Introduction
Studies van intestinale absorptie van dieetvet en vetoplosbare geneesmiddelen en vitaminen kunnen in vivo worden uitgevoerd door toepassing van een model lymfe fistel 1-4. De chirurgische technieken noodzakelijk zijn niet alleen moeilijk maar ook duur. Hoewel in vivo benade- fecal analyse kan worden toegepast, worden zij vooral gebruikt om het percentage opname bepaald door het maagdarmkanaal 2,5. De in vitro beschreven in dit document model is meer kosteneffectief, en de betrokken technieken zijn misschien wel minder uitdagend. Genetische modificatie studies ook economischer en minder tijdrovend wanneer ze worden uitgevoerd in deze in vitro model.
Aangezien vetoplosbare stoffen die door enterocyten genomen worden verpakt in lipoproteïnen 6,7, de doeltreffendheid van deze in vitro model lipoproteïnen produceren cruciaal. De twee belangrijkste intestinal lipoproteïnen zijn chylomicronen en lipoproteïnen zeer lage dichtheid (VLDL). Chylomicronen, gedefinieerd als lipoproteïnen met 80 nm of meer in diameter, strikt door de dunne darm wanneer lipiden zijn overvloedig aanwezig in de maag lumen. Omdat ze de grootste lipoproteïnen, chylomicronen zijn denkbaar de meest efficiënte lipide transporteurs. Deze in vitro model dat kan produceren chylomicronen 8, kan worden gebruikt om voeding vetabsorptie, vet-oplosbare vitamine absorptie door de darm en orale biologische beschikbaarheid lipofiele geneesmiddelen te bestuderen. De aanwezigheid van lipide oplosbare moleculen, vitamines of drugs in de lipoproteïne fractie is een indicator van de absorptie door de dunne darm. Zoals eerder besproken, kan dit model worden gebruikt om orale biobeschikbaarheid lipofiel geneesmiddel 6 verbeteren.
Dit artikel beschrijft hoe Caco-2 cellen permeabel membraan of vaste weefselkweekplaten, hoe de lipide mi te handhavenxture voor het stimuleren lipoproteïne produktie moet worden voorbereid, hoe lentivirus expressiesysteem kan worden toegepast om effectief overexpressie halen en hoe de lipoproteïnen die moeten worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van de Caco-2 cellen
- Met behulp van reguliere weefselkweekschaaltjes
- Ontdooi de Caco-2-cellen uit een bevroren flacon door het plaatsen van de flacon in een 37 ° C waterbad en direct toevoegen aan een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml voorverwarmde groeimedium (15% foetaal runderserum (FBS ) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)).
- Wanneer de Caco-2-cellen 50-70% confluentie hebben bereikt, splitsen 1: 6 door incuberen van de cellen met 3 ml 0,05% trypsine / 0,53 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij 37 ° C totdat zij buiten (15 min) . Om cel klonteren voorkomen, meng de cellen meerdere malen door zachte pipetteren. Voeg 0,5 ml van de cellen met trypsine behandeld met een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml voorverwarmde groeimedium.
- Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en achterwaartse richting, gevolgd door een naar links en naar rechts richting. Vermijd wervelende de gerechtenaangezien het kan resulteren in een ongelijke cel dispersie.
- De schaaltjes worden op een vlak oppervlak in een met 5% CO 2 toegevoerd 37 ° C incubator. Schuine vlakken kunnen ook resulteren in een ongelijke cel dispersie.
- Wijzig de groeimedia dag na aanvang van de incubatie.
- Bewaken van de cellen en noteer de dag dat ze samenvloeiing bereiken. Het duurt ongeveer 1 week duren voordat de cellen samenvloeiing bereiken vanaf de dag dat ze worden gesplitst.
- Wijzig de groei media twee keer per week voor de cellen te bereiken samenvloeiing. Zodra de cellen samenvloeiing bereikt hebben, veranderen de groei media om de andere dag. Nadat de cellen zijn 7-dagen na de samenvloeiing, veranderen de groei media dagelijks.
Opmerking: De cellen zijn klaar voor experimenten wanneer zij 13 dagen na confluente (figuur 1). Omdat de cellen uiteindelijk minder effectief in het produceren van lipoproteïnen wordt, gebruiken cellen die 13 tot 17 dagen na confluent 8. Ga naar stap 3 over hoe om het experiment uit te voeren.
- Ontdooi de Caco-2-cellen uit een bevroren flacon door het plaatsen van de flacon in een 37 ° C waterbad en direct toevoegen aan een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml voorverwarmde groeimedium (15% foetaal runderserum (FBS ) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)).
- De permeabele membraansysteem
- Zaad van de Caco-2-cellen in het permeabele membraan insert zoals beschreven in stap 1.1.1.1. hierboven. Vermijd het gebruik van cellen van een bevroren flesje omdat hun celgroei is normaal gesproken langzamer (herstelperiode). In het kort, voeg 0,5 ml van de cellen met trypsine behandeld om de apicale kamer (bovenste compartiment) die 10 ml van voorverwarmd groeimedium bevat. Ook, voeg 10 ml van voorverwarmd groeimedium aan de basolaterale kamer (onderste magazijn).
Opmerking: Voor de beste praktijken, voeg de groei media om de apicale kamer en vervolgens naar de basolaterale kamer. Bij het verwijderen van de oude media, verwijder de basolaterale media voordat de apicale media. Vermijd porren het polycarbonaat membraan als het kan het membraan scheuren. - Door de slechte cel zicht door het polycarbonaat membraan, zaad de Caco-2-cellen in een regelmatig weefselkweekplaat met gelijke dichtheid, en deze schotel naar de celconfluentie beoordelen.
- Volg sTEPs 1.1.2-1.1.6 boven.
- Zaad van de Caco-2-cellen in het permeabele membraan insert zoals beschreven in stap 1.1.1.1. hierboven. Vermijd het gebruik van cellen van een bevroren flesje omdat hun celgroei is normaal gesproken langzamer (herstelperiode). In het kort, voeg 0,5 ml van de cellen met trypsine behandeld om de apicale kamer (bovenste compartiment) die 10 ml van voorverwarmd groeimedium bevat. Ook, voeg 10 ml van voorverwarmd groeimedium aan de basolaterale kamer (onderste magazijn).
2. Gene Overexpressie
- Met behulp van de reguliere transfectie aanpak
- Zaad van de Caco-2-cellen op een weefselkweek schotel, zoals beschreven in 1.1.1.1.-1.1.4.
Opmerking: Wanneer de cellen zijn ongeveer 40-50% confluent, zijn ze klaar om te worden getransfecteerd. - Voeg 67 ul van het transfectie reagens om 472 ui van de verminderde serum media in een microcentrifugebuis. Vermijd contact van het onverdunde transfectiereagens met de buiswand.
- Voeg 23 ug pLL3.7 versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) 9 in het transfectiereagens / verlaagde serum medium mengsel.
- Incubeer het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Vervang de Caco-2 cellen groeimedia met 8 ml 10% FBS in DMEM.
- Voeg de DNA / transfectiereagens / verminderd serum media mengsel druppelsgewijs aan het gerecht.
- Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en backward richting gevolgd door een naar links en naar rechts richting.
- Zet de schaal in de 37 ° C incubator.
- Vervang het medium in de schaal met 10 ml groeimedium dag na aanvang van de incubatie.
- Controleer de genexpressie.
- Monitor genexpressie zonder 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop, bepaalt het percentage cellen die groen zijn. Het percentage is de transfectie-efficiëntie.
- Controleer de genexpressie met DAPI kleuring.
- Was de cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal.
- Fixeer de cellen door toevoeging van 10 ml van 4% formaldehyde in PBS (10 min incubatie bij kamertemperatuur).
- Was de cellen met PBS driemaal.
- Incubeer de cellen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met 8 ml PBS dat 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonine.
- Was de cellen met PBS driemaal.
- Uzing een fluorescentiemicroscoop Bepaal het aantal cellen die groen / blauw ten opzichte van die die blauw (figuur 2 bovenste paneel). Het berekende percentage geeft de transfectie-efficiëntie.
- Zaad van de Caco-2-cellen op een weefselkweek schotel, zoals beschreven in 1.1.1.1.-1.1.4.
- De lentivirus overexpressie systeem 10
- Seed humane embryonale nier (HEK) 293T-cellen in een 15 cm weefsel kweekplaat (10% FBS in DMEM hun groeimedium).
Opmerking: Wanneer de cellen zijn ongeveer 60-70% confluent, zijn ze klaar om te worden getransfecteerd. - Voeg 162 ul van het transfectie reagens 1133 pl van het verminderde serum media in een microcentrifugebuis 11. Vermijd contact van het onverdunde transfectiereagens met de buiswand.
- Voeg 24 ug pLL3.7 eGFP (of een andere constructie), 15,6 ug Rev response-element (RRE), 6,0 ug REV, en 8,4 ug vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVG) in de transfectiereagens / reduced serum media mengsel.
- Incubeer het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Vervang de groeimedia met 16 ml 10% FBS in DMEM.
- Voeg de DNA / transfectiereagens / verminderd serum media mengsel druppelsgewijs aan het gerecht.
- Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en achterwaartse richting, gevolgd door een naar links en naar rechts richting. Het is normaal om een aantal van de HEK293T cellen losgemaakt op dit punt te zien.
- Zet de schaal in de incubator.
- Na 24 uur incubatie, de plaats van de media in de schaal met 25 ml van de groei media.
- Op de volgende dag, het verzamelen van de groei media met de lentivirus (eerste collectie).
- Herhaal stap 2.2.10 meer lentivirus (de tweede collectie) te verzamelen.
- Verzamel de eerste en de tweede verzamelhouder en verwijder celresten door centrifugeren (2500 x g gedurende 5 minuten).
- Filter de collectie met een wegwerp fles-top filter (0,45 pm porie), enconcentreren van het virus door centrifugeren de collectie van 31.400 xg gedurende 2 uur bij RT (JA-20 rotor). Merk de bodem van de centrifugebuis wanneer de pellet is gelegen. Giet het supernatant en laat de buis omgekeerd bij KT gedurende 15 min.
- Resuspendeer de virus-bevattende pellet met 100 pi 1X PBS. Vermijd bubbels.
- Bewaar de geconcentreerde virus bij -80 ° C. Vermijd vries-dooi cycli.
- Bepaal de optimale hoeveelheid virus die nodig is om de Caco-2-cellen te transduceren door middel van titratie. Om kosten te besparen, gebruikt een 24-well plaat (0,3 ml groeimedium / putje) in plaats van een 10 cm weefselkweekschaal titratie.
- Voeg toenemende hoeveelheden van het geconcentreerde virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, en 50 gl / putje) aangevuld met polybreen (eindconcentratie = 5 ug / ml) aan de 40-70% confluent Caco-2-cellen. Schud de 24-well plaat voorzichtig zoals beschreven in 1.1.2.
- Toezicht op hun genexpressie (stap 2.1.10.) (Figuur 2 bottom4 panelen).
- Omdat de expressie van transgene algemeen wordt volgehouden, handhaven van de getransduceerde cellen voor toekomstige experimenten en voortdurend hun genexpressie controleren (stap 2.1.10.).
- Seed humane embryonale nier (HEK) 293T-cellen in een 15 cm weefsel kweekplaat (10% FBS in DMEM hun groeimedium).
3. Het stimuleren van de Lipoprotein Afscheiding
- De reguliere weefselkweekplaat
- Bereid een 100X lipide mengsel door mengen van 50 mg oliezuur, 40 mg lecithine en 48 mg natrium taurocholaat. Breng het volume tot 900 ul met PBS (genoeg voor 8 gerechten). Vortex de lipidemengsel krachtig.
- Voeg 900 ul van de 100X lipide mengsel in 89,1 ml groeimedium. Meng en filteren de lipide bevattende media. De eindconcentraties (1X) oliezuur, lécithine, en natriumtaurocholaat zijn 2,0 mM, 1,36 mM en 1,0 mM, respectievelijk.
- Voeg 10 ml van het lipide bevattende media op de cellen.
- Incubeer de cellen met de lipiden bevattende media voor 4 uur in een 37° C incubator.
- Was de cellen met PBS driemaal.
- Voeg 10 ml van het kweekmedium om de cellen aan het lipoproteïne secretie verzamelen.
- Incubeer 2 uur in een 37 ° C incubator.
- Verzamel de lipoproteïne-bevattende media.
- De permeabele membraansysteem
- Volg de stappen 3.1.1-3.1.2 aan de lipide mengsel te bereiden.
- Voeg 10 ml van het lipide bevattende media om de apicale kamer en 10 ml van het kweekmedium aan de basolaterale kamer.
- Incubeer gedurende 4 uur in een 37 ° C incubator. Verzamel de lipoproteïne-bevattende media in de basolaterale kamer.
4. Lipoproteïne afzonderlijk (figuur 3)
- Verwijder de celresten van het lipoproteïne bevattende medium door centrifugeren (2000 x g gedurende 5 minuten).
- Giet het medium in een 50 ml buis.
- Voeg 5,95 g natriumchloride aan de media.
- Als de sample worden geanalyseerd door TEM, voeg 1 proteaseremmer cocktail tabletten de integriteit van de lipoproteïnen handhaven.
- Breng het volume op 23 ml met water (1,2 g / ml NaCl-density oplossing).
- Los het volledig opgeloste stoffen.
- Giet alle oplossing in een polycarbonaat ultracentrifuge buis.
- Overlay voorzichtig de 1,2 g / ml oplossing dichtheid met 0,5 ml water (1,0 g / ml dichtheid).
- De balans van de buis van het gewicht en niet door volume.
- Voorzichtig laden van de buizen in de T865 rotor.
- Spin de monsters in de ultracentrifuge bij 429.460 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Onmiddellijk isoleren van de top 0,5 ml oplossing door zachte pipetteren. Houd de buis zo stil mogelijk.
5. TEM Analyse
- Bereid 5 ml 2% fosfowolfraamzuur (w / v) en breng de pH op 6,0.
- Filter de 2% fosfowolfraamzuur met een spuitfilter (poriegrootte: 0,2 urn).
- Drop 20 ui van het lipoproteïne monster op een steriele schaal.
- Drop 20 ul van de gefiltreerde 2% fosfowolfraamzuur naast het monster op dezelfde schaal.
- Zachtjes laten vallen een EM rooster met de saaie kant rust op het monster.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Tik zachtjes tegen de zijkant van de EM rooster op een filter papier om het monster uit het rooster te verwijderen.
- Voorzichtig laat de EM rooster met de saaie kant rust op de 2% fosfowolfraamzuur.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
- Tik zachtjes tegen de zijkant van de EM rooster op een filter papier om de fosfowolfraamzuur uit het rooster te verwijderen.
- Met een TEM, vangen de beelden van de lipoproteïnen (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de normale 13-dagen na de samenvloeiing Caco-2-cellen. Het uiterlijk van de koepelvormige constructies en intracellulaire vetdruppels zijn kenmerkend gedifferentieerde Caco-2-cellen. Wanneer de Caco-2 cellen niet gelijk tijdens het zaaien worden gedispergeerd, ze klonteren en overgroei in bepaalde gebieden van de schaal; en er een aantal gebieden in de schotel hiervoor geen enkele cellen. Het wervelen en het plaatsen van de schotel op een hellend oppervlak moet worden vermeden. Het is ook belangrijk op te merken dat na confluente Caco-2 cellen zijn gevoeliger voor onthechting als er nieuwe groeimedium toegevoegd aan de cellen te ruw. Daarom moet de nieuwe media voorzichtig toegevoegd aan cel losraken te voorkomen.
Op basis van deze onderzoeken was de transfectie-efficiëntie van Caco-2 cellen was tussen 30-60% (figuur 2 bovenste panelen). In tegenstelling tot de transductie efficiëntie van Caco-2 met het lentivirus expressiesysteem was ongeveer 100% (Figuur 2 Figuur 2 toonde ook aan dat de optimale hoeveelheid geconcentreerd lentivirus was 10 pi. De getransduceerde Caco-2-cellen werden gehandhaafd tot 12 passages. Zoals getoond, zelfs na 12 passages van de getransduceerde cellen tot expressie nog eGFP. De transductie efficiency hangt duidelijk af van de lentivirus concentratie. De bevestiging van de transfectie / transductie efficiëntie is kritisch en moet worden uitgevoerd zoals routinematig voorlopig onderzoek voorafgaand aan de feitelijke experimenten. Hoewel Western blot analyse kan worden gebruikt om het percentage toename van genexpressie te schatten, moet niet de primaire methode om de transfectie / transductie-efficiëntie te bepalen.
De NaCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werkwijze (figuur 3), de lipoproteïnen afgescheiden door de Caco-2-cellen werden geïsoleerd en op een TEM onderzocht. Enkele chylomicronen, lipoproteïnen groter dan 80 nm in diameter, werden afgebeeld in figuur4. De kleinere lipoproteïnen, VLDL, waren ook aanwezig. Het is essentieel voor de succesvolle isolatie van zowel chylomicronen en VLDL op een TEM bevestigen. Zoals eerder besproken 8 dient biochemische analyse niet de primaire wijze van bevestiging. De afwezigheid van lipoproteïnen, in het bijzonder chylomicronen, geeft aan dat de lipide transport door de Caco-2-cellen niet efficiënt. Bijgevolg zullen ze niet dienen als een goed model voor lipidentransport bestuderen. Het aantal chylomicrondeeltjes opzichte van het totale aantal lipoproteïnen kunnen worden geteld 8. Een hoog percentage geeft aan efficiënt lipide transport.
Figuur 1. Vertegenwoordiger microfoto van 13 dagen na de samenvloeiing Caco-2-cellen. Intracellulaire lipide druppels zijn zichtbaar in sommige cellen (rode pijl). De unieke koepelvormige structuren (zwarte pijl) formed door een Caco-2-cellen zijn in het algemeen aanwezig nadat de cellen samenvloeiing bereikt. Vergroting = 100X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vergelijking van de effectiviteit van de op lipide gebaseerde transfectie en lentivirus expressiesysteem Bovenkant:. Caco-2-cellen werden getransfecteerd met pLL3.7 eGFP behulp van de niet-liposomale transfectie reagens (Schaal bar = 20 pm). Onderste panelen 4: Caco-2-cellen werden getransduceerd met pLL3.7 eGFP met het lentivirus expressiesysteem met wisselende hoeveelheden (1, 2, 5 of 10 ui) van de geconcentreerde lentivirus (LV). De weergegeven cellen werden uit de 12 ste passage van het origineel getransduceerde cellen. De linker panelen tonen de DAPI kleuring, het middelste paNels tonen de GFP-fluorescentie, en de rechter panelen tonen de samengevoegde beelden. Het lentivirus uitdrukking systeem was blijkbaar effectiever dan de lipide-gebaseerde transfectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Isolatie van intestinale lipoproteïnen gebruik NaCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De dichtheid-lipoproteïne bevattende media g / ml bijgesteld tot 1,2 door toevoeging van de juiste hoeveelheid NaCl. Het volume van het monster moet ook worden aangepast zodat het het volledige ultracentrifuge buis instorting te voorkomen zal vullen. Om een gradiënt dichtheid te bereiken, wordt 0,5 ml water voorzichtig overlay op de 1,2 g / ml density oplossing. Het monster wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 429.460 g gedurende 24 uur met een T865rotor (equivalent aan 2,15 Svedberg-eenheden). De intestinale lipoproteïnen moet onmiddellijk worden hersteld door zachte pipetteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve electron micrograaf van de door de Caco-2-cellen lipoproteïnen. De lipoproteïnen die door NaCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie werden negatief gekleurd met 2% fosfowolfraamzuur (pH 6,0). Chylomicronen, lipide deeltjes groter dan 80 nm in diameter, en VLDL, die kleiner is dan 80 nm, beide aanwezig. Schaal bar = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit document kunnen de twee systemen die kunnen worden gebruikt voor het onderhoud Caco-2 cellen zijn beschreven, namelijk de normale weefselkweek schaal en de permeabele membraan. De voordelen van het permeabele membraan systeem omvatten de scheiding van de apicale en basolaterale compartimenten en de mogelijkheid om het lipide mengsel incubeer en laat het lipoproteïne secretie tegelijk. De permeabele membraan inserts zijn duur en hun polycarbonaatmembraan laat geen goede mobiele zicht. Een van de voordelen van deze in vitro model dat genetische manipulatie studies economischer en minder tijdrovend zal zijn. Voor een betere effectiviteit moet het lentivirus expressiesysteem worden gebruikt. De getransduceerde Caco-2-cellen doorgaans is de expressie van het transgen.
Het vermogen van Caco-2 cellen om chylomicronen produceren is van het grootste belang. Zonder dit vermogen zou Caco-2-cellen niet kunnen EFFICIËntly transport lipofiele materialen, inclusief maar niet beperkt tot liphophilic drugs, vitamine A, D, E en K, en elke vetoplosbare voedingsstoffen. De juiste methoden voor Caco-2-cellen Uitdaging produceren zowel VLDL deeltjes en chylomicronen worden beschreven. De succesvolle isolatie van deze lipoproteïne deeltjes dienen te worden bevestigd op een TEM. Op basis van de huidige literatuur Dit Caco-2 model biedt de meest efficiënte lipidentransport onder meer Caco-2 modellen 12-14. De in vivo lymfe canule model vervoert lipiden nog efficiënter dan in vitro model. De onderliggende redenen zijn onlangs besproken 8, namelijk omdat Caco-2 cellen 2 verschillende isovormen van apolipoproteïne B, Caco-2 cellen kunnen geen triglyceriden met monoglyceriden synthetiseren, en de component serum essentieel voor chylomicronen biogenese lager in het kweekmedium worden . Het is ook belangrijk om de beperking van deze realiserenvitro model; Dit in vitro model neemt bepaalde mogelijke belangrijke factoren, zoals de darmmotiliteit, anatomie van de darm, en de interactie met andere orgaansystemen.
De belangrijkste factoren waarmee Caco-2-cellen te produceren efficiënte chylomicronen het type / hoeveelheid gebruikte lipiden en cellulaire differentiatie 8. Zonder de juiste combinatie van deze factoren zal Caco-2-cellen niet tot een significant aantal chylomicronen 8. Van de nota, moet NaCl dichtheidsgradiëntcentrifugatie goed worden uitgevoerd. De succesvolle isolatie van lipoproteïnen is afhankelijk van de timing (onmiddellijke zonder significante vertraging), goed voorbeeld hanteren (stevige zonder veel onrust), en zorgvuldige pipetteren (het krijgen van alleen de bovenste laag). Juiste techniek kan worden beoefend door pre-gekleurd lipiden te helpen visualiseren van de lipoproteïne laag 8. Bovendien TEM, biochemische analyses, dat wil zeggen, apolipoproteïne B en analyse van triglyceriden, ook U wordensed de succesvolle isolatie van lipoproteïnen bevestigen. Deze biochemische analyses, die we eerder hebben gemeld 8, kan ook dienen als werkwijzen kwantificering absorptie. Er moet echter nog worden uitgevoerd TEM vanwege de neiging van de lipoproteïnen te aggregeren 2, waardoor een mogelijke overschatting van chylomicronen productie.
Deze in vitro model is bijzonder nuttig voor het bestuderen voeding vetabsorptie en intestinale absorptie van lipofiele geneesmiddelen, vitaminen, en andere vetoplosbare voedingsstoffen. Het kan ook dienen als een model voor slechte orale biologische beschikbaarheid van lipofiele geneesmiddelen te verhogen. Aangezien vetoplosbare materialen worden verpakt in chylomicronen door enterocyten voor transport naar de circulatie, zal-chylomicron producerende Caco-2-cellen efficiënter zijn in het absorberen van lipofiele drugs. Bovendien, dit model kunnen onderzoekers de rol van een specifiek gen in de absorptie door de darm (farmacogenetica) te bepalen. Het staat ook investigators te vergelijken het effect van verschillende vetten in de voeding op de orale lipofiel geneesmiddel biologische beschikbaarheid. Al deze toepassingen zijn eerder 6 besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
- Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
