A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Investigando organogênese in utero é um processo tecnicamente desafiador em mamíferos placentários, devido à falta de acesso aos reagentes para embriões que se desenvolvem dentro do útero. Um método de cultura ex vivo gota vertical recentemente desenvolvido fornece uma alternativa atractiva para os estudos realizados in utero. O ex vivo cultura gota fornece a capacidade de examinar e manipular interações celulares e diversas vias de sinalização através da utilização de vários compostos de bloqueio e de activação; Além disso, os efeitos de vários reagentes farmacológicos no desenvolvimento de órgãos específicos podem ser estudados sem efeitos secundários indesejados da administração sistémica de fármacos no útero. Em comparação com outros sistemas in vitro, a cultura gotícula não só permite a capacidade para estudar tridimensional morfogénese e interacções célula-célula, a qual não pode ser reproduzida em linhas de células de mamíferos, mas também requer significativamente menos reagents do que outro ex vivo e in vitro. protocolos Este trabalho demonstra adequada do rato fetal e dissecção do órgão técnicas de cultura verticais gota, seguido por imunofluorescência órgão inteiro para demonstrar a eficácia do método. O método ex vivo gota cultura permite a formação de arquitectura órgão comparável ao que se observa in vivo e pode ser utilizado para estudar processos de outro modo difíceis de estudo devido a letalidade embrionária em modelos in vivo. Como um modelo de sistema de aplicação, um inibidor de molécula pequena vai ser utilizado para sondar a função de vascularização na morfogénese testicular. Este ex vivo gota método de cultura é expansível para outros sistemas de órgãos fetais, como pulmão e potencialmente outros, embora cada órgão deve ser extensivamente estudado para determinar quaisquer modificações específicas do órgão para o protocolo. Este sistema de cultura de órgãos proporciona flexibilidade na experimentação de órgãos fetais, e resulta obtained usando esta técnica vai ajudar os pesquisadores a obter insights sobre o desenvolvimento fetal.
Introdução
Regeneração de órgãos in vivo em seres humanos é muito limitada; por conseguinte, a engenharia de tecidos, o desenvolvimento dos tecidos e órgãos individuais de células doadas por um hospedeiro, é cada vez mais atraente uma terapia potencial para a substituição de órgãos. No entanto, para esta estratégia terapêutica para ser bem sucedido, os fatores e interações celulares envolvidos na morfogênese do órgão deve ser cuidadosamente estudado e bem-compreendido. Devido à incapacidade para estudar o desenvolvimento de órgãos específicos com abordagens tradicionais, os investigadores voltaram-se para alternativa embrião inteiro ou culturas de órgãos inteiros. Kala....
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Protocolo
Todos os ratos utilizados nestes estudos eram ratinhos CD-1 obtidos de Charles River Laboratories. Experiências de cultura anteriores foram também realizados em outras estirpes, tais como C57BL / 6J (dados não mostrados), mas qualquer estirpe pode ser utilizada. Fêmeas adultas grávidas foram aproximadamente 2-3 meses de idade e foram sacrificados por meio de inalação de CO2, seguido por deslocação cervical e toracotomia bilateral antes da remoção do embrião. Os ratos foram alojados em conformidade com as diretrizes do NIH, e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Hospital Medical Center de Cincinnati Children animal Ins....
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Resultados
A cultura ex vivo permite que uma gotícula de manipular órgãos inteiros, tais como a gónada, para estudar as interacções celulares e dinâmica. A Figura 1 mostra de uma forma passo a passo como preparar uma cultura E11.5 gonadal gota. Os primeiros passos do protocolo de cultura incluem a remoção inicial do útero contendo embriões de rato a matriz (Figura 1A e 1B). Após a remoção do útero da mãe, a parede uterina é cortado e os embriões são libertados a partir do saco vitelino em.......
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Discussão
Este estudo demonstra todo um método de gotícula ex vivo de órgãos que tem muitas aplicações potenciais para o estudo do desenvolvimento fetal. Esta técnica pode ser usada para vários órgãos, e permite ao investigador para abordar questões biológicas que são difíceis de analisar utilizando abordagens in vivo, devido à inacessibilidade dos embriões e potencial letalidade embrionária. Este método de cultura tem benefícios adicionais em relação às outras abordagens in vitro tais como linhas celul.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores foram apoiados por: uma bolsa de pesquisa CancerFree KIDS, um prêmio March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar (# 5-FY14-32), um prêmio de subsídio de curador do Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC); um prêmio de inovação em pesquisa e financiamento piloto do CCHMC; e fundos de desenvolvimento do CCHMC. Os autores também agradecem ao laboratório Capel pela otimização inicial dessa técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de microscópio Superfrost Plus | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Óculos de cobertura: Quadrados (22 mm x 22 mm, nº 1.5) | Esmalte Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear, invisível | Sally Hansen | ||
| 8 tiras 0,2 ml Tubos de PCR e Tampas planas destacadas | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Fórceps | FST | 91150-20 | |
| Tesoura Fina | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml | Denville | C2170 | |
| Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml | Denville | C2176 | |
| 10 μ l Pontas de Barreira de Precisão SHARP | Denville | P1096FR | |
| 20 μ l Pontas de Barreira de Precisão SHARP | Denville | P1121 | |
| 200 μ l Pontas de Barreira de Precisão SHARP | Denville | P1122 | |
| 1,000 μ l Pontas de barreira de precisão SHARP | Denville | P1126 | |
| Seringa de 1 ml com agulhas de calibre 27 | PrecisionGlide | 309623 | |
| seringa de 10 ml | BD | 305559 | |
| 0,2 μ Filtro de seringa M PES | VWR | 28145-501 | |
| Papel de Filtro Qualitativo Grau 3 Grau Padrão, círculo, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Prato de Cultura de Células Estilo Fácil de Segurar | Falcon/Corning | 353801 Placas de | |
| Petri, Estéril (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubadora | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Armário de Biossegurança | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrífuga | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler com painel de controle | Estereomicroscópio Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 Nikon | SMZ445 | ||
| MultiImage Light Cabinet com Software AlphaEase | Alpha Innotech Corporation | Descontinuado | |
| Absoluto 200 prova Etanol Fisher | BP2818-500 | ||
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Fosfato de sódio (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Fosfato de potássio (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| (KCl) | Cloreto de magnésio Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| (CaCl2) | de | ||
| vida | água livre de nuclease Ambion | AM9938 | |
| Primer PCR XY | IDT | N / A | |
| Ácido Acético Glacial | Fisher | A38-500 | |
| Ácido Etilenodiamina Tetracético (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| Solução de brometo de etídio a 1% | Fisher | BP1302-10 | Agarose |
| Tóxica | GeneMate | E-3120-500 | |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Soluções | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polimerase com 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldeído | Fisher | O4042-500 | Tóxico |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Cloreto de Hidrogênio ( HCl) | Fisher | A144212 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA), pó, Fração V, isolamento de choque térmico | Bioexpress | 0332-100g | |
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS), triplo filtrado 100 nm Fisher | 03-600-511 | Inative o calor antes de usar | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Use a 1:100 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO), Hybri-max, filtrado estéril | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-SOX9 Anticorpo | Millipore | AB5535 | Uso na diluição: 1:4.000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Anticorpo | BD Pharmingen | 553370 | Uso na diluição: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Anticorpo | Sinalização Celular | 9661S | Uso na diluição: 1:250 |
| Rat E-caderina / CDH1 Anticorpo (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Uso na diluição: 1:500 |
| Hoechst 3342, tricloridrato, trihidrato | Invitrogen (Sondas Moleculares) | H1399 | Uso a 2 ug / ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use na diluição: 1: 500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use em diluição: 1:500 |
| Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de burro, conjugado Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31572 | Uso na diluição: 1:500 |
| Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de burro, conjugado Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21206 | Uso na diluição: 1:500 |
| Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) de burro, conjugado Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21208 | Uso na diluição: 1:500 |
| Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de burro, conjugado Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A31573 | Uso na diluição: 1:500 |
Referências
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
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Reimpressões e permissões
