Method Article

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

DOI:

10.3791/53202

⸱

September 30th, 2015

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Biomedical Center, Uppsala University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.

פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.

Electroporation של פלסמידים DNA לעובר ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה ".

1. טיפול בביצה וגביית עיניים

  1. אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות.
    הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה.
  2. לדגור על....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7).

Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או ביטוי יתר של גן מוצרים שונים. לניסויי electroporation, אפיתל הפיגמנט הוסר בזהירות מעין enucleated של ST25 עובר (E4 ½). Explant הרשתית השלם היה א.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.

Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של תאים המבטאים את מבנה הגן של עניין. זה קל למצב בצורה נכונה את האלקטרודות ולחשוף חלק מסוים של הרשתית לריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר. גישה זו מאפשרת לשיט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי Barncancerfonden (PR2013-0104), מועצת המחקר השוודית (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond ו-St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1xPBS (טאבלט)טכנולוגיות חיים18912-014
10x DPBSטכנולוגיות חיים14080-048
צלחת פטרי 100 מ"מVWR734-0006
100 μ l קצות פיפטהVWR613-0798
1.5 מ"ל קוביית פלסטיק חד פעמיתתומאס סיינטיפיק8495V01
צלחת 24 בארותסיגמא אולדריץ'D7039
צלחת פטרי 35 מ"מVWR391-1998
70% אתנולSolveco1054
Cdk1/2 מעכב III217714Calbiochem300 ננומטר ב 0.01%
חממת תרבית תאיםמיקרוסקופ חיתוך תרמו פורמה
Leica
DMEMLife Technologies41966-029
אלקטרודותפלטינה, בהתאמה אישית
אלקטרו מרובע פורטור ECM 830מכשיר
F12 תערובת חומרים מזיניםטכנולוגיותחיים31331-028
FBSLife Technologies16140-071
מלקחייםAgnThos0108-5-PS
מדיום הקפאה NEG50Cellab, שוודיה6502
GFP מבטא DNA פלסמיד (pZGs)
חממה לחהGrumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, גרמניה8204
אינסוליןSigma AldrichI9278-5ML
L-glutamineLife Technologies25030024
הרכבה בינונית ProLong Gold עם DAPILife TechnologiesP36935
סרט פרפיןVWR291-1214P
ParaformaldehydeSigma Aldrich16005-1KG-R
עובש הטבעה Peel-A-Way סיגמא אולדריץ'E6032
פניצילין סטרפטומיציןLife Technologies15140-122
פוספוהיסטון 3 (PH3) Millipore06-570דילול 1/4,000
אלקטרודות פלטינה (עשויות בהתאמה אישית מ"רונדלים")סרג'נטה390-R (רונדלר)קוטר: 4 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ
אלקטרודות פלטמון סונידלCUY700P4Lקוטר: 4 מ"מ
פיפטה מפוליאתילן פסטורVWR612-2853
שייקר מסובבVWR444-2900
כף קטנהVWR231-2151
סוכרוזVWR443815S
ביציספק מקומי
מקרר ייןWineMaster 24, Caso , ברלין גרמניה
DMSO הרווארד לגהורן לבנות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
  2. Nakamura, H., Funahashi, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chicken Embryo RetinaRetinal Explant CultureElectroporation ProcedurePlasmid DNA TransfectionImmunofluorescence MicroscopyWhole Retinal ExplantChemical Reagent TreatmentCentral Nervous System DevelopmentCell Cycle AnalysisEx Ovo Technique

Related Articles