Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruke Caco-2 celler å studere Lipid Transport av tarmen

Published: August 20, 2015 doi: 10.3791/53086
Automatic Translation
1, 2
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

Introduction

Studier av intestinal absorpsjon av fett og fettoppløselige legemidler og vitaminer kan bli utført in vivo ved hjelp av en lymfe fistel modell 1-4. Men den kirurgiske teknikker som er involvert er ikke bare vanskelig, men også kostbart. Selv om in vivo-metoder som er basert på fekal analyse kan bli anvendt, er de brukt hovedsakelig for å bestemme den prosentvise opptak av mage-tarmkanalen 2,5. In vitro modellen beskrevet i denne artikkelen er mer kostnadseffektivt, og teknikkene som er involvert er kanskje mindre utfordrende. Genetiske modifikasjoner studier er også mer økonomisk og mindre tidkrevende når de utføres ved hjelp av denne in vitro-modell.

Siden lipid-løselige materialer som er tatt opp av enterocyttene er pakket inn i lipoproteiner 6,7, er effektiviteten av denne in vitro-modell for å produsere lipoproteiner avgjørende. De to viktigste intestinal lipoproteiner er kylomikroner og svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL). Chylomikroner, definert som lipoproteiner med 80 nm eller mer i diameter, er produsert strengt av tynntarmen når lipider er rikelig tilstede i den gastrointestinale lumen. Siden de er de største lipoproteiner, kylomikroner er tenkes de mest effektive lipid transportører. Denne in vitro-modell, som er i stand til å produsere kylomikroner 8, kan brukes til å studere fett absorpsjon, fettløselige vitamin absorpsjon i tarmen, og oral biotilgjengelighet lipofilt medikament. Tilstedeværelsen av lipid-oppløselige molekyler, vitaminer eller stoffer i lipoprotein fraksjon er en indikator på deres absorpsjon av tynntarmen. Som tidligere omtalt, kan denne modellen benyttes for å forbedre oral biotilgjengelighet lipofilt medikament 6.

Dette notatet beskriver hvordan Caco-2 celler bør opprettholdes i gjennomtrengelig membran eller vanlige vevskulturskåler, hvordan lipid mistoffet for å stimulere produksjon av lipoprotein skal fremstilles, hvor det lentivirus ekspresjonssystem kan bli anvendt for å oppnå effektiv overekspresjon, og hvor de isolerte lipoproteiner bør analyseres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedlikehold av Caco-2 celler

  1. Bruker vanlige vevskulturskåler
    1. Tine Caco-2-celler fra en frossen ampulle ved å plassere beholderen i et 37 ° C vannbad, og straks legge dem til en 10 cm vevskultur-skål inneholdende 10 ml forvarmet vekstmedium (15% føtalt bovint serum (FBS ) i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM)).
      1. Når Caco-2-cellene har nådd 50-70% konfluens, splitte dem 1: 6 ved å inkubere cellene med 3 ml av 0,05% trypsin / 0,53 mM ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved 37 ° C inntil de er frittliggende (15 min) . For å unngå celle klumper, bland cellene flere ganger ved forsiktig pipettering. Tilsett 0,5 ml av trypsin cellene til en 10 cm vevskultur-skål inneholdende 10 ml forvarmet vekstmedier.
    2. Rist retter flere ganger i en forover og bakover retning etterfulgt av en mot venstre og mot høyre retning. Unngå virvlende rettenesom det kan resultere i en ulik celle spredning.
    3. Plasser retter på et flatt underlag i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO 2. Skrå flater kan også resultere i en ujevn celle dispersjon.
    4. Endre vekstmedier en dag etter start av inkubasjon.
    5. Overvåk cellene og registrere den dagen de nå samløpet. Det vil ta ca 1 uke for cellene å nå samløpet fra den dagen de blir splittet.
    6. Endre vekstmedier to ganger i uken før cellene når konfluens. Når cellene har nådd konfluens, endrer vekst media hver annen dag. Etter at cellene er 7-dager post-konfluente, endrer vekstmedier daglig.
      Merk: Cellene er klare for eksperimenter når de er 13 dager post-konfluente (figur 1). Siden cellene vil etter hvert bli mindre effektiv i å produsere lipoproteiner, bruke celler som er mellom 13 til 17 dager etter sammenflytende 8. Gå til trinn 3 på hvordan å gjennomføre eksperimentet.
  2. Bruke gjennomtrengelig membran system
    1. Seed de Caco-2 celler i gjennomtrengelig membran innsats som beskrevet i trinn 1.1.1.1. ovenfor. Unngå å bruke celler fra en frossen hetteglass fordi deres cellevekst er vanligvis tregere (restitusjonsperiode). I korthet, tilsett 0,5 ml av cellene trypsinbehandlet til den apikale kammeret (øvre kammer) som inneholder 10 ml forvarmet vekstmedier. Også legge til 10 ml forvarmet vekstmedier til basolaterale kammeret (nedre kammer).
      Merk: For beste praksis, legger vekstmedier til den apikale kammeret først og deretter til basolaterale kammeret. Når du fjerner de gamle mediene, fjern basolaterale media før de apikale mediet. Unngå å stikke den polykarbonatmembran som det kan briste membranen.
    2. På grunn av dårlig mobil sikt gjennom polykarbonat membran, frø de Caco-2 celler i en vanlig vevskulturskål med tilsvarende tetthet, og bruke denne retten til å dømme cellen samløpet.
    3. Følg sTeps 1.1.2-1.1.6 ovenfor.

2. Gene Overekspresjon

  1. Bruke vanlig transfeksjon tilnærming
    1. Seed de Caco-2 celler på en vevskulturskål som beskrevet i 1.1.1.1.-1.1.4 ovenfor.
      Merk: Når cellene er ca 40-50% sammenflytende, er de klare til å bli tilført.
    2. Legg 67 pl av transfeksjon reagens til 472 pl av de reduserte serum media i et mikrosentrifugerør. Unngå kontakt av ufortynnet transfeksjon reagens med rørveggen.
    3. Legg 23 mikrogram av pLL3.7 forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) 9 inn transfeksjonseffektiviteten reagent / redusert serum media blanding.
    4. Inkuber blandingen i 20 minutter ved RT.
    5. Bytt ut Caco-2 celler 'vekstmedier med 8 ml 10% FBS i DMEM.
    6. Legg til DNA / transfeksjon reagens / redusert serum media blanding dråpevis til parabolen.
    7. Rist retter flere ganger i en fremover og backward retning etterfulgt av en venstrerettet og høyrerettet retning.
    8. Sett fatet i 37 ° C inkubator.
    9. Sett på media i fatet med 10 ml vekstmedier om dagen etter start av inkubasjon.
    10. Overvåke genuttrykk.
      1. Overvåke genuttrykk uten 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farging. Ved hjelp av et fluorescerende mikroskop, bestemme prosent av celler som er grønne. Den prosentvise representerer transfeksjonseffektiviteten.
      2. Overvåke genuttrykk med DAPI farging.
        1. Vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) tre ganger.
        2. Fiksere cellene ved tilsetning av 10 ml av 4% formaldehyd i PBS (10 min inkubasjon ved romtemperatur).
        3. Vask cellene med PBS tre ganger.
        4. Cellene inkuberes i mørke i 15 minutter ved romtemperatur med 8 ml PBS inneholdende 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonin.
        5. Vask cellene med PBS tre ganger.
        6. Usynge en fluorescerende mikroskop, bestemme antall celler som er grønn / blå i forhold til de som er blå (figur 2 øverste panel). Den beregnede prosentvise representerer transfeksjonseffektiviteten.
  2. Bruke lentivirus overekspresjonsystem 10
    1. Seed humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler i en 15 cm vevskulturskål (10% FBS i DMEM som sitt vekstmedium).
      Merk: Når cellene er ca 60-70% sammenflytende, er de klare til å bli tilført.
    2. Legg 162 mL av transfeksjon reagens til 1133 mL av de reduserte serum media i en mikro rør 11. Unngå kontakt av ufortynnet transfeksjon reagens med rørveggen.
    3. Legg 24 ug pLL3.7 EGFP (eller annen konstruksjon), 15,6 ug Rev respons element (RRE), 6,0 ug REV, og 8,4 ug av vesikulært stomatitis virus glykoprotein (VSVG) i transfeksjon reagens / rutledes serum media blanding.
    4. Inkuber blandingen i 20 minutter ved RT.
    5. Sett på vekstmediet med 16 ml 10% FBS i DMEM.
    6. Legg til DNA / transfeksjon reagens / redusert serum media blanding dråpevis til parabolen.
    7. Rist retter flere ganger i en forover og bakover retning etterfulgt av en mot venstre og mot høyre retning. Det er normalt å se noen av de HEK293T cellene enebolig på dette punktet.
    8. Sett fatet i inkubatoren.
    9. Etter 24 timers inkubasjon, erstatte media i fatet med 25 ml av vekstmedier.
    10. På den påfølgende dagen, samle vekstmedier som inneholder lentivirus (første samling).
    11. Gjenta trinn 2.2.10 å samle flere lentivirus (den andre samlingen).
    12. Pool den første og den andre samlingen, og fjerne celleavfall ved sentrifugering (2500 xg i 5 min).
    13. Filter samlingen med en engangsflaske-top filter (0,45 mikrometer pore), ogkonsentrere viruset ved sentrifugering av samlingen på 31 400 xg i 2 timer ved romtemperatur (JA-20 rotor). Markere bunnen av sentrifugerøret, hvor pelleten er plassert. Dekanter supernatanten, og forlater røret inverteres ved romtemperatur i ca. 15 min.
    14. Resuspender virus-holdige pellet med 100 ul av 1 x PBS. Unngå bobler.
    15. Oppbevar konsentrert viruset ved -80 ° C. Unngå fryse-tine sykluser.
    16. Bestemme den optimale mengden av virus nødvendig for å omsette de Caco-2-celler ved titrering. For å spare kostnader, kan du bruke en 24-brønns plate (0,3 ml av vekstmedier / brønn) i stedet for en 10 cm vevskulturskål for titrering.
      1. Legg økende mengder av den konsentrerte virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, og 50 pl / brønn) supplert med polybren (sluttkonsentrasjon = 5 ug / ml) til 40-70% konfluens Caco-2-celler. Rist 24-brønners plate skånsomt som beskrevet i 1.1.2.
      2. Overvåke deres genuttrykk (trinn 2.1.10.) (Figur 2 bunn4 paneler).
    17. Siden uttrykket av transgenet er generelt opprettholdes, vedlikeholde transduserte celler for senere eksperimenter og kontinuerlig overvåke deres genuttrykk (trinn 2.1.10.).

3. Stimulere Lipoprotein Sekresjon

  1. Ved å bruke den vanlige vevskulturskål
    1. Tilbered en 100X lipid blanding ved å blande 50 mg av oljesyre, 40 mg lecitin og 48 mg natriumtaurocholat. Bringe volumet til 900 mL med PBS (nok til åtte retter). Vortex lipidblandingen kraftig.
    2. Legg 900 mL av 100X lipidblandingen i 89,1 ml vekstmedium. Bland, og filtrere lipidholdige media. De endelige konsentrasjoner (1x) av oljesyre, lecitin, og natriumtaurocholat er 2,0 mM, 1,36 mM og 1,0 mM, respektivt.
    3. Tilsett 10 ml av lipid-inneholdende medium til cellene.
    4. Cellene inkuberes med det lipid-inneholdende media i 4 timer i en 37° C inkubator.
    5. Vask cellene med PBS tre ganger.
    6. Tilsett 10 ml av vekstmedium til cellene for å samle lipoprotein sekresjon.
    7. Inkuber i 2 timer i et 37 ° C inkubator.
    8. Samle lipoprotein holdige medier.
  2. Bruke gjennomtrengelig membran system
    1. Følg fremgangsmåten 3.1.1-3.1.2 for å fremstille fettblandingen.
    2. Tilsett 10 ml av lipid-inneholdende medium til den apikale kammeret og 10 ml av vekstmediet til basolaterale kammeret.
    3. Inkuber i 4 timer i en 37 ° C inkubator. Samle lipoprotein holdige medier i basolaterale kammeret.

4. Lipoprotein Isolation (figur 3)

  1. Fjerne celleavfall fra lipoprotein-holdige media ved sentrifugering (2000 xg i 5 min).
  2. Dekanter media inn i en 50 ml tube.
  3. Legg 5,95 g natriumklorid til media.
  4. Dersom SAmple vil bli analysert av TEM, tilsett 1 proteasehemmer cocktail tablett for å opprettholde integriteten av lipoproteiner.
  5. Bringe volumet til 23 ml med vann (1,2 g / ml NaCl-oppløsning densitet).
  6. Oppløse solutes helt.
  7. Dekanter hele oppløsningen inn i et polykarbonat ultrasentrifugerør.
  8. Forsiktig overlappe 1,2 g / ml tetthet løsning med 0,5 ml vann (1,0 g / ml tetthet).
  9. Balanse røret etter vekt og ikke av volumet.
  10. Forsiktig laste rørene i T865-rotor.
  11. Spinne prøvene i ultrasentrifuge på 429 460 xg i 24 timer ved 4 ° C.
  12. Umiddelbart isolere toppen 0,5 ml oppløsning ved forsiktig pipettering. Hold røret så stille som mulig.

5. TEM Analyse

  1. Forbered 5 ml av 2% fosfowolframsyre (w / v), og justere pH til 6,0.
  2. Filtrer den 2% fosfowolframsyre med et sprøytefilter (porestørrelse: 0,2 pm).
  3. Drop 20 mL av lipoprotein prøven på et sterilt parabolen.
  4. Slipp 20 ul av den filtrerte 2% fosfowolframsyre ved siden av prøven på samme fatet.
  5. Forsiktig slippe en EM rutenett med kjedelig side hviler på prøven.
  6. Inkuber ved RT i 1 min.
  7. Banke forsiktig på siden av EM rutenettet på et filterpapir for å fjerne prøven fra nettet.
  8. Forsiktig slippe EM rutenett med kjedelig side hviler på 2% fosfowolframsyre.
  9. Inkuber ved RT i 1 min.
  10. Banke forsiktig på siden av EM gitteret på et filterpapir for å fjerne fosfowolframsyre fra nettet.
  11. Ved hjelp av en TEM, fange bilder av lipoproteiner (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser vanlige 13-dagers post-konfluent Caco-2 celler. Utseendet av kuppelformede konstruksjoner og intracellulære lipiddråper er karakteristisk for differensierte Caco-2-celler. Når Caco-2-celler ikke blir spredt likt under såing, vil de klumpe seg og overvokse i visse områder av fatet; og det vil være noen få områder i retten uten celler. Virvlende og plassere formen i en skråstilt overflate bør unngås. Det er også viktig å merke seg at post-konfluent Caco-2 celler er mer utsatt for avløsning når nye vekstmedier er lagt til cellene for grovt. Derfor bør de nye mediene legges forsiktig for å hindre celle løsrivelse.

Basert på disse studiene, transfeksjonseffektiviteten av Caco-2 celler var mellom 30-60% (figur 2 øverste panelene). I motsetning til dette transduksjon effektiviteten av Caco-2 ved bruk av lentivirus ekspresjonssystemet ca. 100% (figur 2 Figur 2 viser også at den optimale mengde konsentrert lentivirus var 10 ul. De transduserte Caco-2 celler ble opprettholdt inntil 12 passasjer. Som vist, selv etter 12 passasjer de transduserte celler fremdeles uttrykte EGFP. Transduksjon effektivitet avhenger klart av lentivirus konsentrasjon. Bekreftelsen av transfeksjonseffektiviteten / transduksjon effektivitet er kritisk, og bør utføres som en rutine foranalyse før de egentlige eksperimenter. Selv om det kan brukes for Western blot-analyse for å beregne den prosentvise økning av genekspresjon, bør det ikke være den primære metode for å bestemme transfeksjonseffektiviteten / transduksjon effektivitet.

Ved hjelp av NaCl-densitetsgradient-ultrasentrifugemetoden (figur 3), lipoproteinene utskilt av Caco-2-celler ble isolert og analysert på en TEM. Noen av kylomikroner, lipoproteiner større enn 80 nm i diameter, ble vist i figur4. De mindre lipoproteiner, VLDLs, var også til stede. Det er viktig å bekrefte vellykket isolering av både kylomikroner og VLDLs på en TEM. Som tidligere omtalt 8, bør biokjemisk analyse ikke være den primære metode for bekreftelse. Fraværet av lipoproteiner, spesielt kylomikroner, indikerer at lipid transport av Caco-2-celler er ikke effektiv. Følgelig vil de ikke tjene som en god modell for å studere lipidtransport. Antallet partikler som kylomikron i forhold til det totale antall lipoproteinpartikler kan telles 8. En høy prosentandel lipid indikerer effektiv transport.

Figur 1
Figur 1. Representant mikrograf av 13-dagers post-konfluent Caco-2 celler. Intracellulær lipid dråper er synlige i enkelte celler (rød pil). De unike kuppelformede strukturer (svart pil) foRMED av noen Caco-2-celler er vanligvis tilstede bare etter at cellene har nådd konfluens. Forstørrelse = 100X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning av effektiviteten av lipid-baserte transfeksjon og lentivirus ekspresjonssystemet Topplate.: Caco-2-celler ble transfektert med pLL3.7 EGFP ved hjelp av ikke-liposomale transfeksjon reagens (Skala bar = 20 mikrometer). Bunn fire paneler: Caco-2-celler ble transdusert med pLL3.7 EGFP hjelp av lentivirus ekspresjonssystemet med varierende mengder (1, 2, 5, eller 10 ul) av den konsentrerte lentivirus (LV). De viste celler var fra 12. passasje av de opprinnelige transduserte celler. Til venstre panelene viser DAPI farging, midt paNels viser GFP fluorescens, og høyre panel viser de fusjonerte bilder. Lentivirus uttrykk systemet var tydeligvis mer effektiv enn lipidbasert transfeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Isolering av tarm lipoproteiner ved hjelp av NaCl-densitetsgradient-ultrasentrifugering. Tettheten av lipoprotein-holdige mediet blir justert til 1,2 g / ml ved å tilsette den passende mengde av NaCl. Volumet av prøven må også justeres slik at den vil fylle hele ultrasentrifugerør for å hindre kollaps. For å oppnå en densitetsgradient, er 0,5 ml vann kledde forsiktig på 1,2 g / ml tetthet løsning. Prøven blir så sentrifugert ved 429 460 x g i 24 timer ved hjelp av en T865rotor (tilsvarende 2,15 Svedberg enheter). Tarm lipoproteiner bør umiddelbart utvinnes ved forsiktig pipettering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representative elektronmikrografi av lipoproteinene produsert av Caco-2-celler. De lipoproteiner isolert ved NaCl-densitet-gradient-ultrasentrifugering ble negativt farget med 2% fosfowolframsyre (pH 6,0). Kylomikroner, lipid partikler som er større enn 80 nm i diameter, og VLDLs, de som er mindre enn 80 nm, er begge til stede. Scale bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen til de to systemer som kan brukes opprettholde Caco-2-celler er beskrevet, nemlig den vanlige vevskulturskål og den permeable membran. Fordelene med å bruke den permeable membransystemet omfatter separasjon av den apikale og basolaterale kamrene, og evnen til å inkubere lipidblandingen og samle lipoprotein sekresjon samtidig. Men de permeable membran inserts er dyre, og deres polykarbonat membranen ikke tillater for god celle synlighet. En av fordelene ved denne in vitro-modell er det genetisk manipulasjon studier vil være mer økonomisk og mindre tidkrevende. For bedre effektivitet, bør lentivirus ekspresjonssystem anvendes. De transduserte Caco-2-celler generelt opprettholde ekspresjon av deres transgenet.

Evnen til Caco-2-celler til å produsere chylomikroner er av største betydning. Uten denne muligheten, ville Caco-2 celler ikke kunne effektiv vntly transportere lipofile materialer, inkludert men ikke begrenset til liphophilic narkotika, vitamin A, D, E og K, og eventuelle lipid løselige næringsstoffer. De riktige metodene for å utfordre Caco-2 celler til å produsere både VLDL partikler og kylomikroner er beskrevet. Den vellykkede isolering av disse lipoproteinpartikler bør bekreftes på en TEM. Basert på dagens litteratur, tilbyr dette Caco-2-modellen den mest effektive lipidtransport blant annet Caco-2 modeller 12-14. Imidlertid er in vivo lymfe kanylering modellen fremdeles transporterer lipider mer effektivt enn noen in vitro-modell. De underliggende årsaker har nylig blitt diskutert 8, nemlig fordi Caco-2-celler produserer to forskjellige isoformer av apolipoprotein B, Caco-2 celler kan ikke syntetisere triglycerider fra monoglyserider, og serumet komponenten kritisk for chylomikron biogenese kan være lavere i vekstmediet . Det er også viktig å være klar begrensning av denne ivitro modell; Denne in vitro-modell utelukker noen potensielle viktige faktorer, som tarmmotilitet, anatomi av tarmen, og interaksjonen med andre organsystemer.

De viktigste faktorene som gjør at Caco-2 celler til å produsere kylomikroner effektivt er den type / mengde lipider som brukes og cellulær differensiering 8. Uten riktig kombinasjon av disse faktorer, vil Caco-2-celler ikke produsere et betydelig antall kylomikroner 8. Av notatet, bør NaCl densitetsgradient ultracentrifugation utføres riktig. Den vellykkede isolering av lipoproteiner avhenger av timing (umiddelbar uten vesentlig forsinkelse), god håndtering av prøver (solid uten mye uro), og forsiktig pipettering (får kun det øverste laget). Riktig teknikk kan praktiseres ved hjelp av forhånds farget lipider å hjelpe visualisere lipoprotein lag åtte. Dess TEM, biokjemiske analyser, det vil si, apolipoprotein B og triglycerid-analyser, kan også være used å bekrefte vellykket isolering av lipoproteiner. Disse biokjemiske analyser, som vi tidligere har rapportert 8, kan også brukes som metoder i tallfeste absorpsjon. Imidlertid bør TEM likevel utføres på grunn av tendensen av lipoproteiner til å aggregere 2, forårsaker en potensiell overvurdering av kylomikron produksjon.

Denne in vitro-modell er spesielt nyttig for å studere fett absorpsjon og intestinal absorpsjon av lipofile legemidler, vitaminer og andre fettløselige næringsstoffer. Det kan også tjene som en modell for å forbedre dårlig biotilgjengelighet av oralt lipofile legemidler. Siden lipid-løselige materialer som er pakket inn i kylomikroner fra enterocytter for transport til sirkulasjon, vil kylomikron-produserende Caco-2-celler er mer effektive i å absorbere lipofile legemidler. I tillegg gir denne modellen søkere for å bestemme rollen til et spesifikt gen i absorpsjonen i tarmen (Pharmacogenetics). Den gjør det også ivestigators å sammenligne effekten av ulike fettstoffer på muntlig lipofilt stoffet biotilgjengelighet. Alle disse programmene har vært diskutert tidligere seks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).

Tags

Molecular Biology Lipofile uløselig hydrofobe narkotika gut kylomikron VLDL lipoprotein enterocyte lymfe absorpsjon sekresjon
Bruke Caco-2 celler å studere Lipid Transport av tarmen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nauli, A. M., Whittimore, J. D.… More

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter