Protocol
1. Oprensning af GST-mærket GTPase
- Kultur et E. coli-stamme, såsom BL21 transformeret med pGEX-Rac1 O / N ved 37 ° C, under omrystning ved 220 rpm, i 500 ml autoinduktionen medier (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH4CI, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glucose, 0,2% lactose, 5 g trypton, 2,5 g gærekstrakt, 100 ug / ml ampicillin).
- Harvest bakterier ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 xg, 4 ° C.
- Resuspender bakteriel pellet i 20 ml proteinekstraktion reagens, 1x proteasehæmmer og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur med inversion.
- Præcisere lysatet ved centrifugering ved 40.000 xg i 30 min.
- Tilsæt 2 ml glutathion magnetiske perler, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI).
- Inkuber i 2 timer, blanding ved inversion ved 4 ° C.
- Vask protein-loaded perler fire gange med 10 ml PBS under anvendelse af en magnetisk partikel sorteringsanlæg til udfældning af perlerne ved hvert trin.
- Resuspender protein-loaded perler i 2 ml PBS og opbevares ved -80 ° C i 100 pi alikvoter indtil de skal bruges.
2. Ekspression af GTPase-bindende proteiner
- Dagen før eksperimentet transficere plasmider, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket versioner af hver GTPase-protein i en separat 75-cm2 kolbe med HEK293T som følger. Til validering af nukleotid lastning, transficere GFP-mærkede TrioD1 ind i en tredje 75-cm2 kolbe af HEK293T.
- Fortynd polyethylamine til 1 mg / ml i 100 pi sterilt 150 mM NaCI.
- Tilføj 27 pi fortyndet polyethylamine til 223 pi reducerede serum medier.
- Tilføj 12 ug plasmid-DNA til 250 pi reducerede serum medier.
- Inkuber hvert rør i 2 minutter ved stuetemperatur. Kombiner polyethylamine og DNA blander i et enkelt rør og vortex i 2 min.
- Inkuber i 15-20 minutter ved stuetemperatur.
- Udskifte vækstmedium (Dulbeccos Modified Eagle Media, 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ingen antibiotika) på 90% sammenflydende HEK293T med 5 ml frisk vækstmedium.
- Tilsæt kombinerede polyethylamine / DNA-blandingen til kolben og inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
3. Oprensning af GTPase-bindende proteiner
- Skyl kolber af transficerede celler i PBS og afløb kolbe i 5 minutter, opsugning fri væske.
- Skrabe celler i 500 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x protease inhibitor) i mikrofugerør.
- Lyserer celler ved blanding ved inversion ved 4 ° C i 30 minutter.
- Under lyse, vask to partier af 40 pi GFP-Trap perler tre gange med frisk lysisbuffer, sedimenterende perler på 2.700 xg i 2 min mellem vaskene.
- Præcisere lysater ved centrifugering ved 21.000 x g i 10 min.
- Overførsel klaret lysat af hver af de konkurrerende proteiner at adskille vasket GFP-trap perler og tillader GFP-fusionsproteiner til at binde i 2 timer, blanding ved inversion ved 4 ° C. Hold lysat fra GFP-TrioD1 celler på is.
- Vask indlæst GFP-Trap perler to gange i 50 mM Tris-HCI (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (vægt / volumen) Nonidet P-40 og to gange i 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimenterende perler ved 2.700 xg i 2 minutter mellem vaske.
- Eluering GFP-fusionsproteiner ved at tilsætte 40 pi 0,2 M glycin (pH 2,5) og pipettere op og ned i 30 sek. Straks sediment perler på 21.000 xg i 60 s og flydende overførsel til et nyt mikrocentrifugerør indeholdende 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Gør dette hurtigt for at begrænse skader på det rensede protein.
- Analyser 1 pi af hvert oprenset protein ved Western blot og sonde med et anti-GFP-antistof til at etablere relative udbytte under anvendelse af en kvantitativ Blotting ifølge producentens protokol. Alternativt, fastlægge proteinkoncentrationer af bicinchoninsyre (BCA) assay men dette indfører fejl, hvis proteinerne ikke reagerer med assayet, på samme måde, eller der er kontaminerende proteiner.
- Udligne molær proteinkoncentration ved tilsætning af 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
4. Nucleotide belastning af GTPase
- Tø en portion af GST-Rac1 magnetiske perler, fremstillet i Trin 1.
- Tag 90 pi GST-Rac1 perler og vaskes tre gange med 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, ved hjælp af en magnetisk partikel sorteringsanlæg til udfældning af perlerne ved hvert trin.
- Aspirer buffer fra perler og tilsættes 100 pi 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
- Efter om BNP, GTP eller ingen nukleotid læsning er nødvendig for konkurrencen eksperimentet, tilsættes 12 pi 100 mM BNP, 12 pi 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] triphosphat (GTPyS) eller ingen nukleotid til 60 pi GST-Rac1 perler.
- For nukleotid-loading kontroller, opdele de resterende perler i tre 10-pi prøver og tilsæt 2 pi 100 mM BNP, 2 pi 10 mM GTPyS eller ingen nukleotid til hvert rør.
- Inkuber perle blandinger i 30 minutter ved 30 ° C under omrøring.
- Stabiliser nukleotid-bundet Rac1 ved tilsætning af 1 M MgCl2: 3 pi til den eksperimentelle mix (trin 4.4), 0,5 pi til hvert kontrolpunkt blandinger (trin 4.5).
5. Konkurrence binding.
- Opsætning 6 mikrocentrifugerør, der hver indeholder:
200 pi 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 pi eksperimentelle nucleotid-loaded Rac1 perler (fra trin 4.7)
5 pi Rac1-bindende protein A (konstant bindingsprotein) - Til hvert rør tilsættes 0, 1, 2,5, 5, 10 eller 20 pi Rac1-bindende protein B (variabel bindende protein). Disse mængder påtage sig enpproximately måske skal justeres lige lager koncentrationer af de konstante og variable bindende proteiner og.
- Juster volumener bindingsproteiner A og B, hvis der er store forskelle i bindingsaffiniteter for de to proteiner, og dette bør bestemmes empirisk ved de eksperimentelle gentagelser. Der fyldes op til totale volumen af bindingsblanding til 235 pi ved tilsætning af 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Opsæt en mikrocentrifugerør indeholdende:
200 pi 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 pi eksperimentelle nucleotid-loaded Rac1 perler (fra trin 4.7)
10 pi Rac1-bindende protein A (konstant bindingsprotein) - Opsæt BNP, GTPyS og ingen nukleotid kontrol rør:
200 pi 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 pi kontrol Rac1 perler er lagt i trin 4.5 med BNP, GTPyS eller ingen nukleotid og stabiliseret i trin 4.7.
180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysat, fremstillet som i trin 3.6
4 pi 1 M MgCl2 - Inkuber blandingen i 2 timer, blanding ved inversion ved 4 ° C.
- Vask perlerne tre gange med 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Eluerer bundne proteiner i 20 pi reducerende prøvebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml bromphenolblåt, 5% β-mercaptoethanol).
6. Analyse af konkurrencen
- Løse 10 pi af det bundne protein (trin 5.6) ved hjælp af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Western blot.
- Inkuber membranen ved 4 ° CO / N i anti-GFP-antistof fortyndet 1/1000 i blokerende buffer fortyndet til 1x i PBS, 0,1% Tween-20 til at detektere begge de mærkede GTPase-bindende proteiner.
- Vask membranen tre gange i 10 minutter med PBS, 0,1% Tween-20.
- Inkuber membranen i 30 minutter ved stuetemperatur i DyLight 800-konjugeret anti-kanin-secdært antistof, fortyndet 1 / 10.000 i blokerende buffer fortyndet til 1x i PBS, 0,1% Tween-20.
- Vask membranen tre gange i 10 minutter med PBS, 0,1% Tween-20.
- Scan membranen ved hjælp af en infrarød billeddannelse system, ved hjælp af software til at måle båndintensitet ifølge producentens protokol.
- Plot båndet intensiteten af hvert protein mod mængden af den variable konkurrent (Protein B).
- Opdele mængden af variable konkurrent på det sted, hvor de krydser hinanden ved omfanget af konstant konkurrent (Protein A, 5 pi) til bestemmelse af forholdet konkurrent ved hvilken ligevægt opnås.
- Til validering af nukleotid-lastning status, probe membraner til p21-aktiveret kinase 1 (Pak1) (en effektor) og GFP-TrioD1 (en GEF), som beskrevet i trin 6.1-6.6.
Representative Results
Denne protokol er udviklet til at beregne de relative affiniteter af bindingspartnere for Rac1, uden behov for at kende den præcise koncentration af konkurrenterne (figur 1). Bestemmelse af proteinkoncentration introducerer fejl og ved vurdering af konkurrencen mellem molekyler i en signalvej er ikke nødvendigt. Det er imidlertid vigtigt at vide, at de to konkurrenter har den samme molære koncentration i stamopløsningerne at tillade simple forhold, der skal beregnes, når tilsætning af forskellige mængder til analysen. 40 pi GFP-Trap perlerne har en bindingskapacitet ~ 300 pmol så en sammenflydende 75 cm 2 kolber af stærkt udtrykkende celler vil mætte perlerne, med det resultat, at præparater af de to forskellige bindingsproteiner vil være de samme før justering (figur 2A). Hvis et af proteinerne udtrykker dårligt, kan dette problem overvindes ved at oprense det protein fra mere end én kolbe af celler.
8 (figur 2B). GEFs fortrinsvis binder til nukleotid-fri GTPase at stabilisere overgangen tilstand. Som GEFs er af lav tæthed, som regel inaktiv og ofte skamplet dårligt, er det bedre at overudtrykke en eller GEF GEF fragment til test nukleotid-fri GTPase. Vi bruger ofte det første Dbl homologi af Trio, udtrykt som en GFP-fusion (GFP-TrioD1 9) (Figur 2B), men enhver GEF ville arbejde. Proteiner, der binder til BNP-loaded GTPase er sjældnere. Vi har for nylig rapporteret RCC2 som ét sådant protein 7, eller BNP-belastning kan valideres blot som binding til hverken GEF eller effektor.
Outputtet fra forsøget vil være en Western blot, der afbilder de to GFP-mærkede bindingspartnere bundet til GTPase. Ved at anvende en enkelt antistof til påvisning begge proteiner, kan de koncentrationer, hvor tilsvarende mængder af både konkurrenter binder bestemmes og derfor relative affiniteter udledes. I dette eksempel konkurrence mellem propellen domæne i proteinet Rac1-trafficking, er coronin-1C (Rac1-bindende protein A), og Rac1-kompleksdannende protein, RCC2 (Rac1-bindende protein B), påvist (figur 3A). Ved at bruge en konstant volumen af coronin-1C propel (5 pi), og tilføje stigende mængder RCC2, kan vi se fra GFP skamplet, at ligevægten nås ved 1,25-2,5 ul RCC2 (stjerne), hvilket viser, at RCC2 har en stærkere affinitet for Rac1 end coronin-1C. Ved at måle intensiteten af bånd ved hjælp af kvantitative Western blotting og plotte middelværdier for hver competitor kan ligevægtspunktet beregnes nøjagtigt ved at identificere de mængder, hvor kurverne krydser hinanden (figur 3B).
En af de mulige hindringer for en vellykket assay er, hvis de bindende partnere binder til hinanden samt binding til Rac1. I figur 3A + B demonstrerer vi konkurrencen mellem RCC2 og propellen domæne af coronin-1C, snarere end fuld længde coronin-1C. Grunden til at det afkortede coronin er, at coronin-1C også binder RCC2 gennem halen domæne. Når fuld længde coronin-1C titreres mod RCC2, påvises binding af begge proteiner, som følge af ternære kompleksdannelse, frem for konkurrence (figur 3C). Hvis der sker konkurrencen, vil bindingen af ét protein stige, mens de andre falder, og total bundet GFP-fusion vil være konstant. I tilfælde, hvor et ternært kompleks dannes det er nødvendigt at trunkere en af GTPase-protein, således at COMPETkondensatorerne ikke længere interagerer.
Figur 1. Workflow. Skematisk fremstilling af arbejdsgangen til bestemmelse af affiniteten af GTPase proteiner ved hjælp af konkurrencemæssige analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Validering af oprensede proteiner. (A) Oprenset GFP-mærkede Rac1 bindingsproteiner analyseret ved Western blot, probing med anti-GFP at bestemme den relative udbytte af de to proteiner. Denne type udligning under eksperimentet tillader koncentrationen af de to proteiner, der skal justeres, så de passer i bindende eksperiment. (B) GDP, GTPyS og ingen nukleotid-loaded GST-Rac1 blev inkuberet med lysatet fra HEK293T udtrykker GFP-TrioD1 og proteiner detekteret ved at plotte for endogen Pak1 eller overudtrykt GFP-TrioD1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Western blot analyse af relativ proteinbinding. Eksempel udgange fra konkurrencemyndighederne-bindende assays. (A) BNP-loaded Rac1 blev blandet med 5 pi GFP-coronin-1C propel domæne og stigende mængder af GFP-RCC2 blev titreret i. Ved Western blotting bundne proteiner for GFP, er problemer med forskellen påvisning af de to proteiner undgås, og GFP-signalet rapporterer molforholdet mellem de to fusionsproteiner. Stjerner angiver de konkurrencemæssige forhold på eitheR side af ligevægtspunktet. (B) båndintensiteter af bundne GFP fusionsproteiner fra tre uafhængige eksperimenter blev målt ved kvantitativ Western blotting under anvendelse af fluorofor-konjugerede sekundære antistoffer og gennemsnit planlagt at beregne mængden af RCC2 nødvendige for at nå ligevægt. (C ) Eksempel output fra et eksperiment, hvor Rac1-bindende proteiner binder til hinanden og danner et ternært kompleks, i stedet for at konkurrere. BNP-loaded Rac1 blev blandet med 5 pi GFP-RCC2 og stigende mængder af GFP-coronin-1C fuld længde blev titreret i. Stigningen i bundet GFP-coronin-1C uden tab af bundet GFP-RCC2 indikerer ternære kompleksdannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
