーと治療期間を確立して、すべての野生型細胞が死滅させる必要があります。 選択の厳密さが高いほど、誤検知の発生は少なくなります。 線維芽細胞フィーダーは、ES細胞よりも酸化ストレスに対する耐性が高いです。フィーダーの存在は、ストレッサーによって死滅する近くのES細胞を救出します。 したがって、ストレス選択中のフィーダーの省略は、効果的な殺傷のために非常に重要でした。 皮膚線維芽細胞では、長命マウスのストレス耐性表現型を明らかにするために血.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBacトランスポゼースの贈り物に対して、ウェルカムトラストサンガー研究所に感謝したいと思います。 この研究は、コロラド州のブッチャー助成金とNIH R01 AG041801(W.S.C)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase mPBase | |||
| Puro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericupフィルター | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericupフィルター | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50 ml Steriflip-GV フィルター | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| &β;-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| 二塩化ビオロゲンメチル (パラコート) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| ジメチルスルホキシド Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% ゼラチン | EMD ミリポア | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% トリプシン-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 フラスコ | コーニング | 353108 | |
| T75フラスコ | コーニング | 353135 | |
| 100mm プレート | コーニング | 353003 | |
| 150mm プレート | コーニング | 430599 | |
| 96ウェル プレート | コーニング | 3585 | |
| 96ウェルU底プレート | コーニング | 3799 | |
| 24ウェルプレート | コーニング | 3526 | |
| 50mlリザーバー | Corning | 4870 | |
| 15 ml チューブ | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| 初代マウス胚性線維芽細胞 | EMD ミリポア | PMEF-NL | |
| DR4 マウス胚性線維芽細胞 | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | ||
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| ドキシサイクリン | フィッシャーバイオ試薬 | ||
| クライオチューブ | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (TC10用) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | バイオ・ラッド | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA クローニングキット | Life Technologies | 450030 | |
| 大容量cDNA合成キット | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100%エタノール | デコンラボラトリーズ(株) | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 塩酸 | フィッシャーバイオ試薬 | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| エチジウムブロマイド | フィッシャーバイオ試薬 | BP1302 | |
| 100 BP DNAラダー | ニューイングランドバイオラボ | N3231S | |
| 1 kb DNAラダー | ニューイングランドバイオラボ | N3232S | |
| 2ログDNAラダー | ニューイングランドバイオラボ | N3200L |
参考文献
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. M....
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