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用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

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DOI：

10.3791/53085

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2015年10月7日

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。

摘要

人类关节软骨极易受损，且自我修复和再生能力有限。基于细胞的策略为工程化构建软骨组织以修复关节软骨提供了有前景的解决方案。为了选择用于组织修复的最佳细胞来源，建立一个合适的培养平台，系统地评估不同细胞来源所构建的组织工程软骨在生物学和生物力学方面的差异至关重要。本文采用一种三维（3D）仿生水凝胶培养平台，系统地评估了儿童期、成年期以及骨关节炎（OA）软骨细胞的软骨再生潜力。该3D仿生水凝胶由合成组分聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）和生物活性组分硫酸软骨素组成，为软骨细胞的体外（in vitro）培养提供了生理相关的微环境。此外，该支架还可有望用于体内（in vivo）软骨修复过程中的细胞递送。在该支架中构建的工程化软骨组织可通过定量基因表达分析、免疫荧光染色、生化检测以及力学测试进行评估。利用这些检测手段，我们能够在基因表达水平以及工程化软骨组织的生化和生物力学特性方面，表征不同年龄来源软骨细胞的再生潜力差异。该3D培养模型可用于研究来自正常或异常发育不同阶段的软骨细胞及前体细胞之间的分子与功能差异。

引言

由于人类关节软骨的自我修复能力有限，常发生不可逆的损伤。目前大量研究致力于开发高效的基于细胞的治疗方法，以修复关节软骨损伤。这些细胞治疗的成功在很大程度上取决于最佳细胞来源的选择及其再生潜能的维持。软骨细胞是软骨修复常用的细胞来源，但其供应量有限，且在体外培养过程中可能发生去分化 体外 在二维单层培养中扩增，从而限制了透明软骨的生成 1.

本实验方案的目的是建立一种三维水凝胶平台，用于 体外 不同年龄和疾病状态下人软骨细胞的比较研究。与传统的二维（2D）培养不同，三维（3D）水凝胶可使软骨细胞维持其形态和表型，并提供一种生理相关的环境，使软骨细胞能够生成软骨组织 2,3除了为软骨细胞培养提供三维物理结构外，水凝胶还能模拟天然软骨细胞外基质（ECM）的功能。特别是，硫酸软骨素甲基丙烯酸酯的引入可为分泌的旁分泌因子提供潜在的储存库。 4 并促进细胞介导的降解和基质更新 5尽管许多三维水凝胶培养系统（包括琼脂糖和海藻酸盐凝胶）已在各类研究中被广泛使用，但我们采用了一种具有某些独特优势的仿生三维培养系统用于软骨细胞培养。硫酸软骨素（CS）是关节软骨中的丰富组分，而研究表明，PEG-CS水凝胶能够维持甚至增强软骨生成表型，并促进细胞介导的基质降解与更新 2,5此外，通过改变聚乙二醇（PEG）的浓度可轻松调节水凝胶支架的力学性能，因此可用于进一步增强软骨细胞或相关细胞类型的再生潜能。 6,7PEG/CSMA 具有良好的生物相容性，因此在软骨缺损等临床应用方面具有直接应用的潜力。该体系的局限性在于其复杂性以及光聚合过程的使用，与琼脂糖等较简单的体系相比，光聚合可能影响细胞活力；然而，其在软骨细胞培养方面的优势超过了潜在的局限性。

三维水凝胶培养可与常规检测方法兼容，用于评估细胞表型（基因表达、蛋白质免疫染色）和功能结果（软骨基质生成的定量、力学测试）。该良好的三维环境已被用于在长期三维培养中，比较来自三个不同年龄人群的人软骨细胞的组织再生潜力。

通过表型和功能检测评估了实验结果。在三维仿生水凝胶培养中，幼年、成年和骨关节炎（OA）软骨细胞表现出不同的反应。培养3周和6周后，幼年和成年软骨细胞的软骨生成相关基因表达上调，而OA软骨细胞则下调。幼年和成年软骨细胞能够大量沉积包括聚集蛋白聚糖、II型胶原和糖胺聚糖（GAG）在内的软骨组织成分，而OA软骨细胞则不能。所形成的软骨构建物的压缩模量也呈现类似趋势。综上所述，幼年和成年软骨细胞在水凝胶三维培养中可持续表现出软骨生成能力及软骨基质沉积能力，长达6周；相比之下，骨关节炎软骨细胞则表现出软骨表型丧失，且生成稳定软骨的能力极为有限。

方案

所有实验均遵循斯坦福大学人体受试者指南，并经机构审查委员会批准的方案核准。

1. 关节软骨细胞的分离

  1. 在全膝关节置换术中获取废弃的软骨组织，并按照先前所述方法进行解剖8。
  2. 肉眼选择软骨样本中外侧或内侧股骨髁表面光滑的区域，用手术刀在软骨表面做切口，以获取4-5 mm的软骨活检组织，注意不损伤软骨下骨。
  3. 通过使用纯化的胶原酶对组织进行过夜（O/N）酶解消化，从细胞外基质中分离软骨细胞。在软骨细胞生长培养基中，使用1:1比例的胶原酶II（125 U/ml）和胶原酶IV（160 U/ml），于37 °C条件下进行处理。
  4. 次日，将消化后的含有解离细胞的组织通过孔径为70 mm的尼龙滤网过滤。用20 ml DMEM/F12洗涤两次，然后在600 x g条件下离心5分钟。
  5. 将分离得到的软骨细胞以1 × 106 个细胞/60 mm培养皿的密度接种，接种前用添加了10%胎牛血清（FBS）、25 µg/ml 抗坏血酸、2 mM L-谷氨酰胺以及抗菌剂（100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和0.25 µg/ml 两性霉素B）的DMEM/F12重悬细胞。将培养皿置于37 °C培养箱中，将原代软骨细胞以高密度单层形式培养，直至包封于仿生水凝胶中。

2. 仿生水凝胶的制备

注意：该方法可用于合成一种仿生水凝胶，其组分包含聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，分子量 5,000 g/mol）、甲基丙烯酰化软骨素硫酸酯（CS-MA）及 Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（DPBS）。加入光引发剂可实现光活化交联。最终水凝胶的组成为 7% 质量/体积（w/v）PEGDA、3% w/v CS-MA 和 0.05% w/v 光引发剂。

  1. 通过将CS聚合物与甲基丙烯酸酯基团功能化来合成CS-MA。
    1. 将1.952 g的2-吗啉乙磺酸（MES）和5.84 g氯化钠（NaCl）溶解于200 ml 去离子水（DiH2O）中，配制50 mM MES和0.5 M NaCl的缓冲溶液。将5 g硫酸软骨素钠盐溶解于该缓冲溶液中。
    2. 向溶液中加入0.532 g（4.62 mmol）N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1.771 g（9.24 mmol）1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）（NHS:EDC摩尔比为1:2），搅拌5分钟。
    3. 向溶液中加入0.765 g（4.62 mmol）2-氨基乙基甲基丙烯酸酯（AEMA）（NHS:EDC:AEMA摩尔比为1:2:1），在室温下维持反应24小时。
    4. 使用透析袋（截留分子量12–14 kDa）将混合物在去离子水（diH2O）中透析纯化4天。
    5. 将纯化后的溶液经0.22 μm滤膜过滤，将装有溶液的敞口试管置于干燥器中真空干燥过夜。确保所有试管避光保存。将溶解的聚合物在-20 °C下避光、防潮保存。

3. 细胞包封

  1. 将PCR膜和圆柱形棒（用于取出含细胞的3D水凝胶）进行高压灭菌，并在组织培养罩内用0.2 µm过滤的70%乙醇浸泡，对自制的圆柱形凝胶模具进行消毒，同时开启紫外灯照射。
  2. 用已灭菌的PCR膜密封凝胶模具底部，确保无气泡或缝隙，以防泄漏。将模具置于无菌的150 mm培养皿中备用。
  3. 在将细胞包埋于仿生水凝胶的前一天，使用胶原酶II和胶原酶IV溶液在37 °C条件下过夜（O/N）消化高密度软骨细胞单层。胶原酶II使用浓度为125 U/ml，胶原酶VI使用浓度为160 U/ml，均溶于软骨细胞生长培养基中。
  4. 取一个50 ml离心管，加入5%质量/体积（w/v）的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，分子量=5,000 g/mol）、3% w/v的硫酸软骨素甲基丙烯酰化衍生物（CS-MA）以及0.05% w/v的光引发剂，溶于DPBS中。涡旋混匀后静置，避光保存。
  5. 将消化后的细胞收集至50 ml Falcon管中，计数后在460 × g条件下离心5分钟。吸除所有培养基，加入上述混合好的凝胶材料，重悬细胞至密度为15×106 个细胞/ml。反复吹打混匀约30次，注意避免产生气泡。
  6. 用移液器将72 µl含细胞的水凝胶悬液或纯水凝胶溶液加入自制的圆柱形凝胶模具中，随后在365 nm波长紫外光下（光强3 mW/m2）照射5分钟以诱导凝胶化。另制备部分不含细胞的水凝胶溶液，作为后续生化与力学测试的阴性对照。使用紫外光强度计测量光照强度；如需调节强度，可通过改变紫外光源与水凝胶支架之间的距离实现。
    注意：由于该水凝胶含有CS，因此在分析含细胞水凝胶的生化GAG含量时，需减去无细胞组分的贡献，以准确反映细胞来源的GAG含量。
  7. 使用手术刀在膜上划切以便于剥离，小心揭去膜。借助圆柱形棒将凝胶推出，转移至含5 ml无菌DPBS的6孔板中，以洗去未聚合的凝胶材料和松散细胞。
  8. 将含细胞的水凝胶置于24孔板中培养，每孔加入1.5 ml软骨细胞生长培养基。使用一次性刮铲将清洗后的水凝胶转移至各孔中。
  9. 包封后24小时，采用活/死细胞染色法（使用细胞活力/细胞毒性检测试剂盒）评估细胞存活率。将含细胞和不含细胞的水凝胶均培养3–6周，每隔2天更换新鲜的软骨细胞生长培养基，之后收集样品进行分析。

4. RNA 提取与基因表达分析

  1. 小心吸除培养基，并向含有细胞的水凝胶以及空白对照水凝胶中加入无菌的 1× PBS。
  2. 借助无菌刮勺，将每个水凝胶转移至洁净的 1.5 ml 离心管中，并向每管加入 250 µl 的 Tri-reagent。按照试剂盒说明书操作，提取 RNA。
  3. 在完成 RNA 提取与定量后，从每个样本中取 1 µg RNA，使用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 将其逆转录为 cDNA。
  4. 进行定量 PCR 时，使用 TaqMan 基因表达检测阵列来分析目的基因的表达水平。以内参基因 GAPDH 对基因表达水平进行归一化处理。
  5. PCR 反应条件设置如下：首先在 50 °C 孵育 2 min，以尿嘧啶-DNA 糖基化酶降解前一轮扩增产物；随后在 95 °C 孵育 10 min，以激活 Taq DNA 聚合酶。接着进行 40 个循环的 PCR 扩增，每个循环包括 95 °C 变性 15 sec ，60 °C 退火与延伸 1 min 。

5. 生物化学分析

  1. 对每种细胞-水凝胶构建体，按如下步骤定量检测DNA和硫酸化糖胺聚糖（sGAG）的生成量。
  2. 小心吸除培养基，并向含细胞的水凝胶及空白对照水凝胶中加入1×无菌PBS。称量一个空离心管的重量，将水凝胶用滤纸轻拭吸干后放入管中，记录水凝胶的重量（即湿重）。
  3. 将每个水凝胶置于独立的1.5 ml离心管中，在-20 °C下冷冻，用于后续酶解消化；之后取部分消化产物用于Picogreen法（用于DNA）和二甲基亚甲蓝法（用于GAG）检测。
  4. 准备用于水凝胶酶解的木瓜蛋白酶溶液。
    1. 首先配制PBE缓冲液：称取7.1 g磷酸氢二钠（Na2HPO4）和1.6 g乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2），溶于500 ml去离子水（dH2O）中，调节pH至6.5，并通过0.22 mm滤器过滤除菌。
    2. 将0.035 g L-半胱氨酸溶于20 ml PBE缓冲液中，过滤该溶液后加入100 µl无菌木瓜蛋白酶。
  5. 当准备进行检测时，从-20 °C取出离心管，向每个冻结的水凝胶中加入300 μl已配制好的木瓜蛋白酶溶液。用研钵和研杵将凝胶碾碎，并充分混匀。
  6. 用额外的木瓜蛋白酶溶液将总体积补至500 µl。对对照组水凝胶执行相同操作。在60 °C下孵育16小时3,9。所得的水凝胶消化液可用于DNA和GAG的定量分析。按照试剂盒说明书，使用λ噬菌体DNA作为标准品，通过Picogreen法测定DNA含量。
  7. 采用1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB）染料结合法，以鲨鱼软骨素硫酸盐作为标准品，定量检测硫酸化GAG含量10。通过将GAG含量除以对应的湿重，计算单位湿重中的GAG含量。

6. 力学测试

  1. 使用配备10 N载荷传感器的Instron 5944测试系统进行无侧限压缩试验。
    1. 在所需的天数后 体外 对细胞-水凝胶支架和无细胞对照水凝胶进行压缩试验。
    2. 将样本浸入室温的PBS溶液中，以1%应变/秒的速率进行压缩，最大应变至15% 11,12 由于已有研究报道，在负荷条件下软骨组织所经历的生理应变可达10–20% 13,14.
  2. 绘制应力-应变曲线，并使用三阶多项式方程进行曲线拟合。根据曲线拟合方程，确定在15%应变值下的压缩切线模量。

结果

含有聚乙二醇（PEG）和壳聚糖（CS）官能团的生物活性水凝胶（图1）是培养和促进人关节软骨细胞成熟的一种理想平台2,3,5,7。不同年龄和疾病状态的软骨细胞均可采用所述方法进行培养，并对其表型、基因表达以及所生成软骨组织的生化和力学特性进行分析。在三维仿生水凝胶中培养3周后，分别获取了三种软骨细胞样本：幼年（6个月）、成年（34岁）和骨关节炎患者（74岁）。对正常软骨细胞（包括幼年和成年）的基因表达分析显示，软骨细胞基因Col2a1和Col6a1的表达均有所上升。相反，病变软骨细胞中Col2a1的表达显著下降，而Col6a1的表达则保持不变（图2），表明即使在有利的仿生微环境中培养，其软骨生成表型仍出现明显丧失。

CS-PEG水凝胶还为软骨细胞提供了一个动态环境，使其能够增殖，降解已有的PEG和CS基质，并沉积其细胞周基质和细胞外基质，这些正是成熟软骨组织的主要成分。鉴于这些特性，软骨细胞在培养3周后的扩增情况 体外 可通过Picogreen染料对DNA进行定量来估算细胞培养密度。对三组细胞的比较分析显示，幼年和成年软骨细胞的细胞密度在培养期间保持不变，而骨关节炎（OA）软骨细胞与培养第1天相比则显著减少。此外，观察到OA软骨细胞的DNA含量下降，而其他软骨细胞则无此现象，提示在长期培养过程中可能发生细胞死亡图3）。在培养3周后的终点阶段，通过DMMB染料结合法测定分泌的基质中硫酸化糖胺聚糖（sulfated-GAG）含量。GAG含量以水凝胶湿重进行归一化处理，湿重数据为酶消化前记录值，并扣除无细胞组分的贡献。如图所示 图4在三维水凝胶中培养3周后，软骨细胞沉积了相似的显著数量的糖胺聚糖。

通过无侧限压缩试验，物理支架的存在使得能够评估样品的生物力学特性2,3。尽管无细胞水凝胶的压缩模量会下降，但载有细胞的构建物在培养3周后仍保持了压缩模量（图4）。因此，本文所述的表型、生物化学和生物力学分析方法可用于评估和理解不同软骨细胞群体在软骨组织工程中的潜力。

细胞包封过程示意图，显示PEGDA/CS-MA水凝胶及活力检测结果。
图1. 用于软骨细胞三维培养的PEG-CS仿生水凝胶。将软骨细胞重悬于含有聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和甲基丙烯酰化软骨素硫酸酯（CS-MA）的混合溶液中，并注入自制的圆柱形凝胶模具。经紫外光照射后，从模具中取出固化后的凝胶，并在包封后24小时通过活/死细胞染色法评估细胞活力。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析，Col2a1，Col6a1，柱状图，倍数变化，青少年，成人，衰老，实验。
图 2. 三维仿生水凝胶培养的人软骨细胞中软骨形成相关基因的表达。 青少年、成人及骨关节炎（OA）软骨细胞在三维仿生水凝胶中培养 3 周后，软骨标志物 Col2a1 和 Col6a1 的定量基因表达分析。数据已标准化至第 1 天的基因表达水平。误差线表示均值±标准差（SD）。*p <0.05，由双尾 Student t 检验确定。改编自 Smeriglio et al. 2 请点击此处查看该图的放大版本。

幼年、成年及骨关节炎患者软骨细胞中相对DNA含量；第3周实验的时间序列柱状图比较。
图3. 在三维仿生水凝胶中培养的人软骨细胞的DNA含量。通过PicoGreen法对幼年、成年及骨关节炎（OA）软骨细胞在三维仿生水凝胶中培养3周后的DNA含量进行定量。数值已标准化至第1天的DNA水平。请点击此处查看该图的放大版本。

软骨细胞GAG合成、力学模量实验、柱状图、第1天与第3周水凝胶数据。
图4. 人软骨细胞在3D仿生水凝胶中培养第1天及培养3周后的GAG含量测定与无侧限压缩试验。 (A) 通过DMMB法测定软骨细胞在3D仿生水凝胶中培养第1天及3周后的GAG含量。数值以湿重（w.w.）归一化，单位为 µg/g。 (B) 无细胞及含细胞水凝胶在3D仿生水凝胶中培养第1天及3周后的压缩模量（kPa）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

如本方案所述，三维水凝胶能够在培养过程中维持软骨细胞表型，避免单层培养时通常出现的细胞去分化为纤维软骨细胞的现象15。此外，软骨细胞-水凝胶构建物的长期培养表明，该环境有利于维持与年龄和疾病相关的细胞固有特性。

使用三维仿生水凝胶具有多个优势。首先，硫酸软骨素（CS）是关节软骨中的主要成分之一，其存在可使细胞通过分泌软骨素酶降解水凝胶基质，并沉积新合成的软骨细胞外基质5, 16。此外，研究表明硫酸软骨素在关节炎关节中具有抗炎特性。该仿生水凝胶还可作为软骨修复中细胞递送的支架材料，并可通过化学修饰以促进组织与生物材料之间的更好整合17,18。

使用PEG-CS水凝胶可实现软骨细胞的长期培养，并用于评估其生化与力学特性。本文展示了该平台如何有助于对不同来源的分化软骨细胞进行比较分析，从而确定软骨组织工程中最优的细胞类型。有趣的是，包埋于水凝胶中的软骨细胞能够保持活性，并根据其固有的能力进行增殖。事实上，如图2所示，该水凝胶的组分支持健康幼年及成年软骨细胞的生长。所述水凝胶的组成与结构还可促进软骨组织形成，这一点通过糖胺聚糖（GAG）定量检测所显示的功能性细胞外基质沉积得以证实。

另一个优点是，可以对软骨细胞-水凝胶构建物中新形成的软骨组织进行力学性能评估。需要注意的是，应同时对无细胞水凝胶进行非限制性压缩测试，以作比较。事实上，由于壳聚糖（CS）基团本身的刚性，水凝胶具有固有的刚度。在软骨组织的力学测试中，可施加5–20%的非限制性压缩应变（应变速率为1%/s）11,12，因为在负荷条件下软骨组织所经历的生理应变已被报道为10–20%13,14。在培养终点，评估了含细胞和无细胞水凝胶对力学测试的响应。在上述描述的示例中，我们观察到含有成人和幼年软骨细胞的构建物具有相似的刚度，而含有骨关节炎（OA）软骨细胞的构建物刚度较低。此类细胞-水凝胶构建物的力学性能可用来评估所形成组织的功能特性，从而深入分析细胞成熟能力。

总之，利用三维仿生水凝胶研究不同软骨细胞群体生成软骨组织潜力的方法具有广泛的应用前景。此外 体外 本研究中所述的研究， 体内 可设想将负载细胞的构建体进行移植，以在生理环境中研究细胞的成熟过程及再生潜能。还可设想对水凝胶平台进一步引入其他生物模拟因子，以优化软骨细胞的增殖与成熟。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢斯坦福大学骨科外科系和斯坦福Coulter转化种子基金提供的经费支持。J.H.L. 感谢美国国家科学基金会研究生奖学金和DARE博士奖学金提供的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
幼年软骨细胞（Clonetics 正常人软骨细胞培养系统）LonzaCC-2550
成年软骨细胞（Clonetics 正常人软骨细胞培养系统）LonzaCC-2550
聚乙二醇二丙烯酸酯Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-吗啉乙磺酸SigmaM5287
光引发剂Irgacure 2959
氯化钠 SigmaS9888
硫酸软骨素钠盐 SigmaC9819
N-羟基琥珀酰亚胺 Sigma130672
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐SigmaE1769
2-氨基乙基甲基丙烯酸酯Sigma516155
透析袋Spectrum Laboratories 132700
胶原酶2Worthington Biochemical LS004177
胶原酶4Worthington Biochemical LS004189
DMEM/F12 培养基HyClone, Thermo Scientific SH3002301 
活/死细胞染色检测试剂盒Life TechnologiesL3224
Trizol 试剂Life TechnologiesAM9738
Quant-iT PicoGreen 双链DNA定量检测试剂盒InvitrogenP11496
磷酸氢二钠 SigmaS3264
乙二胺四乙酸二钠盐 SigmaE5134
L-半胱氨酸SigmaC1276
1,9-二甲基亚甲基蓝 Sigma341088
仪器
紫外光设备 - XX-15LW 台式灯，365 nmUVP95-0042-07
Instron 5944 材料试验系统 Instron CorporationE5940

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