Abstract
قمنا بتطوير منصة الفحص لتحديد مخصصة تحركات البروتينات البشرية للركائز فسفرته والتي يمكن استخدامها لتوضيح رواية مسارات نقل الإشارة. نهجنا ميزات استخدام مكتبة تنقية الموسومة GST تحركات البروتينات البشرية وركيزة البروتين المؤتلف من الاهتمام. وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحديد MAP / أنيبيب التنظيم تقارب كيناز 2 (MARK2) كما كيناز لموقع التنظيم الجلوكوز على الخاضعة للرقابة CREB الترانسكربتي Coactivator 2 (CRTC2)، وهو بروتين اللازم لتكاثر الخلايا بيتا، وكذلك الأسرة AXL التيروزين كيناز كما المنظمين من ورم خبيث الخلية عن طريق الفسفرة من البروتين محول ELMO. وصفنا هذه التكنولوجيا ومناقشة كيف يمكن أن يساعد على وضع خريطة شاملة لكيفية استجابة الخلايا للمؤثرات البيئية.
Introduction
البروتين التعديلات بعد متعدية (PTMs) ضرورية للتواصل بين الخلايا. ولعل أفضل درس لجميع PTMs هو الفسفرة، يحفزه تحركات البروتينات، التي تنظم عدد لا يحصى من وظائف البروتين، بما في ذلك نشاطهم الكيمياء الحيوية، وتوطين التحت خلوية، التشكل، والاستقرار. تحديد المواقع الفسفرة على البروتينات الهدف يمكن تحقيقه عن طريق التعيين phosphopeptide زيتية أو عن طريق تقنيات البروتين الآن القياسية باستخدام عينات المخصب لالببتيدات فسفرته 1،2. في حين من المتوقع أن يتم فسفرته 3 ثلاثة أرباع بروتيوم أعرب وحددت 200،000 مواقع الفسفرة 5، مع تقديرات تصل إلى 1000000 6، وكثير من هؤلاء ليس لهم علم الأحياء المخصصة، مما يشير إلى مسار أو بروتين كيناز.
في حين تحديد المواقع فسفرته واضح ومباشر نسبيا، تحديا أكبر نسبيا هوتحديد كيناز وما شابه ذلك (ق) التي تستهدف هذه المواقع، وهي عملية نطلق عليه رسم الخرائط كيناز: أزواج الركيزة. عدة طرق لتحديد كيناز: وقد وصفت أزواج الركيزة، إما بدءا من كيناز من الفائدة وتبحث عن ركائز، أو بدءا ركيزة من الاهتمام ومحاولة لإيجاد كيناز المعدلة تجريبيا 11/07 أو حسابيا 12. لتحديد تحركات لالركيزة فسفرته معروف، المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تحتوي على تسلسل الحفظ قصيرة من الأحماض الأمينية المرافقة بقايا فسفرته (موقع الإجماع)، فضلا عن تحديد تحركات التي تشكل مجمع precipitable مع الركيزة. ومع ذلك، هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، وغالبا ما لا تفي بالنجاح.
قمنا بتطوير نهج وظيفي منتظم لتحديد بسرعة تحركات التي يمكن أن الفوسفات ركيزة معينة (13). فحص الشاشة تنتج تحديدا ممتازإيتي، مع اختيار واضحة جدا لتحركات المشابهة المحتملة. ونظرا لمركزية الفسفرة إلى الإشارات البيولوجية، والشاشة هي مفيدة لاكتشاف خلية تقريبا في جميع مسارات إشارات 14-16. ينطوي على الشاشة إجراء فحص كيناز على نطاق واسع مع مكتبة من تحركات البروتينات البشرية. تم الموسومة تحركات مع الجلوتاثيون البكتيرية S-ترانسفيراز (GST) البروتين وتنقيته من مقتطفات خلايا الثدييات، وهو ما يعني أن الإنزيمات المؤتلف - على عكس تلك التي أعدت من البكتيريا - تتولد في وجود تحركات البروتينات المنبع في كثير من الأحيان اللازمة ل الانزيمات المؤتلف أن يكون النشاط في المختبر. في الواقع، في حين سيرين، ثريونين، والتيروزين النشاط كيناز اللازمة لتفعيل كيناز المصب الموجودة في الخميرة 10، الجينوم الخميرة بترميز 122 تحركات البروتينات، مشيرا إلى أن kinome الثدييات، مع أكثر من 500 جين 17، أصبحت أكبر بكثير من مجمع ل العاديهالشركة المصرية للاتصالات العمليات الفريدة للكائنات العليا. وعلاوة على ذلك، فإن تأثير المحفزات المختلفة ذات الصلة لبيولوجيا الخلية والأمراض التي تصيب البشر (مثل الجزيئات الصغيرة، عوامل النمو والهرمونات وغيرها) يمكن أن تستخدم ل14،15 تعدل النشاط كيناز في سياق مناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف، لوحات، والخلايا
- جعل 500 مل العازلة تحلل: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 0.5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.5٪ TritonX-100، 5 ملي بيتا سكرولي، 5٪ الجلسرين. تخزينها في 4 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 1 ملي dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد (PMSF)، و 1 ملي فانادات الصوديوم. بعد هذه الخطوة، غير مطلوب PMSF في أي العازلة الشطف.
- جعل 20 مل من 10X كيناز العازلة: 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 50 ملي بيتا سكرولي (FW 216)، 2 مم فانادات الصوديوم. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 5 ملي DTT.
- جعل 20 مل من 10X M-ATP العازلة: 300 ميكرومتر ثالث فسفات الأدينوزين (ATP)، 66 ملي MgCl 2، 33 ملم MnCl 2. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C.
- جعل 100 مل من 2X دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) تحلل العازلة: 1.5 غرام قاعدة تريس، 20 مل الجلسرين، 30 مل H 2 O. حل وضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك. إضافة 40مل 10٪ SDS، وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل. إضافة 25 ملغ الأزرق برموفينول.
- بقعة 4 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر الثدييات التعبير البلازميد ترميز-GST كيناز 14 لكل بئر في مجموعات من 96 لوحات جيدة ولوحات التسمية وفقا لذلك. وختم تجميد لوحات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- 1-2 أيام قبل ترنسفكأيشن، وخلايا ثقافة HEK293T في كامل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية في 37 ° C حاضنة تستكمل مع CO 2 (النهائية 5٪). مع مرور التربسين ولا تسمح الأوراق المالية لتصبح> 80٪ متموجة خلال التوسع. ويلزم ما لا يقل عن 6 × 10 7 خلايا للشاشة (حوالي 3 × 15 سم أطباق من الخلايا HEK293T في 80٪ التقاء).
2. ترنسفكأيشن
ملاحظة: انظر الشكل 1 للاطلاع على سير بروتوكول بأكمله.
- إذا كان قد تم تجميدها لوحات تحتوي على البلازميدات كيناز، ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لالثانية الطرد المركزي في 1900 x ج لمدة 3 دقائق لجمع أي رطوبة في الجزء السفلي من الآبار.
- خلط 8.6 مل من انخفاض متوسط المصل (على سبيل المثال، OPTI-MEM) مع 312.7 ميكرولتر من الدهون على أساس كاشف ترنسفكأيشن. اتركيه لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض متوسط المصل إلى كل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير.
- إضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من انخفاض متوسط المصل / ترنسفكأيشن مزيج كاشف من الخطوة 2.2 باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. اتركيه لمدة 20 إلى 45 دقيقة.
- Resuspend الخلايا 293T على 7.5 × 10 5 خلية / مل في 80 مل من DMEM. إضافة 100 ميكرولتر من التعليق الخلية (أي 7.5 × 10 4 خلايا) لكل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية.
- تحقق من الآبار تحت المجهر لتوزيع الخلايا موحد والعودة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
المنسدلة 3. GST-كيناز
- جعل وresh: 4 ملي حل pervanadate عن طريق خلط 60 ميكرولتر من 0.2 M فانادات الصوديوم مع 540 ميكرولتر من H 2 O. في مزيج الأنبوب الثاني 2.7 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد و 1.4 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة الحلين معا، وترك الجلوس لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
- باستخدام ماصة الأقنية (لا تستخدم موزع السائل الآلي لأنها تخلق الكثير من الاضطراب في البئر) الاستغناء 2 ميكرولتر من 0.25 M CaCl 2 في كل بئر، تليها 2.5 ميكرولتر من pervanadate أعدت في الخطوة 3.1. احتضان كل لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم ضع على الجليد.
- إعداد 35 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT، PMSF، وفانادات الصوديوم كما هو مبين في القسم 1 (إعداد الكواشف).
- حفظ وحات على الجليد، وإزالة المتوسطة من كل بئر باستخدام الشافطة فراغ. على الفور إضافة 50 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت القياسية. اتركيه مدة 30 دقيقة على الجليد لليز (اختياري: يمكن أن تتوقف هنا إذا لزم الأمر عن طريق ختم بلاته وتخزينها في -80 ° C. للمتابعة، لوحات ذوبان الجليد على الجليد).
- لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تتخلص الخلايا من كل بئر باستخدام ماصة الأقنية ونقل جميع محتويات المسمى بشكل مناسب لوحات 96 بئر V-القاع. لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- أثناء الدوران، وملء الجلوتاثيون المغلفة لوحات (واحد لكل لوحة 96-جيدا) مع 100 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة (بدون PMSF) باعتباره شطف. الحفاظ على لوحات على الجليد.
- إزالة لوحات V-السفلي من أجهزة الطرد المركزي. في وقت واحد، عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. نقل العازلة تحلل من لوحات V-القاع إلى لوحات الجلوتاثيون عن طريق إمالة لوحة وباستخدام ماصة الأقنية، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي. تغطية لوحات وترك على الجليد لمدة لا تقل 2 ساعة الربط.
- على مقربة من نهاية الخطوة ملزم 2 ساعة، وإعداد محطة عمل النشاط الإشعاعي، وضمان رانه احتياطات السلامة الضرورية هي في مكان للعمل الإشعاعي. ضبط الفرن التهجين إلى 30 ° C.
- إعداد 200 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT والصوديوم فانادات كما هو مبين في القسم 1. PMSF ليس مطلوبا في هذه المرحلة.
- عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. شطف الآبار 3X مع 100 ميكرولتر العازلة تحلل (بدون PMSF). لا تدع الآبار الجلوس الجافة - الاحتفاظ بها في شطف حتى على استعداد للمضي قدما.
- إعداد 55 مل من 1X العازلة كيناز (KB) من خلال تمييع الأسهم 10X وإضافة DTT كما هو مبين في القسم 1. لوحات شطف مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من 1X KB باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية. ترك 1X KB في الآبار حتى حل A جاهز:
- إعداد الحل A بإضافة 500-530 ميكروغرام من الركيزة المصالح، 500 ميكروغرام من البروتين الأساسي المايلين (ب ب)، 2.65 مل من 10X KB، 13.25 ميكرولتر من 1 M DTT، وH 2 O ما يصل الى 15.9 مل.
- إعداد الحل B في منطقة العمل الإشعاعي وذلك بإضافة 2.5 مل 10X M-ATP، 500 μCi أشعة غاما 32 P ATP، وH 2 O إلى 10 مل.
- إضافة 20 ميكرولتر من محلول B لكل بئر باستخدام ماصة مكرر الذي يساعد في خلط بسبب قوة الطرد. تغطية واحتضان في 30 ° C الفرن التهجين لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة، ونقل لوحات إلى جليد. إضافة 50 ميكرولتر من 2X SDS العازلة تحلل إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. يمكن المضي قدما في هذه المرحلة إلى الخطوة التالية، أو ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مريحة.
4. الجري، تلطيخ، والمواد الهلامية التجفيف
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال في منطقة DESIGNAتيد لنشاط إشعاعي.
- تشغيل الفرن التهجين وتعيين إلى 85 درجة مئوية. لوحات ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة وصلت درجة حرارة الفرن، لوحات نقل إلى الفرن واحتضان لمدة 10 دقيقة لتفسد العينات.
- تحميل 26-كذلك المواد الهلامية مسبقة الصب مع 15 ميكرولتر من كل رد فعل باستخدام ماصة الأقنية لملء العديد من الآبار في وقت واحد. ويجب الحرص على أن جميع النصائح محاذاة مع المقابلة بشكل جيد قبل أن يضيف العينات. تشغيل هلام في 150 V. لا تدع تتبع صبغ (الخط الأزرق) تشغيل الخروج من الجزء السفلي من هلام لأن هذا يحتوي على ATP غير مدمج.
- تفكيك المواد الهلامية وقطع ATP غير مدمج (الخط الأزرق) باستخدام مشرط أو حافة مستقيمة لأنها سوف إفرط في التعريض الأفلام. وضع المواد الهلامية في حاويات وصفت وتغطي مع Coomassie وصمة عار لمدة 15 دقيقة.
- إزالة وصمة عار Coomassie، لفترة وجيزة شطف المواد الهلامية مع الماء، وإضافة يزيل اللون الحل. يزيل اللون المواد الهلامية حتى البروتينات هي واضحة للعيان. فرقة لMBP وفرقة لالركيزة ينبغييكون لكل عينة واضحة.
- لتجفيف المواد الهلامية:
- قطع ورقة كبيرة من ورق الترشيح ووضعه على مجفف.
- الرطب ورقة السيلوفان في الماء المقطر حتى على نحو سلس وتجعد الحرة، ووضعه على رأس ورقة.
- وضع الجل على رأس ورقة السيلوفان، مما يجعل علما ترتيب المواد الهلامية. الرطب ورقة السيلوفان الثانية ووضع على رأس المواد الهلامية.
- طرح جميع فقاعات (لوحة ختم الأسطوانة يعمل بشكل جيد لهذا) لطيفة سطح موحدة. إغلاق رفرف، بدوره على فراغ، وتجفيف المواد الهلامية لمدة 3 ساعة على 80 درجة مئوية.
- مرة واحدة الهلام جافة، يعرضهم لفيلم XAR باستخدام الشاشة لتكثيف الإشارة. التفاف كاسيت مع التفاف ساران أو كيس من البلاستيك وختم بشريط لمنع دخول الصقيع. تخزين الكاسيت في -80 درجة مئوية خلال الليل.
5. تطوير XAR أفلام
- في اليوم التالي، وإزالة كاسيت من الثلاجة والسماح ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. تطوير الفيلم فيغرفة مظلمة باستخدام معالج الفيلم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: فحص الأفلام عن أدلة على أزواج كيناز الركيزة. A التعرض الطويل الثاني ويمكن أيضا أن تكون مفيدة للكشف عن أحداث الفسفرة الأضعف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر نتائج ممثلة من شاشة في الشكل 2. تم فحص 180 تحركات باستخدام الببتيد الركيزة GST الموسومة الموافق أأ 268-283 من CRTC2 وكذلك البروتين الأساسي الكلاسيكي كيناز فحص الركيزة المايلين (ب ب). اثنين فقط من تحركات، MARK2 وMARK3 كيناز ذات الصلة للغاية مفسفر الببتيد CRTC2. يتم تضمين MBP باعتبارها الرقابة الداخلية في جميع المقايسات، كما أنه يحتوي على العديد من بقايا phosphorylatable ويمتد على 18 كيلو دالتون، نحو الجزء السفلي من هلام. هذا يسمح لتفسير خصوصية: فإن بعض كيناز الفوسفات بقوة ركيزة وMBP. وتجدر الإشارة هنا إلى أن الآبار التي تحتوي GST وحده (أي أي ضوابط كيناز) تنقية دائما بعض النشاط كيناز الذاتية، وبالتالي هناك دائما الفسفرة الخلفية في الفحص. في حين أن هذا لا يستبعد أن الفسفرة من الركيزة الحقيقية، فإنه يشير إلى أن في المختبر في وضع كيناز قد تكون أقل انتقائية.فإنه من المفيد بشكل خاص لتشمل ركائز متعددة من اختلاف MW استخلاص استنتاجات بشأن كيناز الركيزة خصوصية.
الشكل 1. مخطط يبين الخطوات الرئيسية في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يقوم الشكل 2. مثال على نتائج الشاشة. Autoradiographs من شاشة من صفحة 1 من المكتبة (180 تحركات البروتينات البشرية) باستخدام GST-الببتيد الركيزة الموافق أأ 268-283 من الماوس CRTC2 (مستنسخة من جانسون وآخرون، 2008). MBP، يشار البروتين الأساسي المايلين. درجة عالية من الصورةاختيار ubstrate التي كتبها تحركات ذات الصلة هي ميزة من الشاشة. كل حارة يمثل نواتج التفاعل من كيناز فحص متميزة. MARK3 (جل 1) وMARK2 (جل 16)، وتحركات الوحيدة لالفوسفات TORC2 268-283 الببتيد، والمشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ المنشورات الأصلية واصفا نهج 14،15، تم توسيع المكتبة الأصلي من 180 GST-تحركات إلى 420 عضوا، أو ~ 80٪ من kinome البروتين البشري. مع مكتبة الموسعة، البروتوكول كما هو موضح يستغرق 4-5 أيام ثم 1-4 أيام لتطوير الأفلام (بحسب ما تقتضيه الضرورة)، والتي يمكن اختصارها عن طريق استخدام phosphorimaging وتعزيز الإشارات الرقمية. هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي يجب توخي الحذر (انظر الشكل 1 لمحة عامة عن بروتوكول). أولا، هو صحة المخزون من الخلايا (الميكوبلازما الحرة، لم يسمح للوصول إلى نقطة التقاء أثناء التوسع، وتعامل مع التربسين في كل ممر) خلال مرحلة التوسع دفعة وفي 96 لوحات جيدة في وقت ترنسفكأيشن. وينبغي أن تكون خلايا المصنف موحد، و 80٪ متموجة عندما يأخذ ترنسفكأيشن مكان (الخطوة 1.5).
ثانيا، وهو مثالي خلال ترنسفكأيشن لاستخدام موزع السائل الآلية لتقليل حجم transfأخطاء إيه، مما يحد من معامل الاختلافات ("السير الذاتية") بين الآبار. لأحجام صغيرة، تركيب موزع مع أصغر حجم الخسائر حدود كاسيت كاشف بسبب انخفاض كميات الميتة وزيادة الاستغناء عن الدقة. يستخدم الخطوة العلاج مع pervanadate الصوديوم، وعموم التيروزين الفوسفاتيز المانع، كحافز العام لزيادة حالة الفسفرة من تحركات الهدف. إدراج الكالسيوم في هذه الخطوة يزيد خلية مصفوفة التصاق، ومنع فقدان الخلية بسبب التقريب التي تسببها العلاج pervanadate طويلة. يجب أن تتم هذه الخطوة مع الالتزام الصارم فترة حضانة 10 دقيقة.
ثالثا، لفحص كيناز نفسه، هناك عدة اعتبارات عند اختيار الركيزة المؤتلف: الببتيدات، المجالات بروتين، أو البروتينات سليمة كبيرة مثل 120 كيلو دالتون يمكن لجميع استخدامها. إذا كان من المعروف موقع الفسفرة معين، ركيزة الببتيد هو النهج الأكثر مباشرة إلى الأمام، ولكن يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للكشف عنعلى هلام SDS-PAGE. وهكذا، ركائز الببتيد يمكن تنصهر GST وتنقيته من البكتيريا لإعطاء ميجاوات من> 25. البروتينات الكبيرة لديها ميزة أنها من المرجح مطوية وبقاياها phosphorylatable يتعرض لأنها ستكون في الخلية، ولكن تأتي مع العيب أنها سوف تشمل المخلفات الإضافية التي يمكن أن تكون فسفرته وإعطاء إشارة في الفحص. لدينا الأفضلية لتشغيل الشاشة باستخدام ركيزة الببتيد يتكون من 15-20 الأحماض الأمينية المحيطة بقايا ما هو معروف أن فسفرته في الجسم الحي وكما هو معروف لتنظيم حدث بيولوجي، وهذا يجعل التحقق من تحركات المرشح من الشاشة على حد سواء في المختبر والمجراة أسرع بكثير.
وأخيرا، من الناحية المثالية كمية النهج البروتين أو يتجاوز 1 ميكروغرام لكل بئر. هذا بالطبع يختلف مع MW الركيزة. أقل من البروتين لكل بئر يمكن أن تسفر عن إصابات ذات معنى، ولكن 'أكثر هو أفضل "تنطبق القاعدة كما أنه يزيد إشارة: نويحد ذاتها. المعيار، ينصح المواد الهلامية غير التدرج كما صدع المواد الهلامية التدرج في كثير من الأحيان أثناء التجفيف. بعد تجفيف المواد الهلامية، والكشف عن إشارة المشعة على خلفية مع عداد جيجر يعطي مؤشرا ممتازا على نجاح الفحص.
كما الشاشة في المختبر وجود مستويات إضافية من التعقيد في الجسم الحي، يجب التحقق من صحة كيناز مرشح ل ركيزة معينة في الخلايا. على وجه التحديد، الشاشة قد تحدد أحد أفراد الأسرة التي لديها القدرة الحيوية إلى الفوسفات الركيزة في المختبر، ولكن ليس أعرب في نفس نوع من الخلايا أو في نفس التحت خلوية والركيزة. على سبيل المثال، في حين كانت MARK2 وMARK3 كل من يضرب في شاشة لكيناز التي يمكن أن الفوسفات CRTC2 على Ser275، فقط MARK2 شكلت مجمع مع الركيزة في الخلايا 14. وفيما يلي سلسلة من التجارب الإضافية التي يمكن استخدامها لتأكيد أهمية الفسيولوجية للكيناز مرشح. خشب التنوبالحادي و، والتحولات تنقل الركيزة على SDS-PAGE التالية coexpression من كيناز مرشح يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة تأكيد. يمكن أن الضوابط المناسبة هذا cotransfection من كيناز الخاملة حفاز تأكيد التحديد. ثانيا، الركيزة يمكن immunoprecipitated من مقتطفات الخلية التي تم حضنت مع 32 P-الفوسفاتية لتأكيد إدماج الفوسفات إلى الركيزة في وجود wildtype وليس كيناز الخاملة حفاز. ثالثا، يمكن توليد الأجسام المضادة ضد phosphospecific تسلسل phosphoacceptor (إذا كان معروفا) وتستخدم لتأكيد زيادة في الركيزة الفسفرة عندما هى overexpressed كيناز. شاشة الثانوية باستخدام الركيزة متحولة يحمل بقايا غير phosphorylatable في موقع الهدف يمكن تأكيد خصوصية قبل جيل من phosphoantibody، عنصر تحكم أهمية خاصة مع نطاق أكبر وبروتين كامل طول ركائز. النهج تثبيط الدوائية لمنع وكانديويمكن أيضا تاريخ كيناز استخدامها، ولكن يجب توخي الحذر كما تثبيط تحركات ذات الصلة واقع تقدر حق قدرها. وأخيرا، رني بوساطة إسكات كيناز مرشح (ق) في خلايا المتبعة والنشاف الغربي لمراقبة فقدان الموقع المستهدف الفسفرة مع الأجسام المضادة phosphospecific لا يمكن أن يؤديها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منح NSERC 386634. ونود أن نشكر أعضاء مختبر Screaton لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
