Introduction
4 -的饮食脂肪，和脂溶性药物和维生素肠吸收的研究可以在体内通过使用淋巴瘘模型1进行。然而，所涉及的手术技术不仅具有挑战性的，而且成本很高。虽然体内方法的基础上的粪便分析可以利用，它们被用于主要由胃肠道2,5，以确定百分摄取。本文所述的体外模型更符合成本效益，以及所涉及的技术，可以说是不太具有挑战性。基因修饰的研究也更经济和耗时更少时，他们利用这种体外模型进行的。
因为这是采取由肠细胞的脂溶性物质被打包成脂蛋白6,7，该体外模型的有效性，以产生脂蛋白是至关重要的。两个主要intestina升脂蛋白是乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）。乳糜微粒，其定义为具有80nm以上脂蛋白直径，严格生产由小肠时的脂质是大量存在于胃肠内腔。因为它们是最大的脂蛋白，乳糜微粒是可以想象的最有效的脂质转运。此体外模型，其能够产生乳糜微粒8，可用于研究饮食脂肪吸收，脂溶性维生素的吸收由肠道和口服脂溶性药物的生物利用度。脂溶性分子，维生素，或药物中的脂蛋白组分的存在是其吸收由小肠的指标。如先前讨论的，该模型可以用于改善口腔脂溶性药物的生物利用度6。
本文介绍Caco-2细胞如何应保持在渗透膜或定期组织培养皿，如何脂质英里夹具用于刺激脂蛋白生产应准备，如何慢病毒表达系统可以被用来实现有效的过表达，而分离出的脂蛋白应如何进行分析。
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Protocol
在Caco-2细胞的1.维持
- 使用常规组织培养皿
- 解冻的Caco-2细胞从冷冻的小瓶通过将小瓶在37℃水浴中，并立即将其添加到含有10预温热的生长培养基（15％胎牛血清毫升10cm的组织培养皿（FBS ）在Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM））。
- 当Caco-2细胞达到50-70％汇合时，将它们分割1：直到它们被分离的6通过在37℃下孵育细胞用3ml的0.05％胰蛋白酶/ 0.53毫乙二胺四乙酸（EDTA）（15分钟） 。为了避免细胞聚集，轻柔吹打混合细胞几次。加入0.5毫升胰蛋白酶细胞对含有10ml预热的生长培养基的10cm的组织培养皿。
- 轻轻摇动菜几次在向前和向后方向接着是向左和向右的方向。避免纷飞的菜因为这可能导致不平等的细胞分散。
- 放置在平坦表面上的菜在5％的CO 2供给的37℃培养箱中。倾斜表面也可能导致在一个不平等细胞分散。
- 每天在开始培养后改变生长培养基。
- 监测细胞并记录它们达到汇合的那一天。这将需要约1周的细胞，从一天他们被分开达到汇合。
- 每周两次更换生长培养基之前，细胞达到汇合。一旦细胞达到汇合，每隔一天更换培养基。后的细胞是7-日后汇合，每天更换生长培养基。
注：细胞准备用于实验时，他们的13天后汇合（ 图1）。因为在生产脂蛋白细胞将最终变得不那么有效，使用细胞，13至17天后汇合8之间。转到如何进行的实验步骤3。
- 解冻的Caco-2细胞从冷冻的小瓶通过将小瓶在37℃水浴中，并立即将其添加到含有10预温热的生长培养基（15％胎牛血清毫升10cm的组织培养皿（FBS ）在Dulbecco氏改良Eagle培养基（DMEM））。
- 利用渗透膜系统
- 如在步骤1.1.1.1中描述的种子的Caco-2细胞中的渗透膜的插入。上面。避免使用细胞冷冻瓶，因为他们的细胞生长较慢正常（恢复期）。简言之，加入0.5毫升胰蛋白酶细胞对心尖室（上室），它包含10毫升预温热的生长培养基。此外，加入10 mL预温热的生长培养基到基底外侧腔室（下室）。
注意：对于最佳操作，第一和随后的生长培养基添加到顶部室向基底外侧腔室。当拆除旧媒体，心尖媒体面前取出基底媒体。避免戳是聚碳酸酯膜，因为它可能会破裂的膜。 - 由于通过聚碳酸酯膜差细胞能见度，种子的Caco-2细胞在常规组织培养皿具有类似的密度，并使用这个菜来判断细胞汇合。
- 按照sTEPS 1.1.2-1.1.6以上。
- 如在步骤1.1.1.1中描述的种子的Caco-2细胞中的渗透膜的插入。上面。避免使用细胞冷冻瓶，因为他们的细胞生长较慢正常（恢复期）。简言之，加入0.5毫升胰蛋白酶细胞对心尖室（上室），它包含10毫升预温热的生长培养基。此外，加入10 mL预温热的生长培养基到基底外侧腔室（下室）。
2.基因表达
- 使用常规方法转染
- 如以上1.1.1.1.-1.1.4描述种子Caco-2细胞上的组织培养皿。
注意：当细胞约有40-50％汇合时，它们已准备好被转染。 - 添加67微升转染试剂以472微升减少血清培养基的微量离心管中。避免未稀释的转染试剂与所述管壁接触。
- 加23微克pLL3.7的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）9成转染试剂/减少血清的培养基混合物中。
- 为20分钟，在RT孵育混合物。
- 用8ml 10％胎牛血清的DMEM中取代的Caco-2细胞的生长培养基。
- 添加该DNA /转染试剂/低血清培养基混合物逐滴的菜。
- 轻轻摇动的菜好几次向前和Backward方向接着是向左和向右的方向。
- 放置在37℃培养箱菜。
- 在开始培养后替换媒体用了一天10毫升生长培养基的菜。
- 监测基因表达。
- 监测基因表达而不4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。使用荧光显微镜，确定细胞是绿色的百分比。百分比表示的转染效率。
- 监视器DAPI染色基因表达。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次洗细胞。
- 通过在PBS（10分钟温育在室温下）加入10ml 4％的甲醛固定细胞。
- 用PBS三次洗细胞。
- 孵育细胞在黑暗中进行15分钟，在RT下用8ml PBS中含1：500的DAPI，1％BSA，0.01％毛地黄皂苷。
- 用PBS三次洗细胞。
- ü唱的荧光显微镜，确定细胞，绿色/蓝色相对那些蓝色（ 图2上图）的数量。所计算的百分比表示的转染效率。
- 如以上1.1.1.1.-1.1.4描述种子Caco-2细胞上的组织培养皿。
- 利用慢病毒表达系统10
- 种子人胚肾（HEK）293T细胞在15厘米的组织培养皿（10％FBS的DMEM中为它们的生长介质）。
注意：当细胞约有60-70％汇合时，它们已准备好被转染。 - 添加162微升转染试剂到1133微升减少血清的培养基的微量离心管11。避免未稀释的转染试剂与所述管壁接触。
- 添加24 pLL3.7的eGFP（或另一个构建体）的微克，15.6微克启反应元件（RRE），6.0微克的REV和8.4微克的水泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）插入转染试剂/ R得出血清培养基混合。
- 为20分钟，在RT孵育混合物。
- 以16毫升10％的FBS的DMEM更换生长培养基。
- 添加该DNA /转染试剂/低血清培养基混合物逐滴的菜。
- 轻轻摇动菜几次在向前和向后方向接着是向左和向右的方向。这是正常的看到一些在这一点超脱HEK293T细胞。
- 放置在孵化器的菜。
- 孵化后24小时，在用25毫升生长培养基的盘更换介质。
- 第二天，收集含有慢病毒（第一集）的生长介质。
- 重复步骤2.2.10收集更多的慢病毒（第二个集合）。
- 池的第一和第二集合，并通过离心除去细胞碎片（2,500×g离心5分钟）。
- 过滤收集，用一次性瓶顶滤器（0.45μm孔径）和通过在RT（JA-20转子）离心收集在31400 XG 2小时浓缩病毒。标记的离心管，其中团粒是位于底部。滗析出上清液，和离开倒在RT管约15分钟。
- 重悬在含病毒沉淀用100μl1X PBS中。避免气泡。
- 存储集中病毒在-80℃。避免反复冻融。
- 确定病毒滴定转导的Caco-2细胞所需要的最佳量。为了节省成本，使用24孔板（0.3毫升生长培养基/孔的），而不是10cm的组织培养皿滴定。
- 添加增加量的浓缩病毒的（0，1，2，5，10，25，和50微升/孔），补充用聚凝胺（最终浓度= 5微克/毫升），以40-70％汇合Caco-2细胞。轻轻摇动24孔板如在1.1.2中描述。
- 监测其基因表达（步骤2.1.10。）（ 图2底部4板）。
- 由于转基因的表达一般是持续，维持转导的细胞用于以后的实验和持续监测其基因表达（步骤2.1.10）。
- 种子人胚肾（HEK）293T细胞在15厘米的组织培养皿（10％FBS的DMEM中为它们的生长介质）。
3.刺激分泌脂蛋白
- 使用常规的组织培养皿
- 通过混合50毫克油酸，40毫克卵磷脂，和48毫克的牛磺胆酸钠制得100X脂质混合物。使体积达到900微升用PBS（足够8菜）。大力旋涡脂质混合物。
- 添加900微升100X脂质混合物的成89.1毫升生长培养基。混合，并过滤该含脂介质。油酸，卵磷脂和牛磺胆酸钠的最终浓度（1X）是2.0毫摩尔，1.36毫和1.0毫米。
- 加10毫升含脂质介质的细胞中。
- 在37孵育将细胞与含脂介质4小时°Ç孵化器。
- 用PBS三次洗细胞。
- 加入10毫升生长培养基向细胞收集脂蛋白分泌。
- 孵育2小时在37℃的培养箱中。
- 收集含有脂蛋白媒体。
- 利用渗透膜系统
- 按照步骤3.1.1-3.1.2准备脂质混合物。
- 加10毫升含脂质介质到心尖室和10ml生长培养基的至基底外侧腔室。
- 孵育在37℃培养箱中4小时。收集含有脂蛋白媒体在基底室。
4.脂蛋白的分离（图3）
- 通过离心（2,000×g离心5分钟）从含脂蛋白介质除去细胞碎片。
- 滗媒体到50毫升管中。
- 添加5.95克氯化钠给媒体。
- 如果SAmple将利用TEM进行分析，加入1蛋白酶抑制剂混合物片剂保持脂蛋白的完整性。
- 使体积至23毫升水（1.2微克/毫升的NaCl浓度溶液）。
- 完全溶解的溶质。
- 滗所有溶液的成聚碳酸酯超速离心管。
- 轻轻覆盖用0.5ml水（1.0微克/毫升的密度）1.2克/毫升的密度溶液。
- 平衡管（重量），而不是由体积。
- 轻轻装入试管中的T865转子。
- 旋在超速离心机样品在429460×g离心24小时，在4℃下。
- 立即隔离前0.5 ml的溶液轻柔吹打。保持管，还是越好。
5. TEM分析
- 准备加入5ml 2％磷钨酸（重量/体积）并调节pH至6.0。
- 过滤2％磷钨酸，用注射器过滤器（孔径：0.2微米）。
- 一滴无菌培养皿20微升脂蛋白的样品。
- 滴20微升过滤2％磷钨酸的旁边在同一盘的样品。
- 轻轻地落了EM电网与样品上的沉闷边休息。
- 在室温下孵育1分钟。
- 轻轻拍打在滤纸上的EM格一侧去除从电网样品。
- 轻轻在2％磷钨酸的暗面搁滴EM网格。
- 在室温下孵育1分钟。
- 轻轻拍打在滤纸上的EM网格的一侧，以从电网除去磷钨酸。
- 用TEM，捕捉脂蛋白（ 图4）的图像。
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Representative Results
图1显示正常的13天后汇合Caco-2细胞。圆顶形结构和细胞内脂滴的外观是分化的Caco-2细胞的特征。当Caco-2细胞不播种期间同样地分散，他们会结块并长满在盘的特定区域;而且会有少数地区的菜没有任何细胞。涡流，并放置在盘上的倾斜面，应该避免。同样重要的是要注意，后汇合Caco-2细胞更易受到当新生长培养基加入到细胞中过于粗略地脱离。因此，新的媒体，应缓慢加入，以防止细胞脱离。
基于这些研究，Caco-2细胞的转染效率之间30-60％（ 图2上图）。与此相反，的Caco-2的使用慢病毒表达系统的转染效率为约100％（ 图2 图2还表明，浓缩慢病毒的最佳量为10微升。将转导的Caco-2细胞维持高达12代。如图所示，即使经过12代的转导的细胞仍然表达绿色荧光蛋白。转导效率明显地依赖于慢病毒浓度。的转染/转导效率的确认是关键的，并应作为之前的实际实验中例行初步分析进行。虽然蛋白质印迹分析可用于估计基因表达的增加百分比，它不应该是主要方法，以确定转染/转导的效率。
使用的NaCl密度梯度超速离心法（ 图3），由Caco-2细胞分泌的脂蛋白进行分离上的TEM分析。一些乳糜微粒，脂蛋白在直径大于80nm时，在图中所描绘4，较小的脂蛋白，的VLDL，也出席了会议。重要的是要确认二者乳糜微粒和的VLDL上的TEM的成功分离。如前面所讨论8，生化分析不应该确认的主要方法。缺乏脂蛋白，特别乳糜微粒，表明由Caco-2细胞的脂质转运的效率不高。因此，他们将不能作为研究脂质运输一个很好的模式。相对于脂蛋白颗粒的总数乳糜微粒的粒子数进行计数8。高百分比表示高效脂质运输。
图13天后汇合Caco-2细胞的1代表显微镜照片。细胞内脂滴是在某些细胞（红色箭头）可见。独特的圆顶形结构（黑色箭头）FO通过一些Caco-2细胞Rmed指通常存在的细胞达到汇合后，才。放大倍数= 100X。 请点击此处查看该图的放大版本。
图中的基于脂质的转染的效率和慢病毒表达系统2中。比较顶板：使用非脂质体转染试剂（比例尺= 20微米）的Caco-2细胞用pLL3.7 eGFP的。底面4板：Caco-2细胞进行转导的利用慢病毒表达系统具有不同的浓缩慢病毒（LV）的量（1,2，5或10微升）pLL3.7 eGFP的。所显示的细胞从原始转导的细胞的12 个通道。左侧面板显示了DAPI染色，中间巴内尔斯显示GFP荧光，和右面板显示合并后的图像。慢病毒表达系统显然比脂质体转染更有效。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.隔离用的NaCl密度梯度超速离心肠脂蛋白。含有脂蛋白介质的密度是通过将氯化钠适量调节至1.2微克/毫升。样品的体积也需要进行调整，这样它会填满整个超速离心管，以防止塌陷。为了实现密度梯度，0.5毫升水轻轻覆盖在1.2微克/毫升浓度的溶液。然后将样品用T865纺429460×g离心24小时转子（相当于2.15 Svedberg单位）。肠道脂蛋白应轻柔吹打立即恢复。 请点击此处查看该图的放大版本。
由Caco-2细胞产生的脂蛋白图4代表电子显微照片。分离的NaCl密度梯度超速离心的脂蛋白呈负2％磷钨酸（pH 6.0）中染色。乳糜微粒，脂质颗粒大于80纳米的直径，和的VLDL，那些小于80纳米，两者都存在。比例尺= 100纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在本文中，可以使用两个系统，以保持Caco-2细胞进行了描述，即，常规的组织培养皿和渗透膜。利用渗透膜系统的优点包括心尖的和分离基底外侧室，并孵育所述脂质混合物并同时收集所述脂蛋白的分泌的能力。然而，渗透膜刀片是昂贵的，并且它们的聚碳酸酯膜不允许良好的细胞可见性。一个这种体外模型的一个优点是，遗传操作的研究将是更经济的和耗时少。为了获得更好的效果，慢病毒表达系统应使用。转导的Caco-2细胞通常保持它们的转基因的表达。
Caco-2细胞，以产生乳糜微粒的能力是极为重要的。如果没有这种能力，Caco-2细胞不能够efficiently运输亲脂材料，包括但不限于亲脂药物，维生素A，D，E和K，以及任何脂溶性营养物。适当的方法来挑战Caco-2细胞，以产生两个VLDL颗粒和乳糜微粒中描述。这些脂蛋白颗粒的成功分离应在透射电镜来确认。根据目前的文献，这的Caco-2模型提供在其他的Caco-2机型12最有效的脂质运输- 14。然而， 在体内的淋巴插管模型仍然比任何体外模型更有效地输送脂质。的根本原因已被最近讨论8，即因为Caco-2细胞产生2个不同的载脂蛋白B的同种型，Caco-2细胞不能合成由单甘油酯甘油三酯和血清成分为乳糜微粒的生物合成的关键可能是低的生长培养基。同样重要的是，实现此的限制中体外模型;此体外模型中排除一些潜在的重要因素，如肠道蠕动，肠道的解剖，并与其他器官系统的相互作用。
允许的Caco-2细胞产生乳糜微粒的主要因素有效地是使用脂质和细胞分化8的类型/量。没有这些因素的适当组合，Caco-2细胞不会产生显著数乳糜微粒8。值得注意的是，NaCl的密度梯度超速离心，应适当地进行。脂蛋白的成功分离取决于时间（不立即延迟显著），良好的样品处理（坚固没有太多的激动），并认真吸取（只得到顶层）。适当的技术可以通过使用预染脂质，以帮助可视化的脂蛋白层8的情况下实施。此外TEM，生化分析， 即 ，载脂蛋白B和三甘油酯的分析，也可以为used将确认脂蛋白的成功分离。这些生化分析，这是我们先前已经报道8，也可以作为在量化吸收的方法。然而，透射电镜仍应由于执行的脂蛋白的聚集倾向2，引起乳糜微粒生产的电位高估。
此体外模型是用于研究饮食脂肪吸收和亲脂性药物，维生素和其他脂溶性营养物肠道吸收特别有用。它也可以作为一个模型，以改善口服亲脂性药物的生物利用度较差。因为脂溶性物质被打包成乳糜微粒由肠细胞运输到循环，乳糜微粒产生Caco-2细胞将在吸收亲脂性药物更有效。另外，该模型允许调查，以确定在药物吸收特定基因的由肠道（药物基因学）的作用。它也允许在vestigators比较各种膳食脂肪的口服亲脂性药物的生物利用度的影响。所有这些应用先前已经6讨论。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
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