Abstract
우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST - 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 3 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 6까지 예상치 200,000 인산화 부위 5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다.
인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 7-11 또는 실험적 계산 (12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다.
우리는 주어진 빠르게 기판 (13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 - 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 - 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 (10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 17 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 (14, 15)는 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.
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Protocol
시약, 플레이트, 및 세포의 1. 준비
- 25 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 50 mM의 불화 나트륨, 0.5 mM의 EDTA pH를 8.0, 0.5 % 트리톤-100, 5mM의 베타 - 글리세로 포스페이트, 5 % 글리세롤 : 500 ml의 용해 완충액을 만든다. 4 ℃에서 보관하십시오. 사용 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 및 1 mM의 나트륨 바나 데이트를 추가하기 직전. 이 단계 후에, PMSF가 임의의 세정 완충액으로 요구되지 않는다.
- 200 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 베타 글리세 (FW 216), 2 mM의 나트륨 바나 데이트 : 10 배 키나제 버퍼의 20 mL로한다. -20 ° C에서 1 ml의 튜브에 나누어지는 및 저장. 사용 5 mM의 DTT를 추가하기 직전.
- 300 μM 아데노신 삼인산 (ATP), 66 밀리미터의 MgCl 2, -20 ° C에서 33 mM의 MnCl 2 1 ml의 튜브에 나누어 저장 : 10 배 M-ATP 버퍼의 20 mL로한다.
- 배 도데 실 황산나트륨 100 mL로 (SDS)를 용해 완충액 : 1.5 g 트리스베이스, 글리세롤 20 ㎖, 30 ㎖의 H 2 O. 용해 및 HCl로 6.8에 산도를 조정합니다. 40 추가ml의 10 % SDS는 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 25 mg의 브로 모 페놀 블루를 추가합니다.
- 스팟 따라 96 웰 플레이트와 라벨 플레이트 세트에서 잘 당 GST-키나제 (14)를 인코딩 (25) NG / μL 포유 동물 발현 플라스미드의 4 μL. 사용할 때까지 -20 ° C에서 인감 및 동결 판.
- 형질 전환 1-2 일 전에, CO 2 (최종 5 %)로 보충 된 37 ℃ 배양기에서 배양 HEK293T의 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 항생 물질의 세포. 트립신과 통로는 주식이 확장시> 80 % 합류가 될 수 없습니다. 6 × 10 7 세포의 최소 화면 (80 % 합류에 HEK293T 세포의 약 3 × 15cm 요리)가 필요합니다.
2. 형질
참고 : 전체 프로토콜의 흐름도는 그림 1을 참조하십시오.
- 키나아제 플라스미드를 함유하는 플레이트를 동결 되었으면, 실온에서 해동차 우물의 바닥에서 습기를 수집하기 위해 3 분 동안 1,900 XG에 원심 분리기.
- 지질 기반 형질 전환 시약의 312.7 μL와 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM)의 8.6 ml의 혼합. 5 분 동안 앉아 보자.
- 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 각 웰에 감소 혈청 매체의 10 μl를 추가합니다.
- 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용 단계 2.2에서 감소 된 혈청 배지 / 형질 전환 시약 믹스 잘 당 10 μl를 추가합니다. 20-45 분 동안 앉아 보자.
- 전체 80ml의 DMEM에 7.5 × 105 세포 / ml로 재현 탁 293T 세포. 잘 표준 볼륨 카세트 장착 자동 액체 디스펜서를 사용하여 당 세포 현탁액 (즉, 7.5 × 10 4 세포)의 100 μl를 추가합니다.
- 균일 한 세포 분포에 대한 현미경으로 우물을 확인하고 24 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
3. GST-키나제 풀다운
- F 확인resh : H 2 O의 540 μL와 0.2 M 나트륨 바나 데이트 60 μl를 혼합하여 4 mM의 pervanadate 솔루션 제 2 튜브 믹스 30 % 과산화수소 2.7 μL와 PBS 1.4 ml 중에. 함께 두 가지 솔루션을 추가하고 사용하기 전에 15 분 동안 앉아 보자.
- (이것은 또한 너무 많은 난류를 생성로서 자동화 액체 디스펜서를 사용하지 않는) 단계 3.1에서 제조 pervanadate 2.5 μL,이어서 각 웰에 0.25 M CaCl2를 2 μL 분주 멀티 채널 피펫을 사용. 10 분 동안 37 ℃에서 각각의 판을 품어 후 얼음에 배치합니다.
- 제 1 (시약의 제조)에 나타낸 바와 같이 DTT, PMSF, 나트륨 바나 데이트를 첨가하여 용해 완충액 35 mL로 제조.
- 얼음에 판을 유지, 각 웰 진공 흡입기를 사용하는 매체를 제거합니다. 즉시 표준 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 50 μL / 웰의 차가운 얼음 용해 버퍼를 추가합니다. 를 Lyse에 얼음에 30 분 앉아 보자 (옵션 : 작은지면을 밀봉하여 여기에 필요한 경우 중지 할 수 있습니다전자 및 -80 ° C에서 저장. 얼음에, 해동 판)을 계속합니다.
- 4 ℃에서 3 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
- 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하는 세포를 긁고 모든 내용을 전송 적절 V 바닥 96 웰 플레이트를 표시합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
- 회전하는 동안, 린스 100 μL / 웰의 (PMSF)없이 차가운 얼음 용해 버퍼와 글루타티온 코팅 된 플레이트 (각 96 웰 플레이트에 대해 하나)를 입력합니다. 얼음에 판을 보관하십시오.
- 원심 분리기에서 V-바닥 플레이트를 제거합니다. 한 번에 하나는 종이 타월에 용해 버퍼와 얼룩을 흔들 싱크를 통해 글루타티온 판을 반전. 하단에있는 펠렛을 방해하지에주의하면서 판을 기울 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타티온 판에 V-바닥 판에서 용해 버퍼를 전송합니다. 판 커버와 결합하는 최소 2 시간 동안 얼음에 둡니다.
- 2 시간 바인딩 단계의 마지막에 가까운, T을 보장 방사능 워크 스테이션을 준비그는 필요한 안전 조치는 방사성 작업 장소에 있습니다. 30 ° C로 설정 하이브리드 오븐.
- 이 단계에서 필요하지 않은 제 1 절 PMSF에 표시된 추가 DTT 나트륨 바나 데이트에 의해 용해 완충액 200 ㎖를 준비합니다.
- 용해 버퍼를 흔들 종이 타월에 가릴 수있는 싱크대 글루타티온 플레이트 전환. 헹구고 웰 (PMSF)없이 100 ㎕의 용해 완충액으로 3 배. 진행 할 준비가 될 때까지 세정에 보관 - 우물이 마른 앉게하지 마십시오.
- 10 배 주식을 희석하고 표준 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 1X KB의 50 μL 1. 린스 판 한 번 섹션에 표시된대로 DTT를 추가하여 1X 키나제 버퍼 (KB) 55 mL로 준비합니다. 솔루션이 준비가 될 때까지 우물에 1X KB를 남겨주세요 :
- 15.9 ml의 최대 530 관심있는 기판의 μg의, 미엘린 염기성 단백질 500 μg의 (MBP), 10 배의 2.65 ml의 KB, 1 M DTT의 13.25 μL, 및 H 2 O 500을 추가하여 솔루션을 준비합니다.
- 2.5 ml의 10 배 M-ATP, 500 μCi를 감마 (32) P의 ATP, 및 H 2 O에 10 ㎖를 첨가하여 방사능 작업 영역 용액 B를 준비한다.
- 잘 배출 힘에 의한 혼합에 도움 리피터 피펫을 사용하여 당 용액 B 20 μl를 추가합니다. 덮고, 30 분 동안 30 ° C의 오븐에서 혼성화 부화.
- 30 분 후, 얼음에 다시 접시를 전송합니다. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 2 배 SDS 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 다음 단계로이 시점에서 진행, 또는 편리한 때까지 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장과 번호판을 봉인 할 수 있습니다.
4. 달리기, 염색, 건조 젤
참고 : 모든 작업은 지역 DESIGNA에서 수행되어야한다방사능에 대한 테드.
- 하이브리드 오븐의 전원을 켜고 85 ℃로 설정합니다. 실온에서 해동 판. 일단 오븐 오븐 10 분 샘플을 변성하는 동안 배양 온도, 이전 판에 도달했습니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 반응의 15 μL와로드 26 웰 프리 캐스트 젤은 한 번에 여러 우물을 채우기 위해. 케어는 모든 팁 대응도 전에 샘플을 추가로 정렬 않도록주의해야합니다. 이 비법 인 ATP를 포함로 추적 염료 (파란 선)은 젤의 바닥 떨어져 실행하지 못하게 150 V.에서 젤을 실행합니다.
- 젤을 해체하고 메스하거나 영화를 과다하므로 직선을 사용하여 비법 인 ATP (파란 선)을 차단. 라벨이 붙은 용기에 젤을 놓고 15 분 동안 쿠마 얼룩 커버.
- 간단히, 쿠마 얼룩을 제거 물 젤을 씻어 및 솔루션을 destain 추가합니다. 젤 Destain 단백질은 명확하게 볼 수 있습니다 때까지. MBP를위한 밴드 및 기판 밴드해야각 샘플에 대한 표시.
- 젤을 건조 :
- 필터 큰 종이를 잘라 건조기에 놓습니다.
- 이 부드러운 때까지 증류수에 셀로판 시트를 적시고 무료 주름, 용지의 상단에 배치.
- 젤의 순서를 기록하고, 셀로판 시트의 상단에 젤을 놓습니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다.
- 좋은 균일 한 표면에 대한 모든 거품을 (플레이트 밀봉 롤러이 잘 작동) 출시. 플랩을 닫고 진공 켜고 80 ℃에서 3 시간 동안 젤을 건조.
- 겔이 건조되면, 신호를 강화하기 위해 스크린을 사용 XAR 필름에 노출. 사란 랩 또는 비닐 봉지와 카세트를 감싸고 서리을 유지하기 위해 테이프로 밀봉. -80 ° C 하룻밤에 카세트를 저장합니다.
5. XAR 필름 개발
- 다음 날, 냉장고에서 카세트를 제거하고 실온에서 해동을 할 수 있습니다. 의 필름 개발암실은 제조자의 지시에 따른 필름을 사용하여 프로세서.
참고 : 키나제 기판 쌍의 증거에 대한 영화를 검사합니다. 두 번째 이상 노출도 약한 인산화 이벤트를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다.
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Representative Results
화면에서 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 180 키나아제는 CRTC2뿐만 아니라 고전 키나아제 검정 기질 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로부터 AA 2백68부터 2백83까지 대응 GST 표지 된 펩티드 기질을 사용하여 스크리닝 하였다. 단 두 키나제, MARK2와 매우 관련 키나아제 MARK3는 CRTC2 펩타이드를 인산화. 그것은 많은 phosphorylatable 잔류 물을 포함하고 젤의 아래쪽으로, 18 kDa의에서 실행되는 MBP, 모든 분석에서 내부 통제 포함되어 있습니다. 이 특이성의 해석을 허용 : 일부 키나제는 견고 기판과 MBP를 인산화합니다. 여기에 참고로하여 항상 분석에서 배경 인산화가, (노 키나제 컨트롤 IE) 혼자 GST가 포함 된 우물은 항상 어떤 내인성 키나제 활성을 정화한다는 것입니다. 이 기판의 인산화가 진짜임을 배제하지 않지만, 그것은 이하 선택적 일 수있다 키나아제 설정 체외에서 그 제안 않는다.그것은 키나제 - 기질 특이성에 대한 결론을 도출 MW 서로 다른 여러 개의 기판을 포함하는 것이 특히 유익하다.
그림 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 1. 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
라이브러리 (180 인간의 단백질 키나아제)의 버전 1의 화면의 그림 화면 결과 2. 예. Autoradiographs은 (얀손에서 재생 등., 2008) 마우스 CRTC2의 AA 268-283에 해당하는 GST-펩타이드 기질을 사용하여 수행. MBP, 미엘린 염기성 단백질이 표시됩니다. S의 높은 수준의관련 키나아제에 의해 ubstrate 선택은 화면의 기능입니다. 각 레인은 별개의 키나제 분석에서 반응 생성물을 나타낸다. MARK3 (젤 1) MARK2 (겔 16), 유일한 키나제가 TORC2 268-283 펩타이드을 인산화하는, 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
14,15 접근법을 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있습니다. 우선, 세포의 콘텐츠의 상태이다 (마이코 플라스마 무료, 팽창 중에 합류에 도달 할 수 없다, 각 통로에서 트립신) 배치 팽창 단계 동안 및 트랜시의 96 웰 플레이트에서. 형질 장소 (단계 1.5)를 취한다 때 세포는 균일 시드, 그리고 80 %의 합류해야한다.
둘째로, 그것은 볼륨 TRANSF을 최소화 자동화 액체 분배기를 사용하는 형질 감염 동안 적합ER 오류, 따라서 웰 사이의 변동 계수 ( "CVS")을 한정. 감소 된 죽은 볼륨과 정확성을 분배 증가에 작은 볼륨 카세트 제한 시약 손실 디스펜서 피팅 작은 볼륨하십시오. 나트륨 pervanadate, 팬 티로신 포스파타제 억제제와 처리 단계는 표적 키나아제의 인산화 상태를 증가시키는 일반적인 자극으로서 사용된다. 이 단계에서의 칼슘의 포함으로 인해 장기간 pervanadate 처리에 의해 유도 반올림 세포 손실 방지, 세포 매트릭스의 밀착성을 증가시킨다. 이 단계는 10 분 배양 시간을 엄격하게 준수하여 수행해야합니다.
모두가 사용될 수있다 (120)만큼 클 kDa의 펩티드, 단백질 도메인, 또는 본래 단백질 : 셋째, 키나아제 분석 자체 몇몇 재조합 기판을 선택 사항이있다. 특정 인산화 부위를 안다면, 펩티드 기질은 가장 직선적 접근법이지만, 검출하기에 충분히 커야SDS-PAGE 젤에. 이와 같이, 펩티드 기질은> 25 MW를 수득 세균 GST 융합 및 정제 할 수있다. 더 큰 단백질들은 가능성 접어 그들이 셀에 아직 그들이 인산화 및 분석에서의 신호를 줄 수있는 추가의 잔기를 포함 할 것이다 단점으로 와서 그들의 phosphorylatable 잔기가 노출 된 이점을 갖는다. 우리의 환경이 모두 스크린에서 후보 키나제의 유효성을 렌더링로서, 생체 내에서 인산화 될 알려져 있고 생물학적 사건을 조절하는 것으로 알려져있다 잔사를 둘러싸 15-20 아미노산으로 구성된 펩타이드 기질을 이용하여 화면을 실행하는 것 체외에서 훨씬 빠른 생체 내에서.
마지막으로, 단백질 접근 방식의 이상적인 양 또는 잘 당 1 μg의를 초과; 이것은 물론 기판의 MW에 따라 변한다. 웰 당 적은 단백질 의미 적중을 수득 할 수 있지만, 그것으로 신호를 증가 규칙 적용 '더 나은 인'노이그 자체. 그라데이션 젤은 건조 중에 너무 자주 균열로 표준, 비 그라데이션 젤을 권장합니다. 젤을 건조시킨 후, 가이거 카운터와 배경 위에 방사성 신호의 검출은 분석의 성공의 우수한 표시를 제공합니다.
화면 시험관에 추가의 복잡성 레벨이 생체 내에서 존재하는 한, 주어진 기판 후보 키나아제 (들)은 세포에서 검증되어야한다. 구체적으로는, 화면이 아직 동일한 세포 유형에서 또는 기판과 같은 세포 내 구획에서 발현되지 않는 생체 외 기질을 인산화하는 생화학 적 능력을 가지고 가족을 식별 할 수있다. MARK2 및 MARK3 모두 히트 Ser275의 인산화를 CRTC2 수 키나아제 화면에있는 동안, 예를 들어, 만 MARK2 셀 (14) 기판과의 착체 형성. 후보 키나아제의 생리 학적 관련성을 확인하는데 사용되는 추가의 일련의 실험은 다음과. 전나무세인트는 후보 키나아제의 동시 발현 다음 SDS-PAGE에 기판의 이동 변화는 확인 제어로 사용될 수있다. 적절한 제어 촉매 비활성 키나제의 그런에 cotransfection는 특이성을 확인할 수 있습니다. 둘째, 기판을 촉매 비활성을 야생형 키나제의 존재 하에서 기질에 인산염의 혼입을 확인 오르토 P-32과 함께 배양하고되지 않은 세포 추출물로부터 면역 침전 될 수있다. 셋째, 포스 포 - 항체 phosphoacceptor 시퀀스에 대해 생성 (알려진 경우) 및 키나제가 과발현되는 경우, 기판의 인산화의 증가를 확인 할 수있다. 목표 부위에서 비 phosphorylatable 잔사를 운반 돌연변이 기판을 이용한 이차 화면 전에 phosphoantibody 큰 도메인 및 전장 단백질 기질과 특히 중요한 제어의 발생에 특이성을 확인할 수있다. 약리 억제 칸디 억제 접근법날짜 키나아제가 또한 사용될 수있다, 그러나주의가 관련 키나아제의 억제로 발휘해야하는 과소 현실이다. 마지막으로, 수행 될 수있는 세포 내 키나제 후보 (들)의 침묵을 따라 웨스턴 블롯 포스 포 항체 표적 부위 인산화의 감소를 감시하기는 RNAi를 매개.
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Acknowledgments
이 작품은 NSERC 부여에 의해 지원되었다 386634. 우리는 도움이 토론 Screaton 연구소의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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