מאמר שיטה

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

21.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53085

⸱

7 באוקטובר 2015

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

תיקון סחוס מייצג אתגר רפואי שלא נענה וגישות מבוססות תאים להנדסת סחוס מפרקי אנושי הן פתרון מבטיח. כאן, אנו מתארים הידרוג'לים ביומימטיים תלת מימדיים (תלת מימדיים) ככלי אידיאלי להתרחבות והתבגרות של כונדרוציטים מפרקיים אנושיים.

תקציר

הסחוס המפרקי האנושי רגיש מאוד לנזק ויש לו פוטנציאל מוגבל לתיקון עצמי והתחדשות. אסטרטגיות מבוססות תאים להנדסת רקמת סחוס מציעות פתרון מבטיח לתיקון סחוס מפרקי. כדי לבחור את מקור התא האופטימלי לתיקון רקמות, חשוב לפתח פלטפורמת תרבית מתאימה לבחינה שיטתית של ההבדלים הביולוגיים והביומכניים בסחוס המהונדס ברקמות על ידי מקורות תאים שונים. כאן יישמנו פלטפורמת תרבית הידרוג'ל ביומימטית תלת מימדית (תלת מימדית) כדי לבחון באופן שיטתי את פוטנציאל התחדשות הסחוס של כונדרוציטים צעירים, בוגרים ואוסטאוארתריטיס (OA). ההידרוג'ל הביומימטי התלת-ממדי מורכב מרכיב סינתטי פולי (אתילן גליקול) ומרכיב ביו-אקטיבי כונדרויטין סולפט, המספק מיקרו-סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לתרבית כונדרוציטים במבחנה. בנוסף, הפיגום עשוי לשמש פוטנציאלית להעברת תאים לתיקון סחוס in vivo. ניתן להעריך רקמת סחוס מהונדסת בפיגום באמצעות ביטוי גנים כמותני, צביעה אימונופלואורסצנטית, בדיקות ביוכימיות ובדיקות מכניות. תוך שימוש בתוצאות אלה, הצלחנו לאפיין את פוטנציאל ההתחדשות הדיפרנציאלי של כונדרוציטים בגילאים שונים, הן ברמת ביטוי הגנים והן בתכונות הביוכימיות והביומכניות של רקמת הסחוס המהונדסת. ניתן ליישם את מודל התרבית התלת מימדית כדי לחקור את ההבדלים המולקולריים והתפקודיים בין כונדרוציטים ותאי אב משלבים שונים של התפתחות תקינה או חריגה.

מבוא

עם פוטנציאל התיקון העצמי המוגבל שלו, הסחוס המפרקי האנושי עובר נזקים בלתי הפיכים תכופים. מאמצים נרחבים מתמקדים כיום בפיתוח גישות יעילות מבוססות תאים לטיפול בפציעות סחוס מפרקיות. הצלחתם של טיפולים מבוססי תאים אלה תלויה מאוד בבחירת מקור תאים אופטימלי ובשמירה על פוטנציאל ההתחדשות שלו. כונדרוציטים הם מקור תאים נפוץ לתיקון סחוס, אך הם מוגבלים בהיצע ויכולים להתמיין במהלך התרחבות במבחנה בתרבית חד-שכבתית דו-ממדית ובכך להגביל את יצירת הסחוס ההיאליני שלהם 1.

מטרת פרוטוקול זה היא להקים פלטפורמת הידרוג'ל תלת מימדית למחקר השוואתי במבחנה של כונדרוציטים אנושיים מגילאים ומצבי מחלה שונים. בניגוד לתרבית דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, הידרוג'לים תלת מימדיים (3D) מאפשרים לכונדרוציטים לשמור על המורפולוגיה והפנוטיפ שלהם ומספקים סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית המאפשרת לכונדרוציטים לייצר רקמת סחוס 2,3. בנוסף למתן מבנה פיזי תלת מימדי לתרבית כונדרוציטים, הידרוג'לים מחקים את התפקוד של מטריצה חוץ-תאית של סחוס מקומי (ECM). באופן ספציפי, הכללת כונדרואיטין סולפט מתאקרילט מספקת מאגר פוטנציאלי לגורמים פרקריניים מופרשים 4 ומאפשרת פירוק בתיווך תאים ותחלופת מטריצה 5. למרות שמערכות תרבית הידרוג'ל תלת מימדיות רבות שימשו באופן נרחב במחקרים שונים כולל ג'ל אגרוז ואלגינט, השתמשנו במערכת תרבית תלת מימדית ביומימטית שיש לה כמה יתרונות מובהקים לתרבית כונדרוציטים. כונדרואיטין סולפט (CS) הוא מרכיב שופע בסחוס המפרקי והוכח כי ההידרוג'לים של PEG-CS משמרים ואף משפרים את הפנוטיפ הכונדרוגני ומקלים על פירוק ותחלופה של מטריצה בתיווך תאים 2,5. בנוסף, ניתן לווסת בקלות את התכונות המכניות של פיגום ההידרוג'ל על ידי שינוי ריכוז ה-PEG ומכאן שניתן להשתמש בהן כדי לשפר עוד יותר את פוטנציאל ההתחדשות של כונדרוציטים או סוג תא קשור 6,7. PEG/CSMA הוא גם תואם ביולוגית ולכן יש לו פוטנציאל ליישום קליני ישיר במומים בסחוס למשל. המגבלה של מערכת זו היא המורכבות שלה והשימוש בפוטופולימריזציה שיכול להשפיע על כדאיות התא בהשוואה למערכות פשוטות יותר כמו אגרוז, אולם היתרונות של תרבית הכונדרוציטים עולים על המגבלות הפוטנציאליות.

תרבית ההידרוג'ל התלת-ממדית תואמת לבדיקה קונבנציונלית להערכת פנוטיפ התא (ביטוי גנים, צביעה חיסונית של חלבון) ותוצאה תפקודית (כימות ייצור מטריצת סחוס, בדיקות מכניות). סביבה תלת מימדית חיובית זו נבדקה כדי להשוות את פוטנציאל התחדשות הרקמות של כונדרוציטים אנושיים משלוש אוכלוסיות גיל שונות בתרביות תלת מימד ארוכות טווח.

התוצאות הוערכו באמצעות מבחנים פנוטיפיים ופונקציונליים כאחד. כונדרוציטים צעירים, בוגרים ו-OA הראו תגובות דיפרנציאליות בתרבית הידרוג'ל ביומימטית תלת מימדית. לאחר 3 ו-6 שבועות, ביטוי הגנים הכונדרוגני היה מווסת בכונדרוציטים צעירים ובוגרים, אך היה מווסת בכונדרוציטים OA. שקיעה של רכיבי רקמת סחוס כולל אגרקן, קולגן מסוג II וגליקוזאמינוגליקן (GAG) הייתה גבוהה עבור כונדרוציטים צעירים ובוגרים אך לא עבור כונדרוציטים OA. מודולי הדחיסה של מבני הסחוס המתקבלים הציגו גם הם מגמות דומות. לסיכום, כונדרוציטים צעירים ובוגרים הפגינו נטייה כונדרוגנית ומטריצת סחוס עד 6 שבועות של תרבית תלת מימדית בהידרוג'לים. לעומת זאת, כונדרוציטים אוסטאוארתריטיס חשפו אובדן פנוטיפ סחוס ויכולת מינימלית לייצר סחוס חזק.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של נבדקי סטנפורד אדם האוניברסיטה ואישרו פרוטוקול Institutional Review Board.

1. בידוד Articular הכונדרוציטים

  1. להשיג סחוס מהרקמה שהושלכה במהלך החלפת מפרק הברך ולנתח כפי שתואר לעיל 8.
  2. מבחינה ויזואלית לבחור condyles הירך המדיאלי או לרוחב של דגימות סחוס למשטחים חלקים ולעשות חתך על פני השטח של הסחוס באמצעות אזמל כדי להסיר 4-5 ביופסיות סחוס מ"מ מבלי להשפיע על עצם subchondral.
  3. לבודד כונדרוציטים מהמטריצה ​​תאית על ידי ניתוק האנזימטית של הרקמה עם O טיפול / N עם collagenase המטוהר. השתמש 1: 1 יחס של Collagenase השני (125 U / ml) וCollagenase IV (160 U / ml) בתקשורת צמיחה הכונדרוציטים על 37 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, לסנן את הרקמה מתעכל המכיל את התאים ניתקו דרך 70מ"מ נקבובית רשת ניילון גודל. לשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של DMEM / F12 וצנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות.
  5. פלייט כונדרוציטים המבודדים בצפיפות של צלחת תרבות 1 x 10 6 תאים / 60 מ"מ הבא מחדש השעיה בDMEM / F12 בתוספת 10% העוברי בסרום שור (FBS), 25 מיקרוגרם / מיליליטר ascorbate, L-גלוטמין 2 מ"מ, אנטיביוטיקה (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / fungizone מיליליטר). שמור את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ולשמור על התרבויות הכונדרוציטים העיקריות כmonolayer צפיפות גבוהה לפני אנקפסולציה בהידרוג'ל biomimetic.

ייצור 2. Biomimetic Hydrogel

הערה: שיטה זו מאפשרת את הסינתזה של הידרוג'ל biomimetic המכיל פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA, גרם MW 5000 / שומה), סולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) בDPBS. התוספת של photoinitiator מאפשרת crosslinking photoactivated. הרכב הידרוג'ל הסופי מכיל 7% לשקולt / נפח (w / v) של PEGDA, 3% w / v של CS-MA, ושל 0.05% w / v של photoinitiator.

  1. לסנתז CS-MA ידי functionalizing פולימר CS עם קבוצות methacrylate.
    1. הכן את הפתרון שנאגרו של 50 מ"מ חומצה 2-morpholinoethanesulfonic (MES) ו0.5 M נתרן כלורי (NaCl) על ידי המסת 1.952 גרם של MES ו5.84 גרם של NaCl ב200 מיליליטר של מים ללא יונים (DiH 2 O). לפזר 5 גרם של מלח נתרן כונדרואיטין סולפט בפתרון שנאגרו.
    2. להוסיף .532 גרם (4.62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) ו1.771 גרם (9.24 mmol) 1-אתיל-3 (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride -carbodiimide (EDC) (יחס טוחנת של NHS: EDC = 1: 2) ל הפתרון ומערבבים במשך 5 דקות.
    3. להוסיף .765 גרם (4.62 mmol) methacrylate 2-aminoethyl (AEMA) (יחס טוחנת של NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) לפתרון ולשמור על התגובה ב RT למשך 24 שעות.
    4. לטהר את התערובת על ידי דיאליזה נגד מים ללא יונים (diH 2 O) במשך 4 ימים באמצעות צינורות דיאליזה (12-14 kDa MWCO).
    5. סנן את pפתרון urified דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולמקם את הצינורות הפתוחים המכילים את הפתרון בO הייבוש והוואקום / N. ודא שכל הצינורות מוגנים מפני אור. אחסן את הפולימר המומס ב -20 ° C המוגנים מפני אור ולחות.

Encapsulation 3. הסלולרי

  1. החיטוי מוטות סרט וגלילי PCR (על חבטות את הידרוג 3D תא-לאדן) ולעקר את תבנית ג'ל הגלילית מחוייט על ידי טבילה ב0.2 מיקרומטר אתנול 70% מסוננים במכסת מנוע בתרבית רקמה תחת אור UV.
  2. לאטום את תחתית תבנית ג'ל עם סרט PCR autoclaved ללא בועות אוויר או פערים כדי למנוע הדלפות. שמור את זה בצלחת 150 מ"מ סטרילי.
  3. היום לפני אנקפסולציה התא בהידרוג'ל biomimetic, לנתק את monolayer הכונדרוציטים בצפיפות גבוהה עם O טיפול / N בCollagenase השני ופתרון Collagenase IV. השתמש 125 U / ml לCollagenase השני ו -160 U / ml לCollagenase VI כל בצמיחה הכונדרוציטים תקשורתעל 37 מעלות צלזיוס.
  4. קח צינור 50 מ"ל ולהוסיף 5% במשקל / נפח (w / v) (diacrylate אתילן גליקול) פולי (PEGDA, MW = g 5000 / שומה), 3% w / סולפט-methacrylate נ 'כונדרואיטין (CS-MA), ו 0.05% w / v photoinitiator בDPBS. מערבולת הצינור לערבב את הפתרון ולשמור אותו בצד. להגן על הצינור מהאור.
  5. לאסוף את התאים ניתקו בצינור פלקון 50 מיליליטר, ולספור צנטריפוגות ב 460 XG במשך 5 דקות. לשאוב את כל התקשורת מצינור התאים ולהוסיף חומר ג'ל המעורב לעיל כדי מחדש להשעות תאים בצפיפות של 15 × 10 6 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו 30 פעמים ביסודיות, תוך הימנעות היווצרות בועות אוויר.
  6. פיפטה 72 μl של ההשעיה התא-הידרוג'ל או הידרוג'ל לבד לתוך תבנית ג'ל הגלילי מחוייט ולהשרות gelation באמצעות חשיפה לאור UV (365 ננומטר אורך גל) בשעה 3 mW / m 2 למשך 5 דקות. הכן כמה פתרון הידרוג'ל ללא תוכן סלולארי. השתמש במבנים אלה כפקדים שליליים לבדיקה ביוכימית ומכאנית העתיד. Measuמחדש את עוצמת אור UV עם מד עוצמת קרינת UV. כדי להתאים את עוצמת, לשנות את המרחק בין מקור אור UV ופיגום הידרוג'ל במהלך gelation.
    הערה: מאחר הידרוג'ל מכיל CS, תרומת acellular יורדת מתוכן GAG ביוכימיים של הידרוג'ל התא-לאדן לייצג GAG הסלולרי בלבד.
  7. השתמש באזמל כדי לחתוך את הסרט לקליפה קלה והסר אותו בזהירות. בעזרת המוטות גליליות, לדחוף את הג'ל לתוך צלחת גם 6 עם 5 מיליליטר של DPBS סטרילי כדי לשטוף את הג'ל unpolymerized ותאים רופפים.
  8. תרבות הידרוג התא-לאדן ב -24 צלחות גם מכילות 1.5 מיליליטר של תקשורת צמיחה הכונדרוציטים לכל אחד. השתמש במרית חד פעמית להעביר את הידרוג שטף לתוך הבאר.
  9. להעריך את כדאיויות תא על ידי צביעת 24 הודעה אנקפסולציה-שעות מתות החי באמצעות ערכת הכדאיות / cytotoxity. תרבות הידרוג התא-לאדן והידרוג הריק במשך 3-6 שבועות משתנה לGro הכונדרוציטים הטריwth תקשורת כל 2 ימים לפני קציר לניתוחים.

4. ניתוח ביטוי RNA חילוץ וג'ין

  1. בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק.
  2. בעזרת מרית סטרילי, להעביר את כל הידרוג'ל לצינור Eppendorf נקי 1.5 מיליליטר ולהוסיף 250 μl של Tri-מגיב על צינור אחד. עקוב אחר ההוראות של היצרן לבודד RNA.
  3. לאחר בידוד RNA וכימות שימוש 1 מיקרוגרם שלו מכל מדגם ולבצע שעתוק הפוך לcDNA באמצעות הקיבולת גבוהה cDNA הפוך תמלול ערכה.
  4. לPCR כמו להשתמש מערכי ביטוי גני TaqMan לבחינת הביטוי של גני עניין שלך. לנרמל את רמות ביטוי גנים פנימיים לGAPDH.
  5. לתנאי PCR כולל דגירה 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס כדי להשבית amplicons הקודמת עם glycosylase אורציל-דנ"א, ואחריו 1060; דקות דגירה על 95 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את פולימראז תקי. ואז לבצע מחזורים ארבעים של PCR, בהיקף של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C.

5. ניתוח ביוכימיה

  1. לכל מבני תא-הידרוג'ל לכמת DNA וייצור glycosaminoglycan הגופריתי (sGAG) כדלקמן.
  2. בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק. לשקול צינור ריק ולשים בתוך הידרוג'ל לאחר סופג את זה על נייר ולרשום את המשקל או המשקל רטוב של הידרוג'ל.
  3. להקפיא כל הידרוג'ל ב -20 ° C בצינור 1.5 מיליליטר נפרד eppendorf לעיכול אנזימטי ולאחר מכן להשתמש aliquot של המוצר מתעכל לרוץ assay PicoGreen (לDNA) וassay הכחול דימתיל-מתילן (לGAG).
  4. הכן את פתרון papainase לעיכול אנזימטי של הידרוג'ל.
    1. ראשון להכין את חיץ PBE על ידי שקילה מתוך 7.1 גרם של נתרן phosphatdibasic דואר (Na 2 4 HPO) ו -1.6 גרם של מלח disodium חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA-Na 2). ממיסים בכ -500 מיליליטר של DH 2 O, להתאים את ה- pH 6.5 ולסנן את הפתרון המטוהר דרך מסנן 0.22 מ"מ.
    2. ממיסים 0.035 גרם של L-ציסטאין ב 20 מיליליטר של חיץ PBE. סנן את הפתרון ושל אנזים פפאין סטרילי 100 μl.
  5. כאשר מוכן לבצע את מבחני, לקחת את הצינורות מ-20 ° C ולהוסיף 300 μl של פתרון פפאין מוכן הידרוג הקפוא. למחוץ את הג'ל עם מכתש ועלי ולערבב אותו היטב עם העלי המנוע.
  6. תביא את הנפח 500 μl עם פתרון פפאין נוסף. בצע את אותו ההליך לג'לי השליטה. לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות 3,9. התמיסה המכילה הידרוג'ל מתעכל ולכן יכולה לשמש לדנ"א וכימות GAG. מדוד את תוכן ה- DNA באמצעות assay PicoGreen עם DNA הפאג מבדה כסטנדרט הבא יחסי הציבור של היצרןotocol.
  7. לכמת את התוכן הגופריתי-GAG באמצעות כחול 1.9-dimethylmethylene (DMMB) assay מחייב צבע עם כונדרואיטין סולפט הכריש כמו 10 סטנדרטיים. לקבוע את תוכן GAG על ידי חלוקת הסך של GAG למשקל הרטוב המקביל.

6. מכאני בדיקה

  1. לבצע בדיקות דחיסת unconfined באמצעות מערכת בדיקת Instron 5944 מצוידות בתא מטען 10 N.
    1. לאחר הימים הרצויים של תרבות במבחנה, לבצע את בדיקת הדחיסה על פיגום התא-הידרוג'ל והידרוג שליטת acellular.
    2. להטביע את הדגימות באמבט PBS ב RT ולדחוס בשיעור של 1% מתח / sec למתח מרבי של 15% מאז 11,12 המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20% 13,14.
  2. ליצור מתח לעומת עקומות מתח וכושר עקום באמצעות משוואת פולינום סדר שלישי. לקבוע comprמודול משיק essive ממשוואת הכושר העקום בערכי מתח של 15%.

תוצאות

הידרוג ביו המכיל PEG וmoieties CS (איור 1) מייצג פלטפורמה אידיאלית לתרבות והתבגרות של 2,3,5,7 כונדרוציטים במפרק אנושיים. כונדרוציטים מגילים שונים ומצבי מחלה יכולים להיות מתורבת בשיטה שתוארה ונותחו לפנוטיפ, ביטוי גנים שלהם ומאפיינים ביוכימיים ומכאניים של רקמת הסחוס שנוצרה. שלוש דגימות הכונדרוציטים, juvenile- 6 חודשים, למבוגר 34 שנים וosteoarthritic- 74 שנים, נקצרו לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג'ל biomimetic 3D. ביטוי גני מנתח של כונדרוציטים רגילים, שניהם צעירים ומבוגר, הראה עלייה בביטוי של גנים הכונדרוציטים Col2a1 וCol6a1. להיפך, כונדרוציטים חולים הראו ירידה דרמטית בCol2a1 תוך שמירה על הביטוי של Col6a1 (איור 2) מראה הפסד של פנוטיפ chondrogenic למרות היותו מתורבת בסביבת biomimetic חיובית.

גם הידרוג CS-PEG לשמש כסביבה דינמית לכונדרוציטים להתרבות, לעכל את המטריצה ​​קיימת מראש של PEG וCS ולהפקיד מטריצת pericellular והתאית שלהם, המרכיבים העיקריים של רקמת הסחוס הבוגרת. בהתחשב ביכולות אלה, הרחבה הכונדרוציטים לאחר 3 שבועות של תרבות במבחנה יכולות להיות מוערכות על ידי כימות של ה- DNA עם צבע PicoGreen. ניתוח השוואתי של שלוש הקבוצות של תאים מראה כי צפיפות התאים של אוכלוסיות לנוער ומבוגרים הייתה ללא שינוי ואילו כונדרוציטים OA הציגו ירידה דרמטית בהשוואה ליום 1 של התרבות. אובדן תוכן DNA נצפה גם עבור OA אבל לא כונדרוציטים אחרים המצביעים על מוות של תאים אפשריים במהלך התרבות לטווח הארוך (איור 3). המטריצה ​​המופרשת הייתה לכמת כתוכן הגופריתי-GAG ידי assay מחייב צבע DMMB בשלב נקודת סיום לאחר 3 שבועות של תרבויות. תוכן GAG מנורמל על ידי המשקל הרטוב של הידרוג'ל כrecorded לפני עיכול אנזימטי ותרומת acellular מופחת. כפי שניתן לראות באיור 4, כונדרוציטים הופקדו סכום משמעותי דומה של GAG במהלך 3 שבועות של התרבות בהידרוג 3D.

נוכחותו של פיגום פיזי מאפשרת ההערכה של נכסים ביו-מכאניים של הדגימות באמצעות 2,3 בדיקות דחיסת unconfined. בעוד הידרוג acellular לעבור ירידה בmoduli הדחיסה, בונה תאים העמוסים נשמרה moduli הדחיסה לאחר 3 שבועות בתרבות (איור 4). פנוטיפי, ניתוחים ביוכימיים וביו-מכאניים שתוארו כאן הם אפוא שימושי להערכה והבנת הפוטנציאל של אוכלוסיות שונות להכונדרוציטים סחוס הנדסה.

figure-results-1
איור 1. הידרוג biomimetic PEG-CS לרחוב ללא הכונדרוציטים 3Dture. כונדרוציטים הם resuspended בתערובת המכילה פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA) וסולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) ויציקה לתוך תבנית ג'ל הגלילית מחוייט. לאחר חשיפה לקרינת UV, הגדילו את ג'לי נאספים מהתבניות וכדאיויות תא מוערכת על ידי צביעה המתה חי פוסט-אנקפסולציה 24 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. ביטוי של גני chondrogenic בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. ביטוי גני כמותי של סמני סחוס Col2a1 וCol6a1 ידי כונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג'ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ביטוי גן ביום ב 1. שגיאהערס מייצג ממוצע ± SD. * P <0.05, כפי שנקבע על ידי מבחן t סטודנטים שני זנב. שונה מSmeriglio et al. 2 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
תוכן איור 3. DNA בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. כימות DNA על ידי assay PicoGreen בכונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג'ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ה- DNA ביום 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור תוכן מדידת 4. GAG ובדיקת דחיסת unconfined של כונדרוציטים אנושיים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג'ל biomimetic 3D. () כימות GAG ידי assay DMMB בכונדרוציטים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של תרבות ב הידרוג biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים להרטיב משקל (ww) והביעו כמיקרוגרם / g. (ב) מודולוס לחיצה (kPa) של הידרוג'ל acellular ותא-לאדן ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג'ל biomimetic 3D. אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

כפי שדווח בפרוטוקול זה, הידרוג 3D הם מסוגלים לשמור על הפנוטיפ הכונדרוציטים בתרבות, הימנעות התהליך של dedifferentiation תא לתאי fibrocartilage נתקלו בדרך כלל בתרבויות monolayer 15. יתר על כן, תרבויות לטווח ארוך של מבנה הידרוג'ל chondrocytes- חשפו סביבה נוחה השומרת על תכונות תא הפנימיות הקשורים לגיל ומחלה.

השימוש בהידרוג'ל biomimetic 3D יש מספר יתרונות. ראשית, הכללתו של כונדרואיטין סולפט (CS), מרכיב עיקרי שנמצא בסחוס במפרק, מאפשר לתאים לבזות את מטריצת הידרוג'ל על ידי הפרשת chondroitinase ונשכב סחוס מסונתז חדש נוספת הסלולר מטריצה ​​5, 16. בנוסף, CS הוכח יש תכונות אנטי דלקתיות במפרק דלקת פרקים. גם הידרוג'ל biomimetic עשוי לשמש כחומר פיגומים למסירת תא בתיקון סחוס, ועשוי להיות שינוי כימיכדי להקל 17,18 שילוב רקמות ביולוגי טוב יותר.

השימוש בהידרוג PEG-CS מאפשר טווח ארוך תרבויות של כונדרוציטים וההערכה של נכסים ביוכימיים ומכאניים. כאן אנו מראים כיצד פלטפורמה זו יכולה להיות שימושית עבור הניתוחים ההשוואתיים של מקורות שונים של כונדרוציטים מובחנים כדי להגדיר את סוג התא האופטימלי להנדסת סחוס. מעניין לציין, כונדרוציטים במארז בהידרוג'ל להישאר קיימא ולהתרבות על פי היכולות הפנימיות שלהם. תומך הרכב הידרוג'ל, למעשה, הצמיחה של כונדרוציטים לנוער ומבוגרים בריאים, כפי שמוצגת באיור 2. הרכב והמבנה של הידרוג'ל תאר גם מקדמים היווצרות רקמת סחוס כפי שצוין על ידי התצהיר של מטריקס תפקודי הוערך על ידי glycosaminoglycan (GAG כימות).

יתרון נוסף הוא שהמבנים הכונדרוציטים-הידרוג'לניתן להעריך לתכונות מכאניות של רקמת הסחוס החדש שנוצרה. שים לב שבדיקת דחיסת unconfined צריכה להתבצע על הידרוג'ל acellular להשוואה. הידרוג'ל, למעשה, יש לי נוקשות פנימיות בשל הקשיחות של moieties CS. זן unconfined דחיסה של 5-20% (בשיעור של 1% מתח / ים) יכול להיות מיושם לבדיקה המכנית של רקמת סחוס 11,12 מאז את המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20 % 13,14. התגובה של הידרוג'ל שני התאים-לאדן וacellular לבדיקות מכאניות הוערכה בסוף נקודות התרבות. בדוגמא שתוארה לעיל צפינו קשיחות דומה של המבנים המכילים כונדרוציטים מבוגרים ונוער בניגוד לקשיחות הנמוכה של המבנים המכילים כונדרוציטים OA. תכונות מכאניות כזה של מבנה התא-הידרוג'ל מאפשרות ההערכה של המאפיינים הפונקציונליים שלרקמה שנוצרה נותנת ניתוח מעמיק של יכולת התבגרות תא.

לסיכום, השימוש בהידרוג'ל biomimetic 3D כדי לחקור את הפוטנציאל של אוכלוסייה הכונדרוציטים שונה כדי ליצור רקמת סחוס יכול להיות מיושם באופן נרחב. מלבד המחקרים במבחנה המתוארים כאן, השתלת in vivo של מבני התא-לאדן יכולה להיות שחזתה ללמוד התבגרות תא ופוטנציאל התחדשות בהקשר הפיזיולוגי. שינויים נוספים של פלטפורמת הידרוג'ל עם גורמי biomimetic נוספים יכולים להיות גם חזה כדי לייעל התפשטות הכונדרוציטים והתבגרות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות למחלקה לכירורגיה אורתופדית של סטנפורד ולמענק זרעי התרגום של סטנפורד קולטר על המימון. J.H.L. רוצה להודות למלגת בוגרי הקרן הלאומית למדע ולמלגת הדוקטורט של DARE על התמיכה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כונדרוציטים צעירים (Clonetics מערכת תאי כונדרוציטים אנושית רגילה)LonzaCC-2550
כונדרוציטים בוגרים (Clonetics מערכת תאי כונדרוציטים אנושית רגילה)LonzaCC-2550
פולי (אתילן גליקול דיאקרילט)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-morpholinoethanesulfonic acidSigmaM5287
פוטו-יוזםIrgacure 2959
נתרן כלורי SigmaS9888
כונדרויטין סולפט מלח נתרן סיגמאC9819
N-הידרוקסיסוקסימיד Sigma130672
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochlorideSigmaE1769
2-aminoethyl methacrylateSigma516155
צינורות דיאליזהSpectrum Laboratories 132700
קולגנאז 2וורת'ינגטון ביוכימיה 
קולגנאז 4וורת'ינגטון ביוכימיה 
מדיה DMEM/F12HyClone, Thermo Scientific SH3002301 
מבחן חי/מתLife TechnologiesL3224
Tri ReagentLife TechnologiesAM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInvitrogenP11496
נתרן פוספט דו-בסיסי SigmaS3264
Ethylenediaminetetraacetic חומצה מלח דיסודיום סיגמאE5134
L-ציסטאיןסיגמאC1276
1,9-דימתילן כחול Sigma341088
Instruments
ציוד תאורת UV - מנורת ספסל XX-15LW, 365 ננומטרUVP95-0042-07
מערכת בדיקה Instron 5944 תאגיד אינסטרוןE5940
LS004177LS004189

מקורות

  1. Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
  2. Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  3. Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553(2013).
  4. Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
  5. Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
  6. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
  7. Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  8. Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
  9. Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
  10. Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
  11. Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
  12. Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
  13. Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
  14. Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
  15. Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
  16. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
  17. Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
  18. Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מתיל-אקרילט של כונדרויטין סולפטפוליאתילן גליקול דיאקרילטהפרדה אנזימטיתפוטו-פולימריזציה ב-UVבדיקות מכניותניתוח ביטוי גניםצביעה אימונופלואורסצנטית
3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.