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Developmental Biology

बाल-व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाएं का प्रयोग एकता मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: August 20, 2015 doi: 10.3791/53174
Automatic Translation
1, 1, 1
1Centre for Eye Research Australia & Department of Ophthalmology, University of Melbourne

Introduction

मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSCs) की खोज के रोगी-विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं को 1-3 की पीढ़ी के लिए एक व्यावहारिक विधि उपलब्ध कराने, पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। hiPSCs सफलतापूर्वक fibroblasts के 4,5, hematopoietic कोशिकाओं 6,7, मूत्र 8 से गुर्दे की उपकला कोशिकाओं और 9,10 केरेटिनकोशिकाओं सहित विभिन्न दैहिक प्रकार की कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया है। तिथि करने के लिए, त्वचा fibroblasts और hematopoietic कोशिकाओं रोगी-विशिष्ट IPSCs पैदा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल सेल के सूत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बेशक, यह त्वचा बायोप्सी और रक्त संग्रह नियमित चिकित्सा प्रक्रियाओं और कई देशों में स्थापित किया गया है रोगी के रक्त या त्वचा के नमूनों की बड़ी biobanks कर रहे हैं कि इस तथ्य के कारण है।

रक्त कोशिकाओं और आक्रामक निकासी तरीकों की आवश्यकता होती है जो त्वचा तंतुप्रसू के विपरीत, केरेटिनकोशिकाओं hiPSC पीढ़ी के लिए एक आसानी से सुलभ सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। Keratinocytतों त्वचा की बाहरी एपिडर्मल बाधा के रूप में और भी नाखून और बालों 11 में पाए जाते हैं कि केरातिन युक्त उपकला कोशिकाओं रहे हैं। विशेष रूप से, केरेटिनकोशिकाओं बालों के रोम, भीतर जड़ म्यान (आईआरएस) कोशिकाओं (12, चित्रा 1) के साथ मिलकर बाल शाफ्ट कवर किया है कि एक बाहरी सेलुलर परत के बाहरी जड़ म्यान (ओआरएस) पर पाया जा सकता है। बाल संग्रह चिकित्सा कर्मियों की सहायता की आवश्यकता नहीं है कि एक साधारण प्रक्रिया है के रूप में रोगियों को इकट्ठा करने और बहुत hiPSC पीढ़ी के लिए रोगी के नमूने के संग्रह की सुविधा होगी जो प्रयोगशालाओं, के लिए अपने स्वयं के बाल के नमूने भेजने के लिए, यह एक अवसर प्रदान करता है। एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं भी hiPSC पीढ़ी 9,13 के लिए शुरू की कोशिकाओं के रूप में केरेटिनकोशिकाओं उपयोग कर के लाभ के लिए, उनका कहना है fibroblasts की तुलना में एक उच्च reprogramming दक्षता और तेजी से reprogramming के कैनेटीक्स है। इसके अलावा, hiPSCs भी बाल कूप के भीतर अन्य सेल आबादी का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है,बाल कूप 14,15 के आधार पर स्थित त्वचीय papilla कोशिकाओं सहित।

बाल-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग IPSC पीढ़ी की पिछली रिपोर्टों अक्सर रेट्रोवायरल या lentiviral आधारित reprogramming के तरीकों को 9,14,15 का उपयोग। हालांकि, इन वायरल तरीकों reprogramming के दौरान विदेशी transgenes की अवांछनीय जीनोमिक एकीकरण परिचय। इसकी तुलना में, episomal वैक्टर का उपयोग एकीकरण मुक्त IPSCs 4 उत्पन्न करने के लिए एक व्यावहारिक, गैर वायरल reprogramming विधि का प्रतिनिधित्व करता है। हम पहले से कुशलतापूर्वक episomal वैक्टर 13 का उपयोग कर hiPSCs में keratinocyte reprogram करने के लिए एक सरल, लागत प्रभावी और गैर-वायरल तरीका विकसित किया है। यहाँ हम साहसपूर्ण बाल, विस्तार और केरेटिनकोशिकाओं के रखरखाव और hiPSCs उत्पन्न करने के लिए बाद में reprogramming से केरेटिनकोशिकाओं की व्युत्पत्ति सहित keratinocyte व्युत्पन्न hiPSCs, की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

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Protocol

व्यक्तियों से मानव बाल के नमूने का संग्रह मेजबान संस्थानों में मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता है और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया जाना चाहिए।

साहसपूर्ण बालों से keratinocytes के 1. अलगाव

  1. बर्फ हे / एन पर (यानी, Matrigel) पिघलना बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) समाधान।
  2. पूर्व ठंडा पिपेट सुझावों का प्रयोग, ठंडा DMEM / F12 माध्यम के 12 एमएल के लिए 200 μl ईसीएम समाधान जोड़ें। कोट अच्छी तरह से प्रत्येक में पतला ईसीएम समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित थाली हे / एन सेते हैं। उपयोग करने से पहले पूर्व गर्म DMEM / F12 मध्यम के साथ लेपित प्लेट धो लें।
  3. बालों की जड़ के पास की उंगलियों रखने और एक त्वरित और निर्बाध गति में बाल तोड़ करने से व्यक्ति के सिर से प्राथमिक मानव बाल लीजिए। प्रत्येक एकत्र बाल एक अक्षुण्ण बाल कूप में शामिल है कि इस बात की पुष्टि और बालों के लिए संयुक्त राष्ट्र के विकास के चरण निर्धारित करने के लिए जाँच करेंएक विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) der।
    1. केरेटिनकोशिकाओं निकालने के लिए प्रत्येक व्यक्ति से 5-10 ऐनाजेन बाल लीजिए। प्रक्रिया केरेटिनकोशिकाओं के सफल व्युत्पत्ति सुनिश्चित करने के लिए जितनी जल्दी हो सके बाल साहसपूर्ण।
      नोट: चित्रा 1 विकास चक्र के विभिन्न चरणों में बाल की आकृति विज्ञान दिखाता है। ऐनाजेन बाल ओआरएस के रूप में जाना जाता है बालों की लंबाई, आसपास के उपकला के एक दृश्य बाहरी परत के साथ, विकास के चरण में है। दूसरी ओर, टेलोजन बाल आराम चरण में बालों का प्रतिनिधित्व करता है और एक दृश्य ओआरएस नहीं है, लेकिन टेलोजन उभार के रूप में जाना जाता है बालों की जड़ को कवर कोशिकाओं का एक स्पष्ट गेंद है।
  4. आरटी पर 5 मिनट के लिए धोने के लिए एंटीबायोटिक मिक्स के 10 मिलीग्राम से युक्त एक पेट्री डिश में बालों के नमूने रखें।
  5. बाल शाफ्ट के 1 सेमी - निष्फल कैंची और संदंश का प्रयोग, एक अक्षुण्ण बाल कूप और आसपास 0.5 के साथ एक बाल टुकड़ा छोड़ रहा है, अत्यधिक बाल शाफ्ट काट दिया।
  6. ध्यान से टीआरएसंदंश का उपयोग ईसीएम में लिपटे थाली के प्रत्येक कुएं में nsfer 1 बाल टुकड़ा।
  7. बालों के नमूने के लिए - (200 μl ~ 100) 1 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर) के माध्यम के लगभग 3 बूँदें जोड़ें।
    नोट: लगाव और बाद keratinocyte परिणाम के लिए अनुमति देने के लिए थाली की सतह के लिए निकट संपर्क में बाल टुकड़े रखें। इस कदम पर जरूरत से ज्यादा मीडिया को जोड़ने से हो सकता है बाल टुकड़े फ्लोट करने के लिए कारण बनता है और सफल बाल लगाव का मौका कम हो जाती है।
  8. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बालों के नमूने सेते हैं और बालों के रोम / एन ओ संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं। नम बालों के नमूने रखने के लिए - (200 μl ~ 100) अगले दिन पर, धीरे एस आर माध्यम की एक और 3 बूँदें जोड़ें।
  9. बालों के रोम सफलतापूर्वक संलग्न है कि पुष्टि करने के लिए दैनिक बालों के नमूनों का निरीक्षण करें। आम तौर पर बालों के रोम के लगाव 1-3 दिनों के भीतर स्पष्ट है। ठीक बाल अधिक है के रूप में मोटी बाल, ठीक बाल की तुलना में संलग्न करने के लिए आमतौर पर आसान कर रहे हैंप्रवृत्ति कुर्की की प्रक्रिया में बाधा जो तैरने लगते हैं।
    1. बाल लेपित थाली से जुड़ी है एक बार, अच्छी तरह से करने के लिए एस आर माध्यम के 500 μl जोड़ें। बालों के नमूने मजबूती से जुड़ा नहीं हो सकता है के रूप में मध्यम जोड़ते समय अतिरिक्त ध्यान रखना। इस बिंदु से, हर 2 दिनों मीडिया बदल जाते हैं।
      नोट: केरेटिनकोशिकाएं outgrowths 3-7 दिनों (2A चित्रा-बी) के बाद बाल टुकड़ा की ओआरएस क्षेत्र से दिखाई जानी चाहिए। केरेटिनकोशिकाओं अगले भाग में वर्णित के रूप में कोशिकाओं passaging से पहले 14 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।

2. रखरखाव और keratinocytes के Passaging

  1. प्री-कोट कोटिंग मैट्रिक्स किट का उपयोग कर 6 अच्छी तरह से थाली। कोटिंग मैट्रिक्स समाधान के 6.8 μl द्वारा पीछा अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए किट, से कमजोर पड़ने के माध्यम के 680 μl जोड़ें। थाली पर कोटिंग मैट्रिक्स समाधान के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए थाली हिला।
  2. लेपित थाली आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते दें। निकालेंकेरेटिनकोशिकाओं की चढ़ाना करने से पहले कोटिंग मैट्रिक्स समाधान।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.25% trypsin के 500 μl के साथ एक एकल कक्ष निलंबन में केरेटिनकोशिकाओं अलग कर देना। मध्यम युक्त सीरम (जैसे, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के माध्यम) के 500 μl के साथ trypsin निष्क्रिय और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा। निष्फल संदंश का उपयोग बाल टुकड़ा निकालें।
  4. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कर काटा कोशिकाओं की संख्या निर्धारित है।
  5. जी एक्स 200 में 3 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। पीबीएस और दोहराने centrifugation के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस Aspirate और ताजा केरेटिनकोशिकाएं मध्यम में सेल गोली resuspend।
  6. केरेटिनकोशिकाएं माध्यम की उपस्थिति में ईसीएम में लिपटे थाली के एक कुएं में प्लेट नीचे 4 × 10 4 केरेटिनकोशिकाओं। 5% सीओ 2 (चित्रा -2) के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में केरेटिनकोशिकाओं रखें। संस्कृति है जब ~ मीडिया में 80% मिला हुआ हर दिन और बीतने कोशिकाओं को बदलें, whiचर्चा केरेटिनकोशिकाओं के पारित होने संख्या और प्रसार दर के आधार पर लगभग 2-7 दिन लग सकते हैं। व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाओं मानक धीमी गति से ठंड cryopreservation विधियों 16 का उपयोग पर्याप्त जमी शेयरों उत्पन्न करने के लिए विस्तार किया जाना चाहिए।
    नोट: वर्णित संस्कृति की स्थिति ठेठ cobblestone आकारिकी (चित्रा -2) के साथ केरेटिनकोशिकाओं के समरूप जनसंख्या के विस्तार का समर्थन है। कभी-कभी, कुछ विभेदित बड़े और फ्लैट आकृति विज्ञान के साथ केरेटिनकोशिकाओं, और replicative संभावित खो दिया है, संस्कृति में मनाया जा सकता है। केरेटिनकोशिकाओं की विशेषता cytokeratin 14 के खिलाफ का उपयोग कर एंटीबॉडी immunostaining द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में पहले 17 में वर्णित है। स्थापित keratinocyte सेल लाइनों भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर 1-3 मार्ग के बाद माइकोप्लाज्मा के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।

Episomal वैक्टर का उपयोग केरेटिनकोशिकाएं से hiPSCs 3. पीढ़ी

  1. 6 अच्छी तरह से थाली के साथ प्री-कोट0.1% जिलेटिन (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से)। आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए कोट करने के लिए जिलेटिन की अनुमति दें।
  2. Reprogramming के प्रयोग के लिए, उपयोग केरेटिनकोशिकाओं नहीं बाद में पारित होने के 6 से अलग कर देना 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ एक एकल कक्ष निलंबन में केरेटिनकोशिकाओं। मीडिया युक्त सीरम (जैसे, FBS के मीडिया) के 1 मिलीलीटर के साथ trypsin निष्क्रिय और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा।
  3. केरेटिनकोशिकाएं माध्यम में 200 XG और resuspend कोशिकाओं पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। एक gelatinized थाली हे / एन में अच्छी तरह से प्रति प्लेट 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 केरेटिनकोशिकाओं।
  4. अगले दिन (0 दिन) पर, कोशिकाओं 50-60% मिला हुआ हैं सुनिश्चित करने के लिए थाली की जाँच करें।
    नोट: केरेटिनकोशिकाओं ~ 50% मिला हुआ है कि वे अच्छी तरह से अभिकर्मक के बाद विकसित नहीं हो सकता है की तुलना में कम कर रहे हैं।
  5. 0 दिवस पर, 2 माइक्रोग्राम कुल प्लास्मिड डीएनए के लिए 8 μl अभिकर्मक अभिकर्मक के अनुपात का उपयोग कर, केरेटिनकोशिकाओं पर episomal reprogramming के वैक्टर के अभिकर्मक प्रदर्शन करते हैं।
    1. 4 प्लास्मिड (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-एचयूएल) में से प्रत्येक के लिए 0.5 माइक्रोग्राम ले लो और कम सीरम मध्यम (जैसे, Opti- सदस्य) के 100 μl में पतला।
      नोट: प्लाज्मिड pCXLE-EGFP केरेटिनकोशिकाओं में अभिकर्मक क्षमता की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है और सफल reprogramming के लिए आवश्यक नहीं है।
    2. पतला डीएनए के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 μl जोड़ें। ट्यूब flicking द्वारा मिलाएं। डीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण 15 मिनट के लिए आरटी पर अबाधित आराम करने के लिए अनुमति दें।
    3. ताजा माध्यम के साथ केरेटिनकोशिकाएं मध्यम बदलें।
    4. धीरे 4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में keratinocyte संस्कृति के लिए डीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण को जोड़ने और सेते हैं।
      नोट: यह है कि वे कम अस्तित्व के बाद अभिकर्मक प्रदर्शन के रूप में केरेटिनकोशिकाओं में लंबे समय तक अभिकर्मक हे / एन प्रदर्शन करने की सिफारिश नहीं है।
    5. 4 घंटे बाद अभिकर्मक के बाद, ताजा माध्यम के साथ केरेटिनकोशिकाएं मध्यम बदलें।
  6. 1 दिन पर (1 दिन के बाद ट्रांसfection), keratinocyte मध्यम बदलने के लिए और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे EGFP सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करके अभिकर्मक दक्षता की जाँच करें। आमतौर पर> 60-70% अभिकर्मक दक्षता इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्राथमिक केरेटिनकोशिकाओं के लिए मनाया जाता है।
  7. 3.5 चरण में वर्णित के रूप में 2 दिन, अभिकर्मक दोहराएँ। लगातार दो transfections के लिए आम तौर पर> 90% अभिकर्मक दक्षता हासिल करेंगे। केरेटिनकोशिकाएं संस्कृति आमतौर पर दूसरे अभिकर्मक के अंत तक संगम तक पहुँचता है।
    1. प्रत्येक reprogramming प्रतिक्रिया के लिए माउस भ्रूण fibroblast (MEF) फीडर के 10 सेमी पकवान तैयार करें। पहले से 18 के रूप में वर्णित mitotically निष्क्रिय MEF भक्षण तैयार करें।
    2. प्री-कोट में कम से कम 20 मिनट के लिए 0.1% जिलेटिन की 5 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी पकवान। FBS के माध्यम में 10 सेमी पकवान प्रति प्लेट 4 × 10 6 mitotically निष्क्रिय MEF। कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन संलग्न करने की अनुमति दें।
  8. 3 दिन, हरियाणाकदम 3.2 और 3.3 में वर्णित के रूप में 0.25% trypsin के साथ केरेटिनकोशिकाओं विहित हैं। एस आर माध्यम में केरेटिनकोशिकाओं Resuspend और एस आर माध्यम के साथ एक 10 सेमी MEF फीडर डिश में 6 अच्छी तरह से थाली में से 1 अच्छी तरह से केरेटिनकोशिकाओं के 90% थाली।
  9. बाद 4 दिन से, हर दिन एस आर मध्यम बदल जाते हैं।
    1. वैकल्पिक रूप से 18 दिन के बाद, हर दूसरे दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें।
      नोट: मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) जैसे लगते हैं कि परिभाषित सीमा के साथ hiPSC कालोनियों दिन 14 से उभरने होगा, जबकि गैर-reprogrammed केरेटिनकोशिकाओं, पैदा करना होगा संघर्ष - 21।
  10. बाद दिवस 21 से मार्गदर्शन विच्छेदन द्वारा hiPSC कालोनियों पृथक। निकट एक साथ संकुल और केवल स्पष्ट रूप से दूसरों से अलग हो रहे हैं कि hiPSC कालोनियों ले रहे हैं कि hiPSC कालोनियों से बचें।
    नोट: hiPSC कालोनियों पहले उठाया जा सकता है, लेकिन परिभाषित सीमाओं के साथ कॉलोनी छोटे कॉलोनी आकार दिया कि पहले समय बिंदुओं पर स्पष्ट नहीं हो सकता है। Reprogramming क्षमता अन्तर के बीच भिन्न हो सकते हैंerent मरीज की केरेटिनकोशिकाओं, और भी इस तरह के बीतने संख्या या केरेटिनकोशिकाओं के प्रसार दर के रूप में अन्य कारकों से प्रभावित होता है।
    1. HiPSC कालोनियों के मार्गदर्शन विच्छेदन के लिए, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत hiPSC कालोनियों में कटौती करने के लिए एक 26G सुई का उपयोग करें। लंबाई में 600 माइक्रोन - 300 के आसपास छोटे टुकड़ों में एक hiPSC कॉलोनी कट। HiPSCs का एक प्रतिरूप लाइन स्थापित करने के लिए एक नया MEF फीडर थाली (2.5 × 10 4 MEF / 2 सेमी) में एक hiPSC कॉलोनी से टुकड़े स्थानांतरण। प्रारंभ में, संस्कृति में एक 12 अच्छी तरह से थाली या अंग संस्कृति बर्तन में से एक कुएं में प्रत्येक hiPSC प्रतिरूप लाइन, तो 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप करने के लिए विस्तार।
    2. MEF फीडरों पर एस आर माध्यम में hiPSCs की स्थापना की प्रतिरूप लाइनों को बनाए रखें। संस्कृति एक बार 70 तक पहुँचने - hiPSC कालोनियों के साथ 80 confluency% ~ व्यास में 1.5 मिमी, निर्माता के अनुदेश के अनुसार मानक एंजाइमी passaging के तरीकों (Accutase, Dispase या Collagenase चतुर्थ) का उपयोग बीतने hiPSCs।
  11. स्थापित hiPSC लाइन विशेषताएँएस pluripotency और इन विट्रो में और / या विवो 13,19 में तीन रोगाणु परतों की कोशिकाओं प्रतिनिधि में अंतर करने की क्षमता की पुष्टि के लिए। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर माइकोप्लाज्मा के लिए नियमित तौर पर स्थापित परीक्षण hiPSC लाइनों वे रोगज़नक़ मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। नियमित karyotyping या सरणी आधारित प्रतिलिपि संख्या भिन्नता (CNV) विश्लेषण से hiPSC लाइनों के जीनोमिक स्थिरता की निगरानी।

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Representative Results

ऐनाजेन (विकास चरण), केटाजन (प्रतिगमन चरण) और टेलोजन (बाकी चरण) 20,21: बाल 3 अलग विकास चक्र के चरणों के माध्यम से चला जाता है। ऐनाजेन बाल कूप उपकला की कई परतें हैं; इन परतों ओआरएस, आईआरएस और बाल शाफ्ट (चित्रा 1) शामिल हैं। ऐनाजेन बाल अंततः ओआरएस और बाल शाफ्ट भेदभाव की समाप्ति की एपोप्टोसिस द्वारा चिह्नित है जो केटाजन चरण, के लिए संक्रमण आए। अंत में, एपोप्टोसिस रहता है और टेलोजन कूप एक विशेषता टेलोजन साथ मौन हो जाता है, जहां टेलोजन चरण, को केटाजन बाल संक्रमण 20,21 उभाड़ना।

चित्रा 1 एक टेलोजन बाल और एक ऐनाजेन बालों की आकृति विज्ञान दिखाता है। आम तौर पर हम keratinocyte व्युत्पत्ति के लिए ऐनाजेन बाल का उपयोग। इस प्रोटोकॉल के बाद, keratinocyte outgrowths के रूप में जल्दी के रूप में 3 दिनों बाल लगाव (2A चित्रा) के बाद देखा जा सकता है और पी के लिए जारी रहेगाroliferate (चित्रा 2 बी)। हमारे अनुभव में, कुछ ऐनाजेन बाल देते हैं या keratinocyte परिणाम निरीक्षण करने के लिए विफल करने के लिए असफल हो सकता है; सफल keratinocyte अलगाव सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति से 10 ऐनाजेन बाल - इस प्रकार कम से कम 5 इकट्ठा। इसके बाद, केरेटिनकोशिकाओं एक नई प्लेट पर passaged और कई मार्ग (चित्रा -2) के लिए बनाए रखा जा सकता है। यह एस आर माध्यम के साथ Matrigel की तुलना में, धारा 2 में वर्णित के रूप में केरेटिनकोशिकाएं माध्यम के साथ एक कोटिंग मैट्रिक्स पर केरेटिनकोशिकाओं के बेहतर विकास के ध्यान दें कि वहाँ के लिए महत्वपूर्ण है।

विस्तार के बाद, केरेटिनकोशिकाओं reprogramming की 32 दिनों के बाद धारा 3 चित्रा 3 ए में एक ठेठ keratinocyte व्युत्पन्न hiPSC कॉलोनी से पता चलता है के रूप में वर्णित hiPSCs उत्पन्न करने के लिए reprogrammed किया जा सकता है। यह hiPSC कॉलोनी के केंद्र में कुछ भेदभाव निरीक्षण करने के लिए आम बात है। एक बार जब मैन्युअल रूप से उठाया, व्युत्पन्न hiPSCs आम तौर पर cytoplasmic अनुपात और समयबद्ध परिभाषित कॉलोनी के लिए उच्च नाभिक प्रदर्शितआरे (3B चित्रा)। ऐसे pluripotent मार्करों OCT4, NANOG और टीआरए-160 (चित्रा -3 सी-ई) की अभिव्यक्ति के रूप में, पहले से 13,19 के रूप में वर्णित hiPSCs की स्थापित सेल लाइनों तो pluripotency के लिए होती जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1. विभिन्न विकास चरणों में साहसपूर्ण बाल के प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) आरेख ऐनाजेन या टेलोजन चरण में बाल illustrating। (बी) टेलोजन चरण और (सी) ऐनाजेन चरण में एक साहसपूर्ण बाल दिखा चरण विपरीत छवियाँ। एच एस = बाल शाफ्ट; आईआरएस = इनर रूट म्यान; ओआरएस = आउटर रूट म्यान। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


एक साहसपूर्ण बाल चित्रा बाल-व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाओं 2. प्रतिनिधि छवियाँ। चरण विपरीत छवियों (ए) 3 दिन और (बी) के 10 दिनों के लिए नीचे चढ़ाया। व्हाइट तीर एक साहसपूर्ण बालों से keratinocyte का परिणाम निशान। Passaging के बाद एक ठेठ cobblestone आकारिकी के साथ दिन 3 keratinocyte संस्कृति (सी) चरण विपरीत छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा keratinocyte व्युत्पन्न hiPSCs 3. प्रतिनिधि छवियाँ। एक keratinocyte व्युत्पन्न hiPSC सह दिखा एक दिन में 32 reprogramming संस्कृति की (ए) चरण विपरीत छविlony। (बी) मैन्युअल hESCs के समान आकृति विज्ञान के साथ keratinocyte व्युत्पन्न hiPSCs का चयन किया। Pluripotent मार्कर (सी) NANOG और (डी) OCT4 और साथ hiPSCs के immunostaining (ई) keratinocyte व्युत्पन्न hiPSCs में टीआरए-160। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

रोगी-विशिष्ट hiPSCs की पीढ़ी के लिए इन विट्रो में रोगग्रस्त प्रकार की कोशिकाओं में रोगजनन के अध्ययन के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है, और यह भी रोग phenotypes के बचाव कर सकते हैं कि उपन्यास के अणुओं की पहचान करने के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करता है। HiPSCs के प्रयोग से इस रोग मॉडलिंग दृष्टिकोण लंबी क्यूटी सिंड्रोम, हंटिंग्टन रोग, पार्किंसंस रोग और Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस 22 सहित रोगों की एक किस्म के लिए आशाजनक परिणाम सामने आए है। कई पहल पहले से ही संयुक्त राज्य अमेरिका, यूरोप, ऑस्ट्रेलिया, चीन, दक्षिण कोरिया और जापान 23,24 में consortiums सहित रोगी-विशिष्ट hiPSCs, की बड़े पैमाने पर पुस्तकालयों की स्थापना के लिए चल रहे हैं।

यहाँ बाल-व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाओं से hiPSCs स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल को सुविधाजनक बनाने और रोग-विशिष्ट hiPSCs की बड़े पैमाने पर पुस्तकालयों की स्थापना के फास्ट ट्रैक करने की क्षमता है, जो वर्णन किया गया है। सबसे पहले, episomal: इस प्रोटोकॉल के दो लाभ प्रदान करता हैइस प्रोटोकॉल में उपयोग प्रणाली छह reprogramming के कारकों में से एक कॉकटेल का उपयोग एकीकरण मुक्त hiPSCs उत्पन्न करता है (OCT4, Sox2, KLF4, एल MYC, LIN28, p53 के लिए shRNA) अपेक्षाकृत उच्च क्षमता 4 पर। रेट्रोवायरल या lentiviral की मध्यस्थता reprogramming के तरीकों की तुलना में, episomal वेक्टर के उपयोग के reprogramming के दौरान विदेशी transgenes की अवांछनीय जीनोमिक एकीकरण से बचा जाता है।, इसलिए, कई पहलों जैसे बड़े पैमाने पर hiPSC पुस्तकालयों की स्थापना के लिए एकीकरण मुक्त reprogramming के तरीकों, के उपयोग के पक्ष episomal वैक्टर, एकीकृत reprogramming के तरीकों के 23 से अधिक सेंडाइ वायरस या mRNA,।

दूसरे, बालों को आसानी से पहुँचा जा सकता है और आक्रामक प्रक्रियाओं के उपयोग या मेडिकल स्टाफ की उपस्थिति के बिना रोगियों द्वारा खुद को काटा जा सकता है। इस keratinocyte व्युत्पत्ति और बाद में reprogramming के लिए प्रयोगशाला के लिए अपने स्वयं के बालों के नमूनों में एक अद्वितीय इकट्ठा करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों से मरीजों के लिए अवसर और मेल प्रदान करता है। इस रणनीति की व्यवहार्यता के समर्थन में, हमारे अप्रकाशित डेटा केरेटिनकोशिकाओं सफलतापूर्वक करने के लिए 10 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो गया था कि plucked बालों से अलग किया जा सकता है कि संकेत मिलता है।

यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली साहसपूर्ण बालों से keratinocyte की व्युत्पत्ति की अनुमति देगा। केरेटिनकोशिकाओं सिर्फ एक बाल से प्राप्त किया जा सकता है, हमारी सिफारिश keratinocyte व्युत्पत्ति के लिए कम से कम 5 ऐनाजेन बाल इकट्ठा करने के लिए है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा कुछ बाल अच्छी तरह से संलग्न नहीं हो सकता है और केरेटिनकोशिकाओं विकसित करने के लिए असफल हो सकता है। मोटा बाल बाल ठीक लगाव अस्थायी बचने के लिए और बढ़ाने के लिए चढ़ाना दौरान संस्कृति के माध्यम से कम राशि की आवश्यकता है, जबकि बेहतर संलग्न करने के लिए जाता है। केरेटिनकोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं एक बार, यह विस्तार और मानक धीमी गति से ठंड cryopreservation विधियों का उपयोग कर 16 शेयरों नीचे फ्रीज करने के लिए सलाह दी जाती है। केरेटिनकोशिकाओं के बाद के reprogramming के इस प्रोटोकॉल में वर्णित निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जा सकता है। के लिए महत्वपूर्ण हैकमी आई reprogramming दक्षता देर मार्ग में मनाया के साथ कोशिकाओं सेलुलर वार्धक्य 25-27 तक पहुँचने के रूप में शुरू की कोशिकाओं के प्रसार दर, reprogramming क्षमता को प्रभावित कर सकता है कि ध्यान दें। इस संबंध में कोई बाद में reprogramming के प्रयोगों के लिए पारित होने के 6 से केरेटिनकोशिकाओं का उपयोग करें। इसके अलावा, reprogramming क्षमता अलग-अलग व्यक्ति के केरेटिनकोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं।

हाल के अध्ययनों से ~ साथ, जीनोम 29 में दैहिक CNVs की जानकारी मिली त्वचा fibroblasts की 30% दैहिक ऊतकों 28 के कई प्रकार में बड़े पैमाने पर आनुवंशिक mosaicism सुझाव देते हैं। ये CNVs डीएनए प्रतिकृति, डीएनए की मरम्मत या transposon जुटाना में त्रुटियों की वजह से हो सकता है। यह त्वचा के लिए लंबे समय तक यूवी जोखिम fibroblasts और केरेटिनकोशिकाओं सहित एपिडर्मल कोशिकाओं में अतिरिक्त CNVs पैदा कर सकता है कि यह भी संभव है, लेकिन इस की हद तक अच्छी तरह से समझ नहीं है। केरेटिनकोशिकाओं में CNVs reprogramming प्रक्रिया के दौरान चली जाएँगी रूप में, यह आईएम हैअहम स्थापित hiPSCs जीनोमिक स्थिरता बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें कि दिनचर्या karyotyping या CNV विश्लेषण करने के लिए। सारांश में, यहाँ हम रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो बाल-व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाओं से hiPSCs की पीढ़ी के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic Mix: 
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B Sigma A2942-20ml Antibiotic mix is made up in PBS. 
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
PBS (-) Invitrogen 14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medium:  KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.
20% knockout serum replacement (KSR) Invitrogen 10828-028
DMEM/F12 with glutamax Invitrogen 10565-042
1× MEM non-essential amino acid Invitrogen 11140-050
 0.5× Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
 0.1 mM β-mercaptoethanol Invitrogen 21985
 bFGF (10 ng/ml, added fresh) Millipore GF003
Keratinocyte medium: 
 EpiLife with 60 µM Calcium Invitrogen M-EPI-500-CA
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) Invitrogen S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:  FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use.
10% fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 26140079
DMEM  Invitrogen 11995-073
0.5x Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
2 mM L-glutamine Invitrogen 25030
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Extracellular Matrix (ECM):
Matrigel Corning  354234 Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). 
Coating Matrix Kit  Invitrogen R-011-K
Plasmids:  Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.
-          pCXLE-eGFP Addgene 27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F Addgene 27077
-          pCXLE-hSK Addgene 27078
-          pCXLE-hUL Addgene 27080
Transfection reagent Fugene HD Promega E231B
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890 Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. 
Reduced Serum medium: OPTI-MEM Invitrogen 31985062
Accutase Sigma A6964-100ml
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.
26G needle Terumo NN2613R
6-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353046
12-well plate (tissue culture treated) BD Biosciences 353043
10 cm dish (tissue culture treated) BD Biosciences 353003
Dispase Invitrogen 17105-041 Use at 10 mg/ml
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Use at 1 mg/ml
TRA-160 antibody Millipore MAB4360 Use at 5 µg/ml
OCT4 antibody Santa Cruz SC-5279 Use at 5 µg/ml
NANOG antibody R&D Systems AF1997 Use at 10 µg/ml
MycoAlert Detection kit Lonza LT07-418

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 102 केरेटिनकोशिकाएं मानव प्रेरित स्टेम सेल बाल एकीकरण से मुक्त reprogramming पुनर्योजी चिकित्सा episomal वैक्टर
बाल-व्युत्पन्न केरेटिनकोशिकाएं का प्रयोग एकता मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
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Hung, S. S. C., Pébay, A.,… More

Hung, S. S. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes. J. Vis. Exp. (102), e53174, doi:10.3791/53174 (2015).

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