Introduction
Исследования кишечной абсорбции пищевых жиров и жирорастворимых лекарственных препаратов и витаминов может быть проведена в естественных условиях с помощью свища модель лимфатических 1 - 4. Тем не менее, хирургические методы, вовлеченные не только сложно, но и дорого. Хотя в естественных условиях подходы, основанные на анализе фекальной может быть использован, они используются в основном для определения поглощение процентов от желудочно-кишечного тракта 2,5. Модель в пробирке описано в этой статье является более экономически эффективным, и методы, связанные, возможно, являются менее сложным. Генетические исследования модификации также более экономичным и менее трудоемким, когда они выполняются с использованием этой модели ин витро.
Так липидорастворимые материалы, которые принимаются до энтероцитами упакованы в липопротеинов 6,7, эффективность этой модели в пробирке, чтобы произвести липопротеины очень важно. Два основных intestinaл липопротеины хиломикронов и очень низкой плотности (ЛПОНП). Chylomicrons, определенные как липопротеинов с 80 нм или более в диаметре, получают строго в тонком кишечнике, когда липиды в большом количестве присутствуют в желудочно-кишечном просвете. Так как они являются крупнейшими липопротеины, хиломикроны являются очевидно наиболее эффективные транспортеры липидов. Эта модель в пробирке, который способен производить хиломикроны 8, может быть использован для изучения диетическое всасывание жира, жирорастворимых витаминов поглощения в кишечнике и полости рта липофильный биодоступность лекарства. Наличие жирорастворимых молекул, витаминов, лекарственных препаратов или в фракции липопротеинов является показателем их абсорбции в тонком кишечнике. Как обсуждалось ранее, эта модель может быть использована, чтобы улучшить пероральную биодоступность лекарства липофильный 6.
Эта статья описывает, как клетки Сасо-2 должна быть сохранена в мембрану или регулярных культуры ткани блюд, то как липидные миxture для стимулирования производства липопротеинов должны быть подготовлены, как лентивирусов система экспрессии может быть использован для достижения эффективной сверхэкспрессии, и как изолированного липопротеины должны быть проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Техническое обслуживание Сасо-2 клетки
- Использование регулярных культуры ткани блюда
- Растаяйте клеток Сасо-2 из замороженного флакон, поместив флакон в водяную баню при 37 °, и сразу же добавить их в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды (15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS ) в Игла в модификации Дульбекко (DMEM)).
- Когда клетки Сасо-2 достигли 50-70% слияния, разделить их 1: 6 инкубацией клеток с 3 мл 0,05% трипсина / 0,53 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 ° С, пока они не отделены (15 мин) , Чтобы избежать образования комков клеток, смешать клеткам несколько раз осторожно пипеткой. Добавить 0,5 мл трипсином клетки в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды.
- Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Избегайте закрученного блюдатак как это может привести к неравной дисперсии клеток.
- Поместите посуду на плоской поверхности в 37 ° C инкубатора поставляется с 5% CO 2. Наклонные поверхности могут также привести к неравной дисперсии клеток.
- Изменить питательных сред на следующий день после начала инкубации.
- Монитор клетки и записывать день они достигают слияния. Это займет около 1 недели для клеток, чтобы достичь слияния со дня их разделить.
- Замените носитель роста в два раза за неделю до клетки достигают слияния. После того, как клетки достигли слияния, изменить питательной среды через день. После клетки 7 дней после сливной измените носитель роста в день.
Примечание: клетки готовы для экспериментов, когда они 13-дней после сливающихся (Рисунок 1). Поскольку клетки в конечном итоге становятся менее эффективными в производстве липопротеинов, использовать клетки, которые находятся между 13 до 17 дней после сливающихся 8. Перейдите к шагу 3 о том, как проводить эксперимент.
- Растаяйте клеток Сасо-2 из замороженного флакон, поместив флакон в водяную баню при 37 °, и сразу же добавить их в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды (15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS ) в Игла в модификации Дульбекко (DMEM)).
- Использование проницаемых мембран систему
- Семени клеток Сасо-2 в мембрану вставки, как описано в шаге 1.1.1.1. выше. Избегайте использования клеток из замороженного флаконе, поскольку их рост клеток, как правило, медленнее (период восстановления). Вкратце, добавить 0,5 мл трипсином клеток в апикальную камеру (верхний отсек), который содержит 10 мл предварительно нагретой питательной среды. Кроме того, добавьте 10 мл подогретого СМИ роста на базолатеральную камеры (нижний отсек).
Примечание: Для лучшей практике, добавить питательную среду в апикальную камеру, а затем в базолатеральной камере. При удалении старых СМИ, удалить базолатеральный СМИ перед верхушечных СМИ. Избегайте тыкать поликарбоната мембраны, как это может привести к разрыву мембраны. - Из-за плохой видимости клеток через поликарбонатную мембрану, семена ЦАС-2 клетки в регулярном блюдо культуры ткани с одинаковой плотности, и использовать это блюдо, чтобы судить клеток слияния.
- Следуйте ейТЭЦ 1.1.2-1.1.6 выше.
- Семени клеток Сасо-2 в мембрану вставки, как описано в шаге 1.1.1.1. выше. Избегайте использования клеток из замороженного флаконе, поскольку их рост клеток, как правило, медленнее (период восстановления). Вкратце, добавить 0,5 мл трипсином клеток в апикальную камеру (верхний отсек), который содержит 10 мл предварительно нагретой питательной среды. Кроме того, добавьте 10 мл подогретого СМИ роста на базолатеральную камеры (нижний отсек).
2. Джин Избыточная
- Использование регулярных подход трансфекции
- Семенной ЦАС-2 клеток на ткани блюдо культуры, как описано в 1.1.1.1.-1.1.4 выше.
Примечание: Когда клетки около 40-50% сливной, они готовы для трансфекции. - Добавить 67 мкл реагента для трансфекции в 472 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы.
- Добавить 23 мкг pLL3.7 усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP), 9 в трансфекции реагента / восстановленной смеси сыворотки СМИ.
- Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Замените питательной среды клеток Сасо-2 "с 8 мл 10% FBS в DMEM.
- Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду.
- Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и баckward направлении, а затем в влево и вправо направлении.
- Поместите блюдо в 37 ° C инкубатора.
- Замените СМИ в блюдо с 10 мл питательной среды день после начала инкубации.
- Монитор экспрессию генов.
- Монитор экспрессию гена без 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол окрашивания (DAPI). Использование флуоресцентного микроскопа, определить процент клеток, которые зеленый. Процент представляет эффективность трансфекции.
- Монитор экспрессию гена с окрашиванием DAPI.
- Промыть клеток фосфатно-солевым буфером (PBS) в три раза.
- Зафиксировать клетки добавлением 10 мл 4% формальдегида в PBS (10 мин инкубации при комнатной температуре).
- Промыть клеток с PBS три раза.
- Инкубируйте клетки в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре с 8 мл PBS, содержащим 1: 500 DAPI, 1% БСА, 0,01% дигитонина.
- Промыть клеток с PBS три раза.
- Uпеть флуоресцентного микроскопа, определить количество клеток, которые зеленый / синий отношению к тем, которые являются синий (Рисунок 2 верхняя панель). Рассчитанная процент представляет эффективность трансфекции.
- Семенной ЦАС-2 клеток на ткани блюдо культуры, как описано в 1.1.1.1.-1.1.4 выше.
- Использование системы лентивирус избыточная экспрессия 10
- Семенной человека эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки в 15 см блюдо культуры ткани (10% FBS, в DMEM как их питательной среды).
Примечание: Когда клетки около 60-70% сливной, они готовы для трансфекции. - Добавить 162 мкл реагента для трансфекции в 1133 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки 11. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы.
- Добавить 24 мкг pLL3.7 EGFP (или другой конструкта), 15,6 мкг Rev элемент ответа (РРЭ), 6,0 мкг REV и 8.4 мкг вируса везикулярного стоматита гликопротеина (VSVG) в трансфекции реагента / гразвита сыворотки СМИ смесь.
- Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Замените СМИ роста с 16 мл 10% FBS в DMEM.
- Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду.
- Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Это нормально, чтобы увидеть некоторые из HEK293T клеток отдельных в этой точке.
- Поместите блюдо в инкубаторе.
- После 24 часов инкубации, заменить носитель в чашке с 25 мл питательной среды.
- На следующий день, собирать средства массовой информации роста, содержащий лентивирус (первый сбор).
- Повторите шаг 2.2.10, чтобы собрать больше лентивирус (вторая коллекция).
- Бассейн первый и второй сборник, и удалить остатков клеток путем центрифугирования (2500 мкг в течение 5 мин).
- Фильтр сбора с одноразовые бутылки верхней фильтра (0,45 мкм пор), исконцентрировать вирус центрифугированием сбор на 31400 х г в течение 2 ч при комнатной температуре (JA-20) ротора. Отметить дно центрифужную пробирку, где осадок находится. Декантировать супернатант, и оставить трубу перевернутой при комнатной температуре в течение примерно 15 мин.
- Ресуспендируют содержащую вирус осадок 100 мкл 1X PBS. Избегайте пузырей.
- Хранить концентрированный вирус при -80 ° С. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
- Определить оптимальное количество вируса необходимое для трансдукции клеток Сасо-2 путем титрования. Чтобы сохранить стоимость, использовать 24-луночного планшета (0,3 мл питательной среды / лунка) вместо 10 см культуре ткани блюдо для титрования.
- Добавить большее количество концентрированного вируса (0, 1, 2, 5, 10, 25, и 50 мкл / лунку), дополненной полибреном (конечная концентрация = 5 мкг / мл) в 40-70% сплошности клеток Сасо-2. Встряхнуть тарелку 24-а нежно, как описано в 1.1.2.
- Монитор их экспрессию генов (шаг 2.1.10.) (Рис 2 снизу4 панели).
- Так выражение трансгена, как правило, поддерживается, поддерживать трансдуцированных клеток для будущих экспериментов и постоянно следить за их экспрессию генов (шаг 2.1.10.).
- Семенной человека эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки в 15 см блюдо культуры ткани (10% FBS, в DMEM как их питательной среды).
3. Стимулирование липопротеина секрецию
- Использование регулярных блюдо культуры ткани
- Подготовка смеси липидов 100X путем смешивания 50 мг олеиновой кислоты, 40 мг лецитина и 48 мг таурохолата натрия. Довести объем до 900 мкл с PBS (достаточно для 8 блюд). Vortex липидной смеси энергично.
- Добавить 900 мкл липидной смеси 100X в 89,1 мл питательной среды. Смешайте и фильтровать липидов, содержащих носители. Конечные концентрации (1x) олеиновой кислоты, лецитин, и таурохолата натрия 2,0 мМ, 1,36 мМ и 1,0 мМ, соответственно.
- Добавьте 10 мл липидной-содержащей среде с клетками.
- Инкубируйте клетки с липидными-содержащей среде в течение 4 ч в 37° C инкубатор.
- Промыть клеток с PBS три раза.
- Добавьте 10 мл питательной среды к клеткам, чтобы собрать секрецию липопротеинов.
- Инкубируют в течение 2 ч в 37 ° C инкубаторе.
- Соберите липопротеинов, содержащих носители.
- Использование проницаемых мембран систему
- Выполните шаги 3.1.1-3.1.2 подготовить липидной смеси.
- Добавьте 10 мл липидного средах, содержащих в апикальную камеру и 10 мл питательной среды в базолатеральной камере.
- Инкубируют в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе. Соберите липопротеинов, содержащих средств массовой информации в базолатеральной камере.
4. Выделение липопротеинов (рисунок 3)
- Удалить остатков клеток от липопротеинов, содержащих сред центрифугированием (2000 х г в течение 5 мин).
- Слейте СМИ в 50 мл трубки.
- Добавить 5,95 г хлорида натрия в средствах массовой информации.
- Если SAmple будут проанализированы ТЕА, добавить 1 ингибитор протеазы коктейль таблетки для поддержания целостности липопротеинов.
- Довести объем до 23 мл с водой (1,2 г / мл NaCl плотность раствора).
- Растворите растворенные вещества полностью.
- Декантировать весь раствор в ультрацентрифужную пробирку из поликарбоната.
- Осторожно накладывать плотность раствора 1,2 г / мл с 0,5 мл воды (1,0 г / мл) плотности.
- Баланс трубки по весу, а не по объему.
- Аккуратно загрузите пробирки в T865 ротора.
- Спин образцов в ультрацентрифуге при 429460 х г в течение 24 ч при 4 ° С.
- Сразу изолировать верхнюю 0,5 мл раствора, осторожно пипеткой. Держите трубку, как до сих пор, как это возможно.
5. Анализ ПЭМ
- Подготовка 5 мл 2% фосфовольфрамовой кислоты (вес / объем) и доведения рН до 6,0.
- Фильтр 2% фосфовольфрамовой кислоты с помощью шприца фильтра (размер пор: 0,2 мкм).
- Падение 20 мкл образца липопротеинов на стерильную чашку.
- Падение 20 мкл фильтрованного 2% фосфовольфрамовой кислоты рядом с образцом на одной тарелки.
- Аккуратно падение ЭМ сетки с тупой стороны отдыхает на образце.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Аккуратно нажмите на сторону сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить образец из сетки.
- Осторожно опустить EM сетки с тупой стороны отдыхает на 2% фосфорно кислоты.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Аккуратно нажмите на стороне сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить фосфовольфрамовой кислоты из сетки.
- Использование ПЭМ, захватить изображения липопротеинов (рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 представлены нормальные 13-дней после сливной Сасо-2 клетки. Появление куполообразных структур и капель внутриклеточных липидов характерны дифференцированных клеток Сасо-2. Когда клетки Сасо-2 не разошлись одинаково во посева, они будут группироваться и зарастают в некоторых районах блюдо; и там будет несколько областей в блюдо без каких-либо клеток. Вихревой и размещение тарелки на наклонной поверхности, следует избегать. Важно также отметить, что после сливной клетки Сасо-2, более восприимчивы к отрыву, когда новые средства массовой рост добавляли к клеткам слишком грубо. Таким образом, новые средства массовой информации должны быть добавлены осторожно, чтобы предотвратить клеток отряд.
На основании этих исследований, эффективность трансфекции клеток Сасо-2 была между 30-60% (рис 2 верхние панели). В противоположность этому, эффективность трансдукции Сасо-2, используя лентивирусов системы экспрессии был примерно 100% (рисунок 2 На фиг.2 также показано, что оптимальное количество концентрированной лентивирусов был 10 мкл. Трансдуцированные Сасо-2 клетки поддерживали до 12 проходов. Как показано, даже после 12 проходов трансдуцированные клетки еще выразил EGFP. Эффективность трансдукции, безусловно, зависит от концентрации лентивирусов. Подтверждение эффективности трансфекции / трансдукции имеет решающее значение, и должны быть выполнены в обычной предварительного анализа до реальных экспериментах. Несмотря на то, Вестерн-блот-анализ может быть использован, чтобы оценить увеличение экспрессии гена процентов, это не должно быть основным методом для определения эффективности трансфекции / трансдукции.
Использование градиента плотности методом ультрацентрифугирования NaCl (рисунок 3), липопротеины, секретируемые Сасо-2 клетки были выделены и проанализированы на ПЭМ. Некоторые из хиломикронов, липопротеидов больше, чем 80 нм в диаметре, были изображены на рис4. Чем меньше липопротеины, ЛОНП, также присутствовали. Важно, чтобы подтвердить успешное выделение обоих хиломикронов и ЛОНП на ПЭМ. Как обсуждалось ранее 8, биохимический анализ не должен быть основным методом подтверждения. Отсутствие липопротеинов, в частности, хиломикроны, указывает, что транспорт липидов по клеток Сасо-2 не является эффективным. Следовательно, они не будут служить хорошей моделью для изучения транспорт липидов. Количество хиломикронов частиц по отношению к общему числу частиц липопротеинов можно пересчитать 8. Высокий процент показывает эффективную транспорт липидов.
Рисунок 1. Представитель микрофотография 13 дней после сливающихся клеток Сасо-2. Внутриклеточный липидные капли видны в некоторых клетках (красная стрелка). Уникальные куполообразные структуры (черная стрелка) FOrmed некоторыми клеток Сасо-2, как правило, присутствует только после того, как клетки достигли слияния. Увеличение = 100X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сравнение эффективности на основе липида трансфекции и лентивирусов системы экспрессии Верхняя панель:. Сасо-2 клетки трансфицированных EGFP pLL3.7 помощью не-липосом для трансфекции реагента (Масштаб бар = 20 мкм). Нижние панели 4: клетки Сасо-2 были трансдуцированных pLL3.7 EGFP использованием лентивирусов системы экспрессии с различными количествами (1, 2, 5 или 10 мкл) концентрированной лентивирусов (LV). Отображаемые клетки от 12-го прохождения оригинальных трансдуцированных клеток. Левые панели показывают окрашивание DAPI, средний годНелс показать флуоресценции GFP, и правая панели показывают объединенные изображения. Система лентивирус выражение, видимо, более эффективны, чем окисления липидов на основе трансфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Выделение кишечной липопротеинов с использованием NaCl градиента плотности ультрацентрифугирования. Плотность липопротеина-содержащей среде доводили до 1,2 г / мл путем добавления соответствующего количества NaCl. Объем образца также должен быть отрегулирован таким образом, чтобы она заполнит весь ультрацентрифужную пробирку, чтобы предотвратить коллапс. Для достижения градиента плотности, 0,5 мл воды осторожно накладывается на г / мл раствора плотностью 1,2. Затем образец центрифугировали при 429460 х г в течение 24 ч с использованием T865Ротор (эквивалентно 2,15 Сведберга единиц). Кишечная липопротеины должны быть немедленно восстановлены, осторожно пипеткой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель электронная микрофотография липопротеинов, производимых клеток Сасо-2. Липопротеины выделенные NaCl с градиентом плотности ультрацентрифугирования отрицательно окрашивали 2% фосфовольфрамовой кислоты (рН 6,0). Chylomicrons, липидные частицы крупнее, чем 80 нм в диаметре, и ЛОНП, тем меньше, чем 80 нм, оба присутствуют. Масштаб бар = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье, эти две системы, которые могут быть использованы для поддержания Сасо-2 клетки описаны, а именно, регулярные блюдо культуры тканей и мембрану. Преимущества с использованием проницаемой мембраны системы включают в себя разделение апикального и базолатеральной отсеки, а также возможность для инкубации липидной смеси и сбора секреции липопротеинов одновременно. Тем не менее, мембрана вставки являются дорогостоящими, и их поликарбонатную мембрану не позволяет хорошей видимости клеток. Одним из преимуществ этой модели ин витро, что генетические исследования манипуляции будет более экономичным и менее трудоемким. Для большей эффективности, лентивирус система экспрессии должен быть использован. Трансдуцированные клетки Сасо-2, как правило поддерживать экспрессию трансгена их.
Способность клеток Сасо-2, чтобы произвести хиломикроны имеет первостепенное значение. Без этой способности, Сасо-2 клетки не смогут efficiently транспортировки липофильные материалы, включая, но не ограничиваясь liphophilic препаратов, витаминов A, D, Е и К, и любых жирорастворимых питательных веществ. Соответствующие методы, чтобы бросить вызов Сасо-2 клетки, чтобы произвести обе частицы ЛПОНП и хиломикронов описаны. Успешно выделение этих частиц липопротеинов должны быть подтверждены на ПЭМ. Исходя из текущей литературы, эта модель Сасо-2 предлагает самый эффективный транспорт липидов среди других Сасо-2 моделей 12 - 14. Тем не менее, в естественных условиях лимфатических катетеризации модель еще транспортирует липиды более эффективно, чем любой модели в пробирке. Лежащие в основе причины, недавно были обсуждены 8, а именно потому, что клетки Сасо-2 производить 2 различные изоформы аполипопротеина В, клетки Сасо-2 не может синтезировать триглицериды из моноглицеридов, и компонент сыворотки критическим для хиломикронов биогенезе может быть ниже в ростовой среде , Важно также понимать, ограничение этого впробирке модель; эта модель в пробирке исключает некоторые потенциальные важные факторы, такие как подвижности кишечника, анатомии кишечнике, и взаимодействие с другими системами органов.
Основными факторами, которые позволяют Сасо-2 клетки производить хиломикроны эффективно являются тип / количество липидов, используемых и клеточной дифференцировки 8. Без надлежащего сочетания этих факторов, клетки Сасо-2 не будет производить значительное количество хиломикронов 8. Следует отметить, NaCl с градиентом плотности ультрацентрифугирование должны быть выполнены должным образом. Успешно изоляция липопротеинов зависит от времени (немедленного без значительных задержек), хорошим примером обработки (крепкий без особого волнения), и осторожно пипеткой (получение только верхний слой). Правильная техника может быть осуществлено с использованием предварительно окрашенных липиды, чтобы помочь визуализировать липопротеинов слой 8. Кроме ТЕМ, биохимические анализы, то есть, аполипопротеина В и триглицеридов анализ, также может быть UСЭД для подтверждения успешной изоляции липопротеинов. Эти биохимические анализы, которые мы ранее сообщали, 8 также может служить в качестве методов количественного в поглощение. Тем не менее, ТЕМ-прежнему должны быть выполнены из-за тенденции липопротеинов агрегировать 2, в результате чего потенциал завышение производства хиломикронов.
Эта модель в пробирке является особенно полезным для изучения диетическое всасывание жира и кишечную абсорбцию липофильных лекарственных средств, витаминов и других жирорастворимых питательных веществ. Он также может служить моделью для улучшения плохой биодоступности пероральных липофильных лекарственных средств. Так липидорастворимые материалы упакованы в хиломикронов энтероцитами для транспортировки в обращении, хиломикронные производству Сасо-2 клетки будут более эффективными в поглощении липофильные препараты. Кроме того, эта модель позволяет исследователям определить роль конкретного гена поглощения наркотиков в кишечнике (Фармакогенетика). Она также позволяет втелями сравнить влияние различных диетических жиров при пероральном липофильном биодоступность препарата. Все эти приложения были обсуждены ранее 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
- Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
- Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
- Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
- Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
- Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
- Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
- Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
- Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
- Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).
