يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

38.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53179

⸱

ديسمبر 1, 2015

 , 
1Jouy-en-Josas Centre, INRA

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول المناعي غير المباشر الموضحة في هذه المقالة يسمح للكشف وتوطين البروتينات في الغدة الثديية الماوس. ويرد طريقة الكامل لتحضير عينات الغدة الثديية، لأداء المناعية، لصورة أقسام الأنسجة بواسطة المجهر مضان، وإعادة بناء الصور.

الملخص

يستخدم المناعي غير المباشر لكشف وتحديد البروتينات من الفائدة في الأنسجة. بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة كاملة وبسيطة للكشف المناعي للبروتينات، والفأر المرضعات الغدة الثديية التي يجري اتخاذها كمثال على ذلك. بروتوكول لإعداد عينات الأنسجة، وخاصة فيما يتعلق تشريح الغدة الثديية الماوس، تثبيت الأنسجة وباجتزاء الأنسجة المجمدة، ومفصل. بروتوكول قياسي لأداء المناعي غير المباشر، بما في ذلك خطوة استرجاع مستضد الاختيارية، ويقدم أيضا. وذكر أيضا مراقبة أقسام الأنسجة وصفت وكذلك الحصول على الصور والمعالجات اللاحقة. يعطي هذا الإجراء لمحة كاملة، من مجموعة من الأنسجة الحيوانية لتوطين الخلوية من البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة العامة التي يمكن تطبيقها على عينات الأنسجة الأخرى، فإنه يجب أن تتكيف مع كل نسيج / الابتدائية زوجين الأجسام المضادة التي شملتها الدراسة.

المقدمة

الغدة الثديية هي شاذة إفرازات الجهاز الثدييات التي هي لإنتاج الحليب لتغذية الأطفال حديثي الولادة وظيفة الرئيسي. تطوير أنسجة الثدي تحدث بشكل رئيسي بعد الولادة وتتميز عملية فريدة من نوعها فيها ظهارة يغزو سدى المحيطة بها. هذا النسيج يخضع العديد من التغييرات (النمو، والتمايز والانحدار)، وخصوصا خلال حياة الكبار، بالتزامن مع وجود اختلافات في حالة الإنجاب (الشكل 1). بالإضافة إلى التشكل العام للأنسجة، ونسب أنواع مختلفة من الخلايا وكذلك ترتيبها داخل الغدة الثديية تتغير بشكل كبير خلال تطوير 1-5.

خلال الحياة الجنينية، وظهارة الثديية مستمد من خطوط حليب الثدي، والتي تم تعريفها من قبل سماكة طفيفة والطبقية من الأديم الظاهر، وبين الصدارة والخلفية أطرافه على كل جانب من خط الوسط حول يوم الجنينية 10.5 (E10.5) (الشكل 1A ).على E11.5، خط الحليب تتكسر إلى اللوحاءات الفردية، والتي تتمركز بشكل متناظر على طول الخط حليب الثدي في مواقع قابلة للتكرار، واللحمة المتوسطة المحيطة يبدأ تتكثف. واللوحاءات تبدأ في الغرق أعمق في الأدمة وتنظم اللحمة المتوسطة الثديية في طبقات متحدة المركز حول برعم الثدي (E12.5-E14.5). اعتبارا من E15.5، ظهارة الثديية، ويبدأ في الانتشار واستطال لتشكيل برعم الرئيسي الذي يدفع من خلال اللحمة المتوسطة الثديية نحو لوحة الدهون. تنبت الأساسي يطور التجويف جوفاء مع الانفتاح على الجلد، والتي تمثلت في تشكيل غمد الحلمة. على E18.5، نمت القناة التمطيط في لوحة الدهون وتشعبت إلى نظام الأقنية مفرغة صغيرة شملت في لوحة الدهون. تم القبض على التنمية أساسا، ويبقى الغدة الثديية البدائية هادئة morphogenetically حتى سن البلوغ. في الجنين الذكر، وتنشيط مستقبلات الاندروجين يؤدي إلى انحطاط البراعم، والتي تختفيقبل E15.5. اعتبارا من E18، توقف تطوير الثديية حتى سن البلوغ 6-9.

عند الولادة، والغدة الثديية تؤوي نظام الأقنية بدائية أن يستطيل وفروع ببطء (النمو متساوي القياس). في بداية سن البلوغ، وهياكل كروية يقع على نصائح من القنوات تسمى براعم نهاية طرفية (TEBs)، تتشكل من طبقة خارجية من الخلايا سقف واللب الداخلي متعدد الطبقات من الخلايا (خلايا الجسم). هذه الهياكل هي التكاثري للغاية، والتغلغل في الأنسجة اللحمية المحيطة استجابة لمنبهات الهرمونية. انتشار ضمن نتائج TEBs في استطالة الأقنية، إلى جانب المتفرعة التشكل. هذه العملية تؤدي إلى إنشاء شبكة مفرغة الظهارية الأساسية المنبثقة من الحلمة (الشكل 1B، البلوغ). في ~ بعد 10-12 أسابيع الميلاد، عندما ظهارة غزت لوحة الدهون كلها، توقف توسعها وTEBs تختفي. تطوير الأقنية ثم يخضع لتغيرات ديناميكية، أي successiلقد انتشار والانحدار من الخلايا الظهارية وفقا لدورات داقية 10 (1B الشكل، والكبار).

من بداية الحمل، والأنسجة الثديية يخضع النمو المهم والتغيرات المورفولوجية للتحضير لالرضاعة. ظهارة الثديية تتكاثر على نطاق واسع والتفريق، مما يؤدي إلى شبكة انبوبية-السنخية تشعبت للغاية. وفي الوقت نفسه، الخلايا الظهارية الثديية (MECs) تصبح الاستقطاب وقادرة على تجميع وتفرز منتجات الألبان. MECs تنظم في العديد من الهياكل السنخية (عنيبات) التي تحيط بها خلايا عضلية ظهارية مقلص وإدخالها على سدى تتكون من الأنسجة الضامة والدهنية والأوعية الدموية والنهايات العصبية (1B الشكل، والحمل). وعلاوة على ذلك، فإن الجانب القاعدي من MECs على اتصال وثيق مع الغشاء القاعدي (المصفوفة خارج الخلية)، والتفاعلات بين هذين الكيانين تنظيم بإحكام على حد سواء التشكل وظيفة إفرازية ماماراي ظهارة 11-13.

كل هذه العمليات تعتمد على العمل من العظة مختلف البيئية، والتي من أهمها hormones14، عوامل نظير الصماوي والمصفوفة خارج الخلية. على سبيل المثال، البروجسترون يدفع اسعة 15 و alveologenesis ذلك، بالاشتراك مع البرولاكتين (PRL)، المتفرعة الجانب 16،17، ويعزز ويحافظ على التفريق بين الحويصلات الهوائية. بالإضافة إلى المنشطات وPRL18، السيتوكينات ومسارات الإشارات المرتبطة بالتنمية وتشارك (WNT والشق مسارات الإشارات) أيضا في التزام النسب الثديية والتنمية 19-21. في نهاية الحمل، وMECs اللمعية تبدأ في إنتاج الحليب الغنية بالبروتين يعرف باسم اللبأ في تجويف الحويصلات الهوائية. بالإضافة إلى ذلك، البروجسترون يعمل على نفاذية الظهارية ومنذ منعطفات ضيقة لا تزال مفتوحة، تم العثور على اللبأ أيضا في مجرى دم الأم.

بعد الولادة، ومعمر الذي كان ينتظرذ ظهارة يستغرق ما يقرب من جميع حجم الغدة الثديية، ودرجة عالية من التنظيم (الشكل 2، ظهارة الثديية). يتم تشكيل وحدات إنتاج الحليب، وهي الحويصلات الهوائية (الشكل 2، سنخ)، عن طريق أحادي الطبقة الخلايا الظهارية الثديية الاستقطاب الإفرازية (MESCs)، مع غشاء البلازما قمية من ترسيم التجويف. الحويصلات الهوائية ترتب نفسها في الفصيصات التي تم تجميعها داخل فصوص متصلة القنوات التي تستنزف الحليب إلى الوسط الخارجي (الشكل 2، الفص). تحدث الرضاعة، أي، MESCs تبدأ في إفراز كميات وفيرة من الحليب، ناجمة أساسا عن انخفاض في هرمونات المشيمة (أساسا البروجسترون) (الشكل 1B، الرضاعة). يتم تنشيط جينات بروتين الحليب في دورة الوقت الزمني المحدد بدءا من الحمل إلى الرضاعة 9،22،23، وعلى رأسها ردا على PRL النخامية صدر في وقت الرضاعة. وفي الوقت نفسه، والاتصالات بين MESCs والمصفوفة خارج الخلية كلا تحفيز بروتين الحليب synthesis من خلال الإشارات التي يتم مكتسب من خلال التفاعلات بين integrins الخلوية و laminin 24،25، وقمع موت الخلايا المبرمج في MESCs 26،27. هذه مسارات إشارات تؤدي إلى تنشيط بروتين الحليب المروجين الجين 28 من خلال تفعيل النسخ محددة عوامل 29. الاتصالات خلية خلية مهمة لبعض جوانب التمايز بما في ذلك إنشاء القطبية القمي وإفراز اتجاهي منتجات الألبان أيضا. منعطفات ضيقة وثيقة بسرعة بعد بداية الرضاعة وMESCs تنسق بدقة امتصاص الجزيئات من الدم وكذلك تركيب ونقل وإفراز مكونات الحليب، وذلك استجابة لمتطلبات الغذائية لحديثي الولادة. في وقت الرضاعة، وانكماش خلايا عضلية ظهارية المحيطة الحويصلات الهوائية يحدث استجابة لالأوكسيتوسين ويؤدي إلى قذف اللبن من خلال القنوات وإلى الحلمة. الحليب هو السائل معقد يحتوي على البروتينات (في الغالبكازيين)، والسكريات (اللاكتوز بشكل رئيسي)، والدهون، والمعادن، وكذلك جزيئات النشطة بيولوجيا مثل المناعية A (ايغا)، عوامل النمو والهرمونات. وقد تم تجميع كازيين، وتجميعها في هياكل supramolecular، وهي الكازين المذيلات، نقل على طول مسار إفرازية، ثم أطلق سراحه من قبل إيماس، أي مزيج من التي تحتوي على الكازين الحويصلات الإفرازية (SVS) مع غشاء البلازما قمية من مسك (الشكل 2).

يعتمد حركة المرور داخل الخلايا على تبادل المواد بين الأجزاء غشائي وينطوي القابلة للذوبان N-ethylmaleimide-حساس فيوجن (NSF) البروتين مرفق (SNAP) مستقبلات (الفخ) 30،31. تنقسم عائلة البروتينات كمين في الافخاخ حويصلي (الخامس الافخاخ)، موجودة في غشاء الحويصلة، والافخاخ الهدف (تي الافخاخ)، مترجمة على الأغشية الهدف. من خلال فتح سوستة من خلال المجالات ملفوف لفائف، والخامس ور الافخاخ-تجميع لتشكيل مستقر للغاية مجمع حزمة أربعة الحلزون، يشار إلى عشرالبريد مجمع الفخ. هذا المجمع يعزز الانصهار اثنين من طبقات ثنائية الدهون معارضة من قبل تقديمهم تدريجيا الى مقربة 30،32. بعد ذلك، يتم فصل المجمعات كمين من قبل الأدينوزين فسفاتاز جبهة الخلاص الوطني وإعادة تدويرها البروتين محول SNAP وكمين البروتينات عودتها الى مقصورة منشئهم 33. ومن المثير للاهتمام، كل بروتين كمين تكمن أساسا في الأجزاء الخلوية متميزة وكمين الاقتران يمكن أن تسهم في خصوصية الأحداث الانصهار داخل الخلايا 34. وتشير دراسات سابقة إلى أن ما لا يقل عن 23 بروتين (SNAP23) والحويصلة غشاء المرتبطة البروتين 8 (VAMP8)، وsyntaxins (STX) Synaptosomal المرتبطة -7 -12 وتلعب دورا في الكازين إيماس 35،36. كما تم العثور على هذه البروتينات بالتعاون مع الكسر الدهون من الحليب، أي دهن الحليب كريات (MFGs) 37. النموذج السائد الحالي تفترض أن قطرات الدهون حشوية (CLDs) تتشكل من تراكم ل محايدipids (أساسا triacylglycerols واسترات ستيرول) والكوليسترول المستمدة من النظام الغذائي للأم بين اثنين من منشورات من الشبكة الإندوبلازمية (ER) غشاء 38-41. تتشكل CLDs كبيرة، على الأقل جزئيا، من خلال انصهار CLDs أصغر أثناء نقله إلى الجانب قمية من MESCs حيث يتم اطلاق سراحهم كما MFGs (1-10 ميكرون في القطر) التي مهدها، ويجري enwrapped من قبل مسك القمي غشاء البلازما 40-42. الرضاعة تتوقف بعد مفطوم الجراء وMESCs يموت تدريجيا موت الخلايا المبرمج، مما أدى إلى تراجع الأنسجة الثديية إلى حالة البلوغ (الشكل 1B، ارتداد).

المناعي (IF) هو أسلوب مختبر تحليلي مشترك المستخدمة في جميع الجوانب تقريبا البيولوجيا، سواء في مجال البحث والتشخيص السريري. IF تقنيات يمكن القيام بها على أقسام الأنسجة (المناعية، IHC) أو الخلية (مناعية، ICC) العينات. يعتمد هذا النهج قوية على استخدام fluorescent-الأجسام المضادة المسماة التي تربط تحديدا (مباشرة أو غير مباشرة) للمستضد من الفائدة، مما يسمح التصور من توزيع الأنسجة من خلال المجهر مضان. يعتمد إشارات مضان في الغالب على نوعية وتركيز الأجسام المضادة والتعامل السليم للعينة. ويرد بروتوكول بسيط المناعي غير المباشر (IIF) للكشف عن منتجات الحليب (كازيين وMFGs) والبروتينات المشاركة في إفراز منتجات الحليب (butyrophilin (BTN1)، كمين البروتينات) على الأبواب المجمدة من الأنسجة الماوس الثديية (الشكل 3). بينما يوفر هذا البروتوكول لمحة IHC كاملة، بدءا من جمع الأنسجة لصورة ما بعد العلاج، تنتقد والخطوات الاختيارية وكذلك بعض التوصيات الفنية وتعرض أيضا ومناقشتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كانت ولدت الفئران CD1 في INRA (UE0907 IERP، جوي-أون-Josas، فرنسا). جميع الجوانب الأخلاقية للرعاية الحيوان امتثلت للمبادئ التوجيهية ذات الصلة ومتطلبات الترخيص المنصوص عليها من قبل وزارة الزراعة الفرنسية. تمت الموافقة على الإجراءات المتبعة من قبل لجنة الأخلاق المحلية (اتفاق 12/097 من Comethea جوي-أون-Josas / AgroParisTech).

1. الغدة الثديية إعداد نموذج

  1. الماوس الغدة الثديية تشريح
    1. الموت ببطء الفئران في اليوم 10 من الرضاعة خلع عنق الرحم ويعلقون الحيوان أسفل البطن مع لمواجهة.
    2. الرطب المنطقة البطنية مع الإيثانول وجففه بمنشفة ورقية.
    3. باستخدام ملقط، سحب ما يصل إلى الجلد في منطقة البطن بين رجليه الخلفيتين وإجراء شق (عن طريق الجلد فقط) من حوالي 1 سم مع مقص حاد. بدءا من هذا الشق الأول، ثم استخدم المقص لقطع الجلد حتى العنق على الماوس. سحب الجلد بعيدا عن الصفاق وبين أسفل جانب واحد من الجلد في وقت واحد، أنها تمتد تدريسها.
    4. جمع البطن والغدد الثديية الأربية التي تدفعهم بعيدا عن الجلد مع مسحة وأخيرا سحب او قطع منها بعيدا عن الصفاق.
      ملاحظة: في هذه الخطوة كارمين تلطيخ يمكن القيام بها من أجل رؤية ظهارة الثديية داخل الغدة بأكملها 43. هذا النهج يمكن أن تكون مفيدة لتحليل مورفولوجيا العالمي الغدة الثديية في ظل ظروف مختلفة (مراحل تطور الفسيولوجية والأمراض والعلاجات في الجسم الحي).
    5. إزالة العقدة الليمفاوية تقع عند تقاطع البطن والغدد الأربية 44.
  2. تثبيت الأنسجة الثديية
    1. قطع الأنسجة الثديية إلى 3 مم 3 أجزاء مع مشرط وعلى الفور شطف هذه الشظايا في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل، ودرجة الحموضة 7.4، من أجل إزالة أكبر قدر من الحليب ممكن.
    2. يجف بسرعة شظايا على ورقةمنشفة ووضعها في محلول PBS الباردة التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA، HCHO، 32٪ محلول الفورمالديهايد، تنبيه) لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: هذا هو ما يكفي من الوقت للسماح للتحليل لاحقة على شرائح الأنسجة الثديية التي كتبها IIF36 و / أو التهجين في الموقع 45 في. لكن، وكما تخترق مثبتات ألدهيد ببطء في قطعة نسيج (~ 1-3 ملم في الساعة)، ويجوز تمديد هذه الفترة لضمان التثبيت الأمثل للعينة الأنسجة. بدلا من ذلك، إصلاح الأنسجة في الجسم الحي من قبل perfusing حيوان تخدير مع حل تثبيتي (وليس بالتفصيل في هذه الدراسة).
  3. ضخ السكروز
    1. شطف بسرعة شظايا الثديية في برنامج تلفزيوني الباردة وتزج بهم في حل PBS الباردة التي تحتوي على 40٪ سكروز (D السكاروز، C12H22O11، السيد 342.3 غرام / مول) ل16-48 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت الهز لطيف.
  4. الأنسجة التضمين
    ملاحظة: في هذه الخطوة، شظايا الثديية يمكن إعادة قطع من أجل جعل أجزاء أصغر (2-3 ملم 3) أو لضبط شكلها.
    1. صحيح تسمية القوالب البلاستيكية وملء ثلث حجم القالب مع أكتوبر مركب، حافظت على RT. وضع جزء واحد (2-3 ملم 3) من الأنسجة الثديية في قالب وتغطية ذلك مع أكتوبر المجمع.
    2. وضع قوالب على السطح من النيتروجين السائل (على ورقة من الألومنيوم أو استخدام منخل معدني)، والسماح للمنتج لتجميد.
      ملاحظة: يجب أن تصبح صلبة والأبيض قبل غمر العفن في النيتروجين السائل.
  5. تخزين العينات المجمدة في -80 درجة مئوية حتى تتم أقسام الأنسجة.

2. المجمدة باجتزاء الأنسجة

ملاحظة: ناظم البرد، التي هي في جوهرها مشراح داخل الفريزر، هو مطلوب لجعل أقسام الأنسجة المجمدة. وغالبا ما يتطلب انخفاض درجة الحرارة لالأنسجة الدهنية أو الدهنية الغنية مثل الغدة الثديية البكر.

  1. ضبط درجة حرارة ناظم البرد إلى -26 ° C وانتظر حتى يكون لديها stabilized. الحفاظ على كتلة الأنسجة المجمدة في -26 ° C في جميع أنحاء الداخلي باجتزاء بأكمله. تجنب تماما ذوبان النسيج في أي وقت أثناء العملية.
  2. تبريد شفرة حلاقة، ودعم عدة قطاعات، جهاز مكافحة لفة وفرشاة ل-26 ° C عن طريق وضعها في ناظم البرد لمدة 10 دقيقة على الأقل. وضع أيضا مربع الشريحة داخل ناظم البرد من أجل أن تكون قادرة على تخزين الشرائح الزجاجية كما يتم إجراء الأقسام.
  3. صحيح تسمية الشرائح الزجاجية التي سيتم استخدامها لجمع المقاطع الأنسجة والمحافظة عليها في RT. وإلا سوف أقسام الأنسجة لا تلتزم بها. إزالة عينة من العفن داخل ناظم البرد.
    ملاحظة: وسوف تستخدم الشرائح الزجاجية المشحونة إيجابيا لصالح كثيرا من التصاق أقسام جديدة الأنسجة المجمدة بسبب ارتفاع جاذبية كهرباء.
  4. تغطية سطح القرص الأنسجة المعدنية مع أكتوبر مجمع (الحفاظ على RT)، ودفع العينة المجمدة على ذلك. وضع الرطب جبل داخل ناظم البرد والسماح لها بالمشاركةرأ لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  5. وضع جبل الرطب في حامل القرص من ناظم البرد. ضبط سمك قطع 5-6 ميكرون، وإذا أمكن، استخدام شفرة حادة جديدة أو على الأقل تغيير المنطقة على شفرة تستخدم لقطع كل عينة لأنها سوف بعض الأنسجة مملة بسرعة.
  6. ضبط الموقف من جهاز مكافحة لفة على شفرة حلاقة بجعل التخفيضات من المتوسطة المتزايدة حتى يتم تشكيل شرائح بالتساوي وبشكل صحيح. من الناحية المثالية، فإن جهاز مكافحة لفة خطوة على شفرة حلاقة بنحو 1 مم.
  7. وبمجرد أن الإعدادات صحيحة، نفذ أقسام الأنسجة عن طريق تحريك العجلة في حركة موحدة مستمرة. إلا إذا كانت درجة الحرارة المثالية، قسم الأنسجة و، بحكم طبيعتها، في محاولة لعقص.
    1. استخدام فرشاة لانتزاع والمناورة القسم عبر المرحلة من أجل وضعه كما هو مطلوب على شريحة زجاجية. استخدام الفرشاة لتنظيف بقايا ربما موجودة على كتلة الأنسجة المجمدة و / أو شفرة حلاقة.
  8. سحبقسم الأنسجة نحو المستخدم، وتجنب الضغط عليه على خشبة المسرح ناظم البرد. تجنب الضغط على قسم الأنسجة على خشبة المسرح ناظم البرد لأنها قد تؤدي إلى التصاق شريحة الأنسجة على المسرح، وبالتالي عدم القدرة على استعادتها مع شريحة زجاجية.
  9. استرداد أقسام الأنسجة واحدا تلو الآخر من قبل انتشالها على سطح شريحة زجاجية، بوضعها فوق الباب، وتتحين الفرصة عليه لمسة من قسم الأنسجة.
    ملاحظة: أقسام الأنسجة الالتزام بسرعة على الزجاج الحار بسبب جاذبية ثابت. إذا وضعت عدة أقسام الأنسجة على نفس الشريحة، يجب الحرص على عدم التداخل بينها وإلى الفضاء لهم ما يكفي لتكون قادرة على إحاطة منهم على حدة في دائرة مسعور (انظر البند 3.1.1.).

3. المناعي غير المباشر

  1. تحديد الأقسام
    1. استخدام القلم حاجز مسعور لرسم دائرة مسعور حول الأنسجة محمولة على الشرائح. السماح للدائرة الجافة لحوالي 1 دقيقة في RT. رسم خط حول رأقسام القضية مع علامة دائمة السوداء الجميلة أيضا، ولكن على جانب من الشريحة الزجاجية مقابل واحد حيث هي أقسام الأنسجة.
      ملاحظة: هذه الدائرة بالماء طارد وacetone- والكحول غير قابلة للذوبان. وبالتالي فإنه يوفر حاجزا أمام المحاليل المائية المستخدمة أثناء إجراء IHC ويقلل من حجم الكواشف اللازمة.
    2. ترطيب أقسام الأنسجة التي تغطي عليها مع قطرة من ~ 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة بضع دقائق في RT. إصلاح أقسام الأنسجة التي تغطي لهم ~ 250 ميكرولتر من الطازجة 3٪ PFA الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
      ملاحظة: اختياريا في هذه الحالة، استخدم الحل ألدهيد التبريد (كلوريد الأمونيوم 50 ملم (NH 4 الكلورين، السيد 53.5 جم / مول) في برنامج تلفزيوني أو 0.1M الجلايسين (C 2 H 5 NO 2، السيد 75.07 غرام / مول) في برنامج تلفزيوني ) لوقف تفاعل تثبيت. بسيطة وفيرة PBS غسل يكفي عموما لإزالة ألدهيد غير المتفاعل.
  2. استرجاع مستضد (اختياري)
    ملاحظة: في حين أن معظم المضادات يمكن الكشف دون استرجاع مستضد (AR)، سيلاحظ الآخرين إلا إذا تم تنفيذ هذه الخطوة. في بعض الحالات، AR يسمح أيضا تعزيز إشارة لوحظ.
    1. وضع حل AR (100 ملي تريس (C 4 H 11 NO 3، السيد 121.14) 5٪ اليوريا (NH 2 CONH 2، السيد 60.06) درجة الحموضة 9.6) في كوب. يجب أن يكون حجم محلول AR كافية لتغطية كامل الشرائح الزجاجية وضعها في حامل الزجاج.
    2. سخن حل AR إلى 95 ° C خلال رصد درجة الحرارة مع الحرارة وثم ضع الشرائح الزجاجية على رف مناسبة، immerge رف في المنطقة العازلة الساخنة، وغطاء للحد من التبخر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية.
    3. إزالة كوب من حمام الماء وتترك الشرائح الزجاجية لمدة 10 دقيقة أخرى في المنطقة العازلة.
  3. مناعي
    1. شطف أقسام الأنسجة مع PBS (~ 250 ميكرولتر / قسم) وتشبع لهم حلا3٪ ألبومين المصل البقري (BSA، ~ 250 ميكرولتر / قسم) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
    2. وضع 30-50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA على كل قسم الأنسجة.
      ملاحظة: هذا الحجم يكفي لتشكيل الهبوط الذي يغطي تماما على قسم الأنسجة.
    3. وضع نفس حجم مخفف (2٪ BSA في PBS) وحده على قسم الأنسجة لأداء السلبية من دون السيطرة الأجسام المضادة الأولية.
      1. تشمل منهجية هذا الشاهد السلبي في كل تجربة IHC وأداء لكل الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة لتقدير خلفية التجربة (وضع العلامات غير محددة بسبب الأجسام المضادة الثانوية و / أو الأنسجة لصناعة السيارات في مضان). ويمكن أيضا أنواع أخرى من الضوابط الإيجابية أو السلبية القيام بها لضمان خصوصية وضع العلامات (انظر المناقشة).
    4. وضع الشرائح الزجاجية في مربع O مرطب / N عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة الماوس وحيدة النسيلة المضادة للcytokeratin8 (CK8، 01:50 تمييع)، والماوس وحيدة النسيلة المضادة للcytokeratin 14 (CK14، 01:50 تمييع)، الأرنب بولكلونل مكافحة فأر الكازين (# 7781، 01:50 التخفيف، وقدمت بسخاء من قبل MC نيفيل، جامعة كولورادو الصحة مركز العلوم، CO، الولايات المتحدة الأمريكية)، الأرنب بولكلونل المضادة للBTN1 (1: 300 التخفيف، وقدمت بسخاء من قبل IH ماذر، قسم علوم الحيوان والطيور، جامعة ميريلاند، كلية بارك، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)، الأرنب بولكلونل المضادة للStx6 ( 1:50 التخفيف، وقدمت بسخاء من قبل S. Tooze، معهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة، معهد البحوث لندن، لندن، المملكة المتحدة) والأرنب بولكلونل المضادة للVAMP4 (01:50 تمييع).
    5. تماما غسل أقسام الأنسجة مع PBS أربع مرات على الأقل لمدة 10 دقيقة في RT.
    6. تمييع الأجسام المضادة المناسبة الثانوية (رودامين مترافق الماعز مفتش المضادة للأرنب (H + L)، 1: 300 تمييع) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA، ضع 30-50 ميكرولتر من هذا الحل على جميع أقسام الأنسجة، واحتضان لمدة 1.5 ساعة في RT.
      1. منذ fluorochromes هي جزيئات حساسة للضوء، لافضح أقسام الأنسجة للضوء حتى تحليلهم. لمعهد التمويل الدولي على أقسام الأنسجة، لصالح الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى fluorophore الأحمر منذ أغشية الخلايا تميل إلى توليد الأخضر لصناعة السيارات في مضان التي يمكن أن تتداخل مع انخفاض العلامات. وعلاوة على ذلك، واختيار يقترن fluorophore الأجسام المضادة الثانوية الأحمر يسمح بوضع العلامات يصاحب ذلك من الدهون المحايدة (انظر أدناه).
    7. تماما غسل أقسام الأنسجة مع PBS أربع مرات على الأقل لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. بعد التثبيت (اختياري)
    1. بالنسبة لبعض التجارب، نفذ ما بعد التثبيت، التي يحتضنها العينات مع 2٪ PFA مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT من أجل تحقيق الاستقرار السقالات مستضد / الأضداد. ومع ذلك، فإن هذه الخطوة يمكن الاستغناء عنها في معظم الحالات.
  5. الدهون محايدة وcounterstaining DNA
    1. لتصور CLDs وMFGs، اللون الدهون المحايدة التي يحتضنها أقسام الأنسجة في 30-50 ميكرولتر من محلول PBS تحتوي على 3 ميكروغرام / مل من bodipy 493/ 503 لمدة 10 دقيقة في RT. شطف بسرعة أقسام الأنسجة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    2. مباين DNA النووي مع 30-50 ميكرولتر من محلول PBS تحتوي على 3 ميكرومتر من دابي (4-6-diamidino-2-phenylindole، 5 ملغ / مل حل الأسهم) لمدة 10 دقيقة في RT. غسل أقسام الأنسجة مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل تركيب الشرائح للمراقبة.
  6. قسم التركيب
    1. إزالة برنامج تلفزيوني ووضع قطرة من تصاعد المتوسطة على كل قسم الأنسجة.
    2. ضع جانب واحد من انزلاق الغطاء بزاوية ضد الشريحة، مما يجعل الاتصال مع الحافة الخارجية للانخفاض السائل ومن ثم خفض الغطاء ببطء، وتجنب فقاعات الهواء. تدع السائل انتشرت بين شريحة زجاجية وانزلاق الغطاء لبضع دقائق ثم قم بإزالة الفائض من تصاعد المتوسطة مع منشفة ورقية.
    3. ختم زلة تغطية على شريحة زجاجية مع أقسام طلاء الأظافر والأنسجة تخزينها في 4 ° C لمنع تعرضها للضوء حتى الملاحظة.

4. الإسفار المراقبة والحصول على صورة

ملاحظة: A المجهر مضان مجهزة مطلوب كاميرا تسيطر عليها البرنامج الحصول على الصورة لاحظ النتائج IHC.

  1. قبل الحصول على الصور، والتحقق من كثافة العلامات وتقييم خلفية التجربة من خلال النظر في ضوابط السلبية. الحصول على الصور من كل تسمية الفلورسنت (قناة لون) بشكل فردي.
  2. الحصول على جميع الصور، بما في ذلك الضوابط المقابلة، في نفس الظروف (التعرض والإعدادات العامة) لكل قناة لون.
  3. المجهر التقليدية
    1. أداء المجهر epifluorescence مع المجهر مزودة بمرشحات القياسية لثيوسيانات فلوريسئين (FITC والأخضر)، رودامين (أحمر) ودابي (الأزرق) الانبعاثات، و× 20 إلى × 63 (للنفط غمر، NA 1.3) الأهداف وكاميرا التصوير DP50.
  4. المجهر متحد البؤر
  5. أداء متحد البؤر المجهري مع مايكروينالتعامل مجهزة البرنامج ZEN، وذلك باستخدام × 20 × 63 ل(النفط غمر، NA 1.4) الأهداف وموجات الإثارة 488- و 568 نانومتر ليزر.

العلاج 5. صورة

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع صورة المعالجات اللاحقة باستخدام البرمجيات الحرة يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/).

  1. ركب صورة (دمج)
    1. فتح الصور المكتسبة في كل قناة من شأنها أن تكون مجتمعة (ملف / فتح). إذا كان يعمل مع الصور الرمادية 8 بت، السمة اللون الاصطناعي لكل قناة باستخدام جدول بحث (الجداول صورة / بحث).
    2. توليد صورة مركبة من الصور الرمادية أو الملونة باستخدام الأمر "قنوات دمج" (صورة / اللون / دمج قنوات) ثم ينسب لون لكل قناة.
    3. أداء صورة مداخن استعلاء بنفس الطريقة عن طريق فتح مداخن المكتسبة في كل قناة من شأنها أن تكون مجتمعة (ملف / فتح) واستخدام الأمر "دمج القنوات &# 8221؛ (صورة / اللون / دمج قنوات) إلى السمة لون لكل قناة. حفظ كومة مركب باعتبارها تسلسل الصور أو كفيلم (انظر القسم 5.4).
  2. صورة كومة Z الإسقاط
    1. استخدم الدالة Z الإسقاط (صورة / كومة / Zproject، ماكس الشدة) لتقديم وجهة نظر ثنائية الأبعاد من كل الصور من رصة صور من خلال إبراز لهم على طول محور عمودي على الطائرة صورة (ض محور). "أقصى كثافة" خيار يخلق صورة فيها كل بكسل يحتوي على القيمة القصوى على جميع الصور في المكدس. وهذا يولد صورة واحدة مما يسمح التصور من كل تلطيخ لوحظ من خلال صورة كاملة مكدس لقناة معينة أو بعد استعلاء عدة قنوات.
  3. صورة الإسقاط كومة 3D
    1. استخدم الأمر إسقاط 3D (مشروع صورة / كومة / 3D، ألمع نقطة، المحور ص) لإنشاء سلسلة من التوقعات لحجم الدورية الصعود إلى الطائرة. التقديم المرئي للسوrfaces والهياكل الداخلية يعتمد على كل من طريقة الإسقاط (أقرب نقطة، ألمع نقطة (المستخدمة هنا)، أو يعني القيمة) والمعلمات التصور مختارة. كل إطار من سلسلة الرسوم المتحركة هو نتيجة لإسقاط من زاوية النظر المختلفة.
    2. وتناوب على خلق صورة 3D حول كل من المحاور المتعامدة الثلاثة (تم اختيار المحور الصادي هنا). حفظ تسلسل كما تنتج صورة واحدة أو فيلم.
  4. صورة كومة لتحويل الفيلم
    1. فتح كومة صورة (ملف / فتح) وحفظه كفيلم في شكل افي باستخدام الأمر "AVI" (ملف / حفظ باسم / AVI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الغدة الثديية هي غدة تحت الجلد تقع على طول هيكل بطني كل من الصدر والبطن في القوارض. يظهر موقع خمسة أزواج من الغدد الماوس أثناء الحمل في الشكل (4). والتشكل من الغدة الثديية يتغير بشكل كبير خلال تطورها، مما يعكس التعديلات الفنية اللازمة للتحضير لالرضاعة الكاملة (الشكل 1B). في الحيوانات أو البكر ولم يسبق لها الحمل، تتكون الغدة الثديية من ظهارة الأقنية المتفرعة قليلة جزءا لا يتجزأ من داخل سدى الدهنية رقيقة قد يكون من الصعب أن نرى. من بداي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

IHC هي طريقة بسيطة نسبيا ومباشر التجريبي لتوطين مستضد في أقسام الأنسجة، والتي تعتمد في المقام الأول على التفاعلات حاتمة الأجسام المضادة المحددة. على الرغم من أن يتم استخدام عدد كبير من البروتوكولات في توطين بروتين من قبل معهد التمويل الدولي، جوهر هذه الإجراءات هو دائما نفسه تقريبا. ومع ذلك، هناك بعض الجوانب الهامة التي يمكن أن تؤثر بشدة نتيجة، وبالتالي يجب أن يكون الأمثل لكل دراسة IHC الفردية. الجانب الأكثر تحديا لهذا النهج هو لتحديد أفضل الظروف التجريبية، أي، تلك توليد إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

المؤلفون ممتنون لمرفق الأساسية التصوير INRA MIMA2 (INRA، UMR1198، جوي-أون-Josas) وإلى موظفي وحدة IERP (UE 0907، INRA، جوي-أون-Josas) للحصول على الرعاية والمرافق الحيوانية. كما نود أن نشكر IH ماذر، MC نيفيل وS. Tooze لتزويدنا antibodie مفيدة جدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقص
الإيثانول
مشرط وشفرات
ورق مناشف
شركةتحضير عينة الأنسجةتعليقات رقم الكتالوج/ الوصف
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4)SigmaP-3813
Paraformaldehyde (PFA ، 32٪ درجة EM ، 100 مل)المجهر الإلكتروني15714-Sمعدات الحماية الشخصية المطلوبة تحذير: سيعرضك هذا المنتج لغاز الفورمالديهايد ، وهي مادة كيميائية معروفة بأنها تسبب السرطان
مركب OCT / Tissue TekSakura4583
السكروز (D-saccharose)VWR27480.294
قوالب بلاستيكيةDominique Dutscher39910
دعم النيتروجين
/Leica & nbsp ؛شفرات الحلاقة CM3050S
(SEC35)Thermo Scientific152200
صندوق
الزجاجية Superfrost / Superfrost Ultra PlusThermo Scientific10143560W90 / 1014356190
Brushes
IHCرقم كتالوجالشركةالتعليقات / الوصف
Super Pap قلمسيجماZ377821-1EA
علامة دائمة (أسود)
50 ملي مولار NH4< / sub>Cl في PBSSigmaA-0171
0.1 M جلايسين في PBSVWR24403.367
محلول استرجاع المستضد: Tris 100 mM 5٪ سخان اليوريا pH9.6
(حتى 100 درجة ؛ ج)
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA7906-100G
Vectashield (وسيط تركيب مضاد للبهتان) بدون DAPI / معمختبرات ناقلاتH-1000 / H-1200
أغطية زجاجية 22 × 50 مم (درجة الفحص المجهري)VWRCORN2980-225
الأظافر
الأجسامالمضادة الأوليةتعليقات رقم كتالوج/ الوصف
كازين الأرانب المضادة للفأر (# 7781 ؛ تخفيف 1:50)موهوب بسخاء من قبل M.C. نيفيل (مركز العلوم الصحية بجامعة كولورادو
، الولايات المتحدة الأمريكية)
الفأر المضاد للسيتوكيراتين 8 (CK8 ، استنساخ 1E8 ، تخفيف 1:50) Biolegend(Covance)MMS-162P
Mouse المضاد للسيتوكيراتين 14 (CK14 ، cloneLL002 ، تخفيف 1:50)Thermo ScientificMS-115-P0 / P1
أرنب مضاد للبوتيروفيلين (1: 300 تخفيف)موهوب بسخاء من قبل I.H. ماذر (قسم علوم والطيور بجامعة ماريلاند كوليدج بارك ، الولايات المتحدة الأمريكية)
أرنب مضاد ل Stx6 (تخفيف 1:50)موهوب بسخاء S. Tooze
(أبحاث السرطان في المملكة المتحدة ، معهد أبحاث لندن ، لندن ، المملكة المتحدة) أرنب
مضاد للمصادم الدمجية 4 (تخفيف 1:50)Abcamab3348
الأجسام المضادة الثانويةرقم كتالوجالشركةالتعليقات / الوصف
الماعز المترافق بالرودامين المضاد للأرانب IgG (H + L) (1: 300 تخفيف)مختبرات Jackson ImmunoResearch111-025-003
Counterstainsرقم كتالوجالشركةالتعليقات / الوصف
Bodipy 493/503Life Technologies (المجسات الجزيئية)D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)تقنيات الحياة (المجسات الجزيئية)D-1306
الملاحظة / التقاطالصور<نمط الامتداد ="ارتفاع الخط: 20.8 بكسل; "> الشركة< / span >عدد الكتالوجالتعليقات / الوصف المجهر
الفلوري التقليديLeica Leitz DMRB
المجهر		مرشحات قياسية لانبعاثات FITC و Rhodamine
و DAPI ،   ؛                                       & مرات; 63 هدف الغمر بالزيت (NA 1.3) ، كاميرا التصوير DP50 (أوليمبوس) ، Cell & circ ؛ برنامج F (أوليمبوس)
مجهر المسح الضوئي بالليزر (الفحص المجهري متحد البؤر) ZeissLSM
510 المجهر		Plan-Apochromat & Times; 63 هدف الغمر بالزيت (NA 1.4),                                  برنامج CLSM 510,                            مرافق متحدة البؤر ، منصة MIMA2 ، INRA Jouy-en-Josas ، فرنسا ، http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
معالجة الصوررقم كتالوجالشركةالتعليقات / الوصف
ImageJ 1.49k برنامجمجاني
دبابيس تشريح مكيفة الثلج علوم السائل عينة الشرائح DAPI طلاء الشركة

المراجع

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: a journey of morphogenesis and commitment. Development. , 135-995 (2008).
  2. Smith, G. H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo model: evidence for distinct cellular progenitors of the ductal and lobular phenotype. Breast Cancer Res Treat. 39, 21-31 (1996).
  3. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479, 189-193 (2011).
  4. Oakes, S. R., Gallego-Ortega, D., Ormandy, C. J. The mammary cellular hierarchy and breast cancer. Cell Mol Life Sci. 71, 4301-4324 (2014).
  5. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes & development. 28, 1143-1158 (2014).
  6. Robinson, G. W. Cooperation of signalling pathways in embryonic mammary gland development. Nat Rev Genet. 8, 963-972 (2007).
  7. Cowin, P., Wysolmerski, J. Molecular mechanisms guiding embryonic mammary gland development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003251(2010).
  8. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003178(2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Integrated morphodynamic signalling of the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 581-593 (2011).
  10. Daniel, C. W., Smith, G. H. The mammary gland: a model for development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 3-8 (1999).
  11. Howlett, A. R., Bissell, M. J. The influence of tissue microenvironment (stroma and extracellular matrix) on the development and function of mammary epithelium. Epithelial Cell Biol. 2, 79-89 (1993).
  12. Edwards, G., Streuli, C. Signalling in extracellular-matrix-mediated control of epithelial cell phenotype. Biochem Soc Trans. 23, 464-468 (1995).
  13. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes & development. 12, 449-455 (1998).
  14. Topper, Y. J., Freeman, C. S. Multiple hormone interactions in the developmental biology of the mammary gland. Physiol Rev. 60, 1049-1106 (1980).
  15. Brisken, C., et al. A paracrine role for the epithelial progesterone receptor in mammary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 5076-5081 (1998).
  16. Ormandy, C. J., Binart, N., Kelly, P. A. Mammary gland development in prolactin receptor knockout mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2, 355-364 (1997).
  17. Oakes, S. R., Rogers, R. L., Naylor, M. J., Ormandy, C. J. Prolactin regulation of mammary gland development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 13, 13-28 (2008).
  18. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 715-725 (2005).
  19. Kouros-Mehr, H., Werb, Z. Candidate regulators of mammary branching morphogenesis identified by genome-wide transcript analysis. Dev Dyn. 235, 3404-3412 (2006).
  20. Khaled, W. T., et al. The IL-4/IL-13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development. Development. 134, 2739-2750 (2007).
  21. Asselin-Labat, M. L., et al. Gata-3 is an essential regulator of mammary-gland morphogenesis and luminal-cell differentiation. Nat Cell Biol. 9, 201-209 (2007).
  22. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105, 223-235 (1989).
  23. Robinson, G. W., McKnight, R. A., Smith, G. H., Hennighausen, L. Mammary epithelial cells undergo secretory differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation. Development. 121, 2079-2090 (1995).
  24. Streuli, C. H., Bissell, M. J. Mammary epithelial cells, extracellular matrix, and gene expression. Cancer Treat Res. 53, 365-381 (1991).
  25. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. J Cell Biol. 129, 591-603 (1995).
  26. Boudreau, N., Sympson, C. J., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 267, 891-893 (1995).
  27. Pullan, S., et al. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium. J Cell Sci. 109 (Pt 3), 631-642 (1996).
  28. Schmidhauser, C., Bissell, M. J., Myers, C. A., Casperson, G. F. Extracellular matrix and hormones transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9118-9122 (1990).
  29. Streuli, C. H., et al. Stat5 as a target for regulation by extracellular matrix. J Biol Chem. 270, 21639-21644 (1995).
  30. Sollner, T., et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature. 362, 318-324 (1993).
  31. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  32. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  33. Sollner, T., Bennett, M. K., Whiteheart, S. W., Scheller, R. H., Rothman, J. E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion. Cell. 75, 409-418 (1993).
  34. McNew, J. A. Regulation of SNARE-mediated membrane fusion during exocytosis. Chem Rev. 108, 1669-1686 (2008).
  35. Wang, C. C., et al. VAMP8/endobrevin as a general vesicular SNARE for regulated exocytosis of the exocrine system. Mol Biol Cell. 18, 1056-1063 (2007).
  36. Chat, S., et al. Characterisation of the potential SNARE proteins relevant to milk product release by mouse mammary epithelial cells. Eur J Cell Biol. 90, 401-413 (2011).
  37. Reinhardt, T. A., Lippolis, J. D. Bovine milk fat globule membrane proteome. J Dairy Res. 73, 406-416 (2006).
  38. Robenek, H., et al. Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10385-10390 (2006).
  39. Fujimoto, T., Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y. Lipid droplets: a classic organelle with new outfits. Histochem Cell Biol. 130, 263-279 (2008).
  40. Mather, I. H., Keenan, T. W. Origin and secretion of milk lipids. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, 259-273 (1998).
  41. Heid, H. W., Keenan, T. W. Intracellular origin and secretion of milk fat globules. Eur J Cell Biol. 84, 245-258 (2005).
  42. McManaman, J. L., Russell, T. D., Schaack, J., Orlicky, D. J., Robenek, H. Molecular determinants of milk lipid secretion. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 12, 259-268 (2007).
  43. de Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  44. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  45. Galio, L., et al. MicroRNA in the ovine mammary gland during early pregnancy: spatial and temporal expression of miR-21, miR-205, and miR-200. Physiol Genomics. 45, 151-161 (2013).
  46. Linzell, J. L., Peaker, M. The effects of oxytocin and milk removal on milk secretion in the goat. J Physiol. 216, 717-734 (1971).
  47. Knight, C. H., Peaker, M., Wilde, C. J. Local control of mammary development and function. Rev Reprod. 3, 104-112 (1998).
  48. Walid, M. S., Osborne, T. J., Robinson, J. S. Primary brain sarcoma or metastatic carcinoma? Indian J Cancer. 46, 174-175 (2009).
  49. Hue-Beauvais, C., et al. Localisation of caveolin in mammary tissue depends on cell type. Cell Tissue Res. 328, 521-536 (2007).
  50. McManaman, J. L., Neville, M. C. Mammary physiology and milk secretion. Adv Drug Deliv Rev. 55, 629-641 (2003).
  51. Mather, I. H., Jack, L. J. A review of the molecular and cellular biology of butyrophilin, the major protein of bovine milk fat globule membrane. J Dairy Sci. 76, 3832-3850 (1993).
  52. Heid, H. W., Winter, S., Bruder, G., Keenan, T. W., Jarasch, E. D. Butyrophilin, an apical plasma membrane-associated glycoprotein characteristic of lactating mammary glands of diverse species. Biochim Biophys Acta. 728, 228-238 (1983).
  53. Bock, J. B., Klumperman, J., Davanger, S., Scheller, R. H. Syntaxin 6 functions in trans-Golgi network vesicle trafficking. Mol Biol Cell. 8, 1261-1271 (1997).
  54. Tran, T. H., Zeng, Q., Hong, W. VAMP4 cycles from the cell surface to the trans-Golgi network via sorting and recycling endosomes. J Cell Sci. 120, 1028-1041 (2007).
  55. Wendler, F., Page, L., Urbe, S., Tooze, S. A. Homotypic fusion of immature secretory granules during maturation requires syntaxin 6. Mol Biol Cell. 12, 1699-1709 (2001).
  56. Wendler, F., Tooze, S. Syntaxin 6: the promiscuous behaviour of a SNARE protein. Traffic. 2, 606-611 (2001).
  57. Shitara, A., et al. VAMP4 is required to maintain the ribbon structure of the Golgi apparatus. Mol Cell Biochem. 380, 11-21 (2013).
  58. Thibault, C., Levasseur, M. C. La reproduction chez les mammifères et l'homme. , INRA Editions. 928 (2001).
  59. Truchet, S., Wietzerbin, J., Debey, P. Mouse oocytes and preimplantation embryos bear the two sub-units of interferon-gamma receptor. Mol Reprod Dev. 60, 319-330 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تقطيع الأنسجةالأنسجة المجمدةتموضع البروتيناستعادة المستضدالمجهر البؤريتثبيت الأنسجةالتقطيع باستخدام الميكروتوم المبردالأجسام المضادة الأولية
المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.