كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

ملخص

قد يكون نقل مجاميع البروتين من خلية إلى أخرى < p class = 'jove_content'> من خلية إلى أخرى ، أو البذور البروتينية ، أساس تطور علم الأمراض في الأمراض التنكسية العصبية. هنا ، يتم وصف مقايسة قياس التدفق الخلوي الجديدة FRET التي تتيح الكشف المحدد والحساس عن نشاط البذر من العينات المؤتلفة أو البيولوجية.

الملخص

تدعم الأدلة المتزايدة التكاثر عبر الخلايا لمجاميع البروتين السامة ، أو البذور البروتينية ، كآلية لبدء وتطور علم الأمراض في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر واعتلال التاوبخاطر ذي الصلة. يدعم الدور الحاسم المحتمل لبذور تاو في تطور المرض بقوة الحاجة إلى اختبار حساس يكتشف بسهولة نشاط البذر في العينات البيولوجية. < p class = 'jove_content'> من خلال الجمع بين خصوصية نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، وحساسية قياس التدفق الخلوي ، واستقرار خط الخلايا أحادي النسيلة ، تم تصميم مقايسة بذر فائقة الحساسية ومتوافقة مع اكتشاف البذور من العينات المؤتلفة أو البيولوجية ، بما في ذلك متجانسات دماغ الإنسان والفأر. يستخدم الاختبار خلايا HEK 293T أحادية النسيلة التي تعبر بثبات عن مجال التكرار المعرض للتجميع (RD) من تاو الذي يؤوي طفرة P301S المرتبطة بالمرض المدمجة إما في CFP أو YFP ، والتي تنتج إشارة FRET عند تجميع البروتين. يؤدي امتصاص بذور تاو البروتيوباتية (ولكن ليس البروتينات الأخرى) في خلايا المستشعر الحيوي إلى تحفيز تراكم RD-CFP و RD-YFP ، ويراقب قياس التدفق الخلوي بحساسية وكمية هذا FRET الناجم عن التجميع. يكتشف الاختبار تركيزات الفيمتومولار (مكافئ المونومر) لبذور تاو المؤتلفة ، وله نطاق ديناميكي يمتد على ثلاثة أوامر من حيث الحجم ، وهو متوافق مع تجانس الدماغ من الفئران المعدلة وراثيا والأشخاص الذين يعانون من اعتلال التاو البشري. مع تعديلات طفيفة ، يمكن للمقايسة أيضا اكتشاف نشاط البذر للبذور البروتينية الأخرى ، مثل α-synuclein ، وهو متوافق أيضا مع الثقافات العصبية الأولية. إن سهولة وحساسية وقابلية التطبيق الواسعة لقياس التدفق الخلوي FRET تجعل من المفيد دراسة مجموعة واسعة من اضطرابات تجميع البروتين.

المقدمة

تراكم داخل الخلايا تاو amyloids يعرف tauopathies مثل مرض الزهايمر. في مراحل المرض المبكرة، يتم ترجمة الأمراض عموما إلى مناطق منفصلة من الدماغ، ولكن مع تطور المرض، والأمراض ينتشر دائما على طول الشبكات العصبية متميزة ^1-5. وتشير الأدلة المتراكمة الانتشار العابر للمن المجاميع البروتين السامة راء هذه الأمراض (إعادة النظر في ^10/6). في هذا النموذج، يتم الافراج بذور proteopathic (على سبيل المثال، تاو) من الخلايا المانحة، وتدخل الخلايا المجاورة، وتحويل البروتين تاو الأصلي في شكل تتجمع عبر قالب تغيير متعلق بتكوين ^11-15. وقد تم تطوير هذا الفحص الموصوفة هنا للكشف عن حساسية هذا النشاط البذر. وهو متو....

البروتوكول

ملاحظة: يؤكد هذا البروتوكول استخدام الحنق قياس التدفق الخلوي للكشف عن النشاط البذر من العينات البيولوجية الماوس. كما أنه متوافق مع الألياف المؤتلف والعينات البيولوجية البشرية. تم تنفيذ القتل الرحيم الماوس والدماغ الحصاد وفقا للإجراءات المعتمدة IACUC.

1. استخراج الدماغ

1. وبعد التخدير العميق مع isoflurane (2٪)، يروي ماوس مع PBS الجليد الباردة التي تحتوي على 0.03٪ الهيبارين، واستخراج الدماغ التالية تفاصيل وصفها في غيج وآخرون ¹⁸
2. ....

النتائج

التدفق الخلوي الحنق تمكن الحساسة، الكمية، والكشف السريع عن النشاط البذر من عينات المؤتلف أو البيولوجية. إعداد الاختبار هو سطحي: يتم transduced خطوط الخلايا مستقرة وحيدة النسيلة مشتقة من التعبير عن تاو-RD-CFP / YFP مع المواد البذور، والمحتضنة لمدة 24-48 ساعة، وتعرض لتحليل التدفق الخلوي (الشكل 1A). في غياب البذور، وخلايا جهاز الاستشعار البيولوجي الحفاظ تاو في القابلة للذوبان، شكل أحادى (الشكل 1B). في ظل وجود البذور، ولكن خلايا جهاز الاستشعار البيولو.......

المناقشة

الحنق التدفق الخلوي النظام المذكور هنا هو أداة قوية لبسرعة وكميا تقييم النشاط تاو البذر. لا يتطلب سوى المعتدلة تجربة زراعة الخلايا ومعرفة عمل من الحنق والتدفق الخلوي. المقايسات البذر الأخرى، مثل Thioflavin T - الذي يسلك تعزيز مضان عندما يتجهون إلى هيكل رقة بيتا - هي شاقة وتتطلب نقية، البروتين المؤتلف الركيزة. بالإضافة إلى ذلك، فحوصات في المختبر لبذر تاو ليست سوى نصف الكمية ويتأثر عموما إلى مستويات subnanomolar المواد البذور ^23،24. الحنق التدفق الخلوي، ومع ذلك، .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
TBS	Sigma	T5912
cمثبطات البروتياز Omplete (خالية من EDTA)	قوارير Roche	4693159001
Cryo-Vials	Sarstedt	72.694.006
قوارب الوزن التحليلية	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weighing Boats Fisher Scientific	13-735-743
15 مل أنبوب مخروطي	الولايات المتحدة الأمريكية Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor الخالط بالموجات فوق الصوتية	Omni International	18-000-115
طرف صغير للمجانس بالموجات فوق الصوتية	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
إلغاء الضوضاء أغطية الأذن	فيشر Scientific	19-145-412
Kimwipes	فيشر Scientific	S47299
1.5 مل أنابيب	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1615-5510 < / a>
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة   ؛	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
مصل الأبقار الجنيني	HyClone	SH30071.03
بنسلين ستربتومايسين	لايف تكنولوجيز	15140-122
تقنيات الجلوتا ماكس	لايف	35050-061
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 مل أنابيب مخروطية	Phenix Research	SS-PH15
كاشف 25 مل	VWR	41428-954
ماصة متعددة القنوات	فيشر Scientific	TI13-690-049
96 ألواح قاع مسطحة بئر	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
ليبوفيكتامين 2000	Invitrogen	11668019
96 ألواح قاع مستديرة	جيدا Corning	3788
المجهر الإلكتروني	بارافورمالديهايد	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	لايف تكنولوجيز	14185-052
سورفال ST 40 الطرد المركزي	الحراري العلمي	75004509
BIOLiner متأرجح دلو دوار	حراري علمي	75003796
مقياس الدم	VWR	15170-172
MACSuant VYB Flow Cytomter	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
برنامج تحليل Flow	Jo Flow Jo
20 & ل نصائح الماصة	Rainin	GPS-L10
200 & mu ؛ ل نصائح الماصة	Rainin	GPS-250
1 مل أطراف ماصة	Rainin	GPS-1000
200 & mu ؛ ل نصائح ماصة	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1111-1800
5 مل ماصة مصلية	فينيكس	ريسيرش SPG-606180
10 مل ماصة مصلية	فينيكس ريسيرش	SPG-607180
25 مل ماصة مصلية	فينيكس ريسيرش	SPG-760180

16٪ علوم