Abstract
Vi har utviklet en plattform for screening for å identifisere humane dedikerte proteinkinaser for fosforylerte substrater som kan brukes til å belyse nye signaltransduksjonsveier. Vår tilnærming har den bruk av et bibliotek av renset GST-merket human proteinkinaser og et rekombinant protein substrat av interesse. Vi har brukt denne teknologien for å identifisere MAP / microtubule affinitet regulerende kinase 2 (Mark2) som kinase for en glukose-regulert område på CREB-regulert Transkripsjonell Coactivator 2 (CRTC2), et protein som kreves for beta-celle proliferasjon, samt Axl familie av tyrosin kinaser som regulatorer av celle metastase ved fosforylering av adapteren protein ELMO. Vi beskriver denne teknologien, og diskutere hvordan det kan bidra til å etablere et helhetlig kart over hvordan cellene reagerer på miljømessige stimuli.
Introduction
Protein post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) er avgjørende for intracellulær kommunikasjon. Kanskje den beste studert av alt PTMs er fosforylering, katalysert av protein kinaser som regulerer et mylder av protein funksjoner, inkludert deres biokjemiske aktivitet, subcellulære lokalisering, konformasjon, og stabilitet. Identifiseringen av fosforyleringsseter på målproteiner kan oppnås ved tryptisk kartlegging eller phosphopeptide nå er standard proteomic teknikker ved bruk av prøver anriket for fosforpeptider 1,2. Mens tre fjerdedeler av det uttrykte proteom- forventes å bli fosforylert tre og en identifisert 200.000 fosforyleringsseter 5, med anslag opp til 1 million 6, mange av disse har ingen tildelt biologi, signalveien, eller protein kinase.
Mens identifisering av fosforylerte nettsteder er relativt grei, en forholdsvis større utfordring er åidentifisere beslektet kinase (e) som er rettet mot disse områdene, en prosess vi kaller kartlegging kinase: substrat par. Flere metoder for identifisering av kinase: substrat-par er blitt beskrevet, enten å starte med en kinase av interesse og ser etter dens underlag eller å starte med et substrat av interesse og å forsøke å finne en modifiserende kinase eksperimentelt 7-11 eller 12 beregningsmessig. For å identifisere kinaser kjent for en fosforylert substrat, kan bioinformatikk anvendes for å identifisere proteiner som inneholder en kort konservert sekvens av aminosyrer som flankerer den fosforylerte rest (konsensus-området), i tillegg til å identifisere kinaser som danner en utfellbar kompleks med substratet. Disse metodene er tidkrevende og ofte tilfredsstiller ikke med hell.
Vi utviklet en systematisk funksjonell tilnærming til raskt å identifisere kinaser som kan fosforylerer et gitt substrat 13. Skjermen analysen produserer utmerket spesifikkligheten, med veldig klart valg for potensielle beslektede kinaser. Gitt sentralitet fosforylering til biologisk signalering, er skjermen nyttig for funn i nesten alle cellesignalveier 14-16. Skjermen innebærer å utføre en storskala kinaseanalyse med et bibliotek av menneskelige proteinkinaser. De kinaser er merket med bakteriell glutation S-transferase (GST) protein og renses fra pattedyrcelleekstrakter, noe som betyr at de rekombinante enzymene - i motsetning til de som fremstilles fra bakterier - genereres i nærvær av oppstrøms proteinkinaser ofte kreves for rekombinante enzymer for å ha aktivitet in vitro. Faktisk, mens serin, treonin og tyrosin-kinase-aktivitet som er nødvendig for nedstrøms-kinase-aktivering er til stede i gjær 10, koder for gjærgenomet 122 proteinkinaser, noe som indikerer at pattedyr kinome, med over 500 gener 17, er blitt vesentlig mer komplisert for å kunne regulate prosessene som er unike for høyere ordens organismer. Dessuten kan virkningen av forskjellige stimuli som er relevante for cellebiologi og human sykdom (for eksempel små molekyler, vekstfaktorer, hormoner, etc.) bli brukt til 14,15 modulen kinase-aktivitet i en passende sammenheng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser, plater, og celler
- Gjør 500 ml lyseringsbuffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% TritonX-100, 5 mM beta-glycerofosfat, 5% glycerol. Oppbevar ved 4 ° C. Umiddelbart før bruk, tilsett 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 1 mM natrium-vanadat. Etter dette trinnet blir PMSF ikke nødvendig i noen skyllebuffer.
- Gjøre 20 ml 10 x kinase-buffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfat (FW 216), 2 mM natriumvanadat. Delmengde i 1 ml rør og oppbevares ved -20 ° C. Umiddelbart før bruk, tilsett 5 mM DTT.
- Gjør 20 ml 10x M-ATP buffer: 300 mikrometer adenosintrifosfat (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mm MnCl 2. Aliquot i 1 ml rør og oppbevares ved -20 ° C.
- Gjør 100 ml 2x natriumdodecylsulfat (SDS) lysebuffer: 1,5 g Tris-base, 20 ml glycerol, 30 ml H 2 O. Oppløs og juster pH til 6,8 med HCl. Legg 40ml 10% SDS, justere volumet til 100 ml. Legg 25 mg bromfenolblått.
- Spot 4 pl 25 ng / mL pattedyr ekspresjonsplasmidet koder en GST-kinase 14 per brønn i sett på 96-brønners plater og label plater tilsvarende. Seal og fryse plater ved -20 ° C inntil bruk.
- 1-2 dager før transfeksjon, kultur HEK293T celler i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika i en 37 ° C inkubator supplert med CO 2 (slutt 5%). Passage med trypsin og ikke la aksjen til å bli> 80% sammenflytende under ekspansjon. Et minimum på 6 x 10 7 celler er nødvendig for skjermen (ca. 3 x 15 cm skåler av HEK293T celler ved 80% konfluens).
2. Transfeksjon
NB: Se figur 1 for et flytskjema over hele protokollen.
- Hvis platene inneholder kinase plasmider har vært frosset, tine i romtemperatur ennd sentrifuger ved 1900 xg i 3 minutter for å samle opp eventuell fuktighet på bunnen av brønnene.
- Bland 8,6 ml redusert serum medium (f.eks OPTI-MEM) med 312.7 mL av lipid-baserte transfeksjon reagens. La sitte i 5 min.
- Tilsett 10 mL av redusert serummedium til hver brønn ved anvendelse av en automatisert væskedispenser utstyrt med et lite volum kassett.
- Tilsett 10 ul pr brønn av redusert serummedium / transfeksjon reagens blanding fra trinn 2.2 ved å bruke en automatisert væskedispenser utstyrt med et lite volum kassett. La sitte i 20 til 45 min.
- Resuspender 293T-celler ved 7,5 x 10 5 celler / ml i 80 ml komplett DMEM. Tilsett 100 ul cellesuspensjon (dvs. 7,5 x 10 4 celler) pr brønn ved bruk av en automatisert væskedispenser utstyrt med et standard volum kassett.
- Kontroller brønner i henhold mikroskop for ensartet cellefordeling og gå tilbake til inkubatoren i 24 timer.
3. GST-kinase Nedtrekk
- Gjør fresh: 4 mm pervanadate løsning ved å blande 60 mL 0,2 M natriumvanadat med 540 mL av H 2 O. I et andre rør blanding 2,7 ul av 30% peroksyd og 1,4 ml PBS. Legg de to løsningene sammen og la sitte i 15 minutter før bruk.
- Ved hjelp av en multikanalspipette (ikke bruk en automatisert væske dispenser som det skaper altfor mye turbulens i brønnen) dispensere 2 mL av 0,25 M CaCl 2 i hver brønn, etterfulgt av 2,5 mL av pervanadate utarbeidet i trinn 3.1. Inkuber hver plate ved 37 ° C i 10 min og deretter plassere på is.
- Forbered 35 ml lysisbuffer ved å legge DTT, PMSF, og natriumvanadat som angitt i § 1 (fremstilling av reagenser).
- Å holde platene på is, fjernes mediet fra hver brønn ved anvendelse av en aspirator vakuum. Umiddelbart tilsett 50 ul / brønn av iskald lyseringsbuffer ved anvendelse av en automatisert væskedispenser utstyrt med en standard kassett. La sitte 30 min på is til Lyse (valgfritt: kan stoppe her om nødvendig ved å forsegle plate og lagring ved -80 ° C. For å fortsette, tine platene på is).
- Spin plater på 1900 xg for 3 min ved 4 ° C.
- Skrape celler fra hver brønn med multikanalspipette og overføre alt innholdet til riktig merket V-bunn 96 brønners plater. Spin plater på 1900 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Sentrifugering, fylle glutation belagte plater (en for hver 96-brønns plate) med 100 ul / brønn av iskald lyseringsbuffer (uten PMSF) som en skylling. Hold platene på is.
- Fjern V-bunnplatene fra sentrifugen. En om gangen, invertere glutation plater over en vask å riste ut lysisbuffer og blot på et papirhåndkle. Overfør lysis buffer fra de V-bunnplater til glutation platene ved å vippe platen og ved hjelp av en multikanal pipette, være nøye med å ikke forstyrre pellet på bunnen. Dekk plater og la på is i minst 2 timer å binde.
- Nær slutten av 2 timer bindende trinn, utarbeide en radioaktivitet arbeidsstasjon, noe som sikrer tHan nødvendige sikkerhetstiltak er på plass for radioaktivt arbeid. Still hybridisering ovnen til 30 ° C.
- Forbered 200 ml lyseringsbuffer ved tilsetning av DTT og natriumvanadat som vist i avsnitt 1. PMSF er ikke nødvendig på dette stadium.
- Invertere glutation plater over en vask å riste ut lysisbuffer og blot på et papirhåndkle. Rens brønnene 3 ganger med 100 ul lysebuffer (uten PMSF). Ikke la brønner sitte tørt - holde dem i skylling inntil klar til å fortsette.
- Forbered 55 ml 1x kinasebuffer (KB) ved å fortynne 10x lager og legge DTT som angitt i § 1. Skyll platene en gang med 50 ul 1x KB hjelp av en automatisert flytende dispenseren utstyrt med en standard volum kassett. La 1x KB i brønner til løsning A er klar:
- Fremstille Oppløsning A ved tilsetning av 500 til 530 ug av substratet av interesse, 500 ug av myelin basisk protein (MBP), 2,65 ml 10 x KB, 13,25 ul av 1 M DTT, og H 2 O opp til 15,9 ml.
- Fremstille Oppløsning B i den radioaktivitet arbeidsområdet ved å tilsette 2,5 ml 10 x M-ATP, 500 uCi gamma-32P ATP, og H2O til 10 ml.
- Tilsett 20 mL av Oppløsning B per brønn ved hjelp av en repeater pipette som hjelpemidler ved blanding på grunn av ejeksjonskraften. Dekk til og inkuber i 30 ° C hybridisering ovn i 30 min.
- Etter 30 min overføre platene tilbake til is. Tilsett 50 ul av 2 x SDS lyseringsbuffer til hver brønn med en multikanal pipette. Kan foregå ved dette punkt til det neste trinnet, eller forsegle platene med folie og lagre aluminium ved -20 ° C inntil praktisk.
4. Løping, Farging og tørking Gels
Merk: Alt arbeid skal utføres i et område designated for radioaktivitet.
- Slå på hybridisering ovnen og satt til 85 ° C. Tine plater ved romtemperatur. Når ovnen har nådd temperatur, overføre plater til ovn og inkuberes i 10 minutter for å denaturere prøver.
- Load 26-brønners pre-cast gels med 15 mL av hver reaksjon ved hjelp av en flerkanals pipette til å fylle flere brønner samtidig. Hensyn må tas for at alle tips på linje med tilsvarende godt før du legger prøvene. Kjør gel ved 150 V. Ikke la sporing fargestoff (blå linje) går ut av bunnen av gelen som dette inneholder unincorporated ATP.
- Demontere gels og avskåret unincorporated ATP (blå linje) med en skalpell eller rett kant som det vil overeksponere filmene. Plasser gels i merkede beholdere og dekk med Coomassie flekk i 15 min.
- Fjern Coomassie flekken, kort skyll geler med vann, og tilsett destain løsning. Destain gelene inntil proteinene er klart synlig. Et band for MBP og et band for underlaget børvære synlig for hver prøve.
- Å tørke gels:
- Skjær et stort ark filterpapir og plassere den på tørketrommelen.
- Fukt en cellofan ark i destillert vann til den er glatt og rynkefri, og plassere den på toppen av arket.
- Legg de gels på toppen av cellofan ark, lage et notat av rekkefølgen av geler. Fukt en andre cellofan ark og legg på toppen av gels.
- Rull ut alle bobler (en plate forseglingsrullen fungerer bra for dette) for en fin jevn overflate. Lukk klaffen, slå på vakuum, og tørk gels i 3 timer ved 80 ° C.
- Når gels er tørre, utsette dem for XAR film ved hjelp av en skjerm for å intensivere signal. Pakk inn kassetten med saran wrap eller en plastpose og forsegle med tape for å holde ut frost. Oppbevar kassetten ved -80 ° C over natten.
5. Utvikle XAR Films
- Dagen etter, fjerne kassett fra fryseren og la tine i romtemperatur. Utvikle filmen iet mørkerom ved hjelp av en film prosessor i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Undersøk filmer for bevis av kinase-substrat par. Et sekund lenger eksponering kan også være nyttig for å oppdage svakere fosforyleringsseter hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater fra en skjerm er vist i figur 2. 180 kinaser ble screenet ved anvendelse av en GST-merket peptid substrat svarende til aa 268-283 fra CRTC2 så vel som den klassiske kinaseanalyse substrat myelin basisk protein (MBP). Bare to kinaser, Mark2 og svært knyttet kinase MARK3 fosforylert den CRTC2 peptid. MBP er inkludert som en intern kontroll i alle analyser, da den inneholder mange phosphorylatable rester og kjører på 18 kDa, mot bunnen av gelen. Dette gjør det mulig for en tolkning av spesifisitet: noen kinase vil fosforylere en robust substrat og MBP. Til opplysning her er at brønnene inneholdende GST alene (dvs. uten kinase kontroller) alltid rense noe endogen kinase-aktivitet, og dermed er det alltid bakgrunn fosforylering i analysen. Selv om dette ikke utelukke at fosforylering av substratet er ekte, vil det tyde på at i in vitro å sette kinase kan være mindre selektiv.Det er spesielt informativt å inkludere flere substrater av ulik MW til å trekke konklusjoner om kinase-substrat spesifisitet.
Figur 1. Flytskjema som viser viktige skritt i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på skjerm utfall. Autoradiografer av en skjerm av en versjon av biblioteket (180 humane proteinkinaser) utføres ved hjelp av GST-peptidsubstrat svarende til aa 268-283 av mus CRTC2 (reprodusert fra Jansson et al., 2008). MBP er myelin basisk protein indikert. Den høye graden av substrate utvalg av nærstående kinaser er en funksjon av skjermen. Hver kolonne representerer reaksjonsproduktene fra et distinkt kinase assay. MARK3 (Gel 1) og Mark2 (Gel 16), den eneste kinaser phosphorylate TORC2 268-283 peptid, indikeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden de opprinnelige publikasjonene beskriver tilnærmingen 14,15, har den opprinnelige bibliotek av 180 GST-kinaser er utvidet til 420 medlemmer, eller ~ 80% av det humane proteinet kinome. Med det utvidede biblioteket, protokollen som beskrevet tar 4-5 dager og deretter 1-4 dager for å utvikle film (som anses nødvendig), som kan bli forkortet ved anvendelse av phosphorimaging og digital signalforbedring. Det er flere viktige skritt der omsorg må tas (Se figur 1 for oversikt over protokollen). For det første er helsen til lager av celler (mycoplasma fri, aldri tillates å nå konfluens under ekspansjon, og behandlet med trypsin ved hver passasje) under satsvis ekspansjonstrinn, og i 96-brønners plater på tidspunktet for transfeksjon. Cellene bør være ensartet podet, og 80% konfluent ved transfeksjon finner sted (trinn 1.5).
For det andre er det ideelt under transfeksjon å bruke et automatisk flytende dispenser for å redusere volumet TRANSFeh feil, og dermed begrense koeffisient variasjoner ("cvs") mellom brønnene. For små volumer, passer dispenseren med et mindre volum kassett grenser reagent tap på grunn av reduserte dødvolumer og øker dispenserer nøyaktighet. Behandlingstrinnet med natrium pervanadate, en panne tyrosin fosfatase-inhibitor, er brukt som en generell stimulans for å øke fosforylering status av mål-kinaser. Inkludering av kalsium på dette trinnet øker celle-matrix adhesjon, hindrer celle tap på grunn av avrunding utløst av langvarig pervanadate behandling. Dette trinnet bør gjøres med streng overholdelse av den 10 minutters inkubasjonstid.
Tredje, for kinaseanalyse seg selv, er det flere hensyn ved valg av rekombinante underlaget: peptider, protein domener, eller intakte proteiner så store som 120 kDa kan alle brukes. Hvis en bestemt fosforyleringssete er kjent, er et peptid-substrat mest mulig rett frem måte, men må være stor nok til å detekterepå en SDS-PAGE gel. Således kan peptidsubstrater være kondensert til GST og renset fra bakterier til å gi en molekylvekt på> 25. Større proteiner har den fordel at de er foldet og sannsynligvis deres phosphorylatable rester eksponert som de ville være i cellen, men har den ulempe at de vil omfatte ytterligere rester som kan være fosforylert og gi signal i analysen. Vi foretrekker å drive en skjerm ved hjelp av et peptid-substrat bestående av 15-20 aminosyrer som omgir en rest som er kjent for å være fosforylert in vivo og er kjent for å regulere en biologisk hendelse, da dette gjør kontroll av kandidat kinaser fra skjermen begge in vitro og in vivo mye raskere.
Sist, ideelt mengden protein tilnærminger eller overstiger 1 mikrogram per brønn; dette selvfølgelig varierer med MW av substratet. Mindre protein per brønn kan gi meningsfulle treff, men "mer er bedre" regelen gjelder som det øker signal: noiSE. Standard, er ikke-gradient gels anbefalt som gradient gels knekke for ofte under tørking. Etter tørking ble gelene, deteksjon av et radioaktivt signal over bakgrunnen med en Geiger-teller gir en utmerket indikasjon på suksessen av analysen.
Da skjermen er in vitro og ytterligere nivåer av kompleksitet eksisterer in vivo, må en kandidat kinase (er) for et gitt substrat bli validert i celler. Nærmere bestemt, kan skjermen identifisere et familiemedlem som har den biokjemiske kapasitet til å fosforylere substratet in vitro, men er ikke uttrykt i samme celletype eller i samme subcellulære rom som substratet. For eksempel, mens Mark2 og MARK3 var begge hits i en skjerm for kinase som kunne phosphorylate CRTC2 på Ser275, bare Mark2 dannet et kompleks med underlaget i celler 14. Det følgende er en serie av ytterligere eksperimenter som kan brukes for å bekrefte den fysiologiske relevansen av en kandidat kinase. First, kan mobilitets skift av substratet på SDS-PAGE etter koekspresjon av kandidaten kinase brukes som en bekreftelse kontroll. Egnede kontroller slik kotransfeksjon av en katalytisk inaktiv kinase kan bekrefte spesifisiteten. For det andre, kan substratet immunpresipitert fra celleekstrakter som har blitt inkubert med 32p-ortofosfat for å bekrefte inkorporering av fosfat inn i substratet i nærvær av villtype og ikke en katalytisk inaktiv kinase. For det tredje kan en phosphospecific antistoff genereres mot phosphoacceptor sekvens (hvis kjent) og brukes til å bekrefte en økning i substratfosforylering når kinase er overuttrykkes. En sekundær skjermen ved hjelp av en mutant substrat som bærer et ikke-phosphorylatable rest ved målsetet kan bekrefte spesifisiteten forut for genereringen av et phosphoantibody, en særlig viktig kontroll med større domene og full-lengde protein substrater. Farmakologisk hemming tilnærminger til å hemme en candidato kinase kan også brukes, men forsiktighet må utvises som inhibering av relaterte kinaser er en underappreciated realitet. Sist, RNAi-mediert stanse av kandidaten kinase (e) i cellene fulgt og western blotting for å overvåke tap av målstedet fosforylering med en phosphospecific antistoff kan utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSERC stipend 386634. Vi ønsker å takke medlemmene av Screaton Lab for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
