אנו מספקים אסטרטגיה חדשה לבידוד תאי שכפול ויראלי (RC) מתאים אנושיים נגועים באדנו-וירוס (Ad). גישה זו מייצגת מערכת נטולת תאים שיכולה לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את שכפול הגנום הנגיפי וביטויו, כמו גם ויסות האינטראקציות הוויראליות-מארח שהוקמו ב-RC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus
במאמר זה
סיכום
תקציר
במהלך הדבקה של תאים אנושיים על ידי אדנו-וירוס (Ad), גרעין התא המארח מאורגן מחדש באופן דרמטי, מה שמוביל להיווצרות מיקרו-סביבות גרעיניות באמצעות גיוס חלבונים נגיפיים ותאים לאתרים שנכבשו על ידי הגנום הנגיפי. אתרים אלה, הנקראים תאי שכפול (RC), יכולים להיחשב כתחומים גרעיניים המושרים על ידי נגיפים שבהם הגנום הנגיפי ממוקם ומגויסים חלבונים נגיפיים ותאים המשתתפים בשכפול, שעתוק ועיבוד לאחר שעתוק. יתר על כן, חלבונים תאיים המעורבים בתגובה האנטי-ויראלית, כגון חלבונים מדכאי גידול, רכיבי תגובת נזק ל-DNA (DDR) וגורמי תגובה חיסונית מולדים נבחרו גם הם ל-RC. למרות שנראה כי RC ממלא תפקיד מכריע בקידום מחזור שכפול יעיל ופרודוקטיבי, לא נעשה ניתוח מפורט של הרכבם והפעילויות הנלוות אליו. כדי להקל על המחקר של אדנו-ויראלי RC ואולי אלה מנגיפי DNA אחרים המשכפלים בגרעין התא, התאמנו הליך פשוט המבוסס על שיפועי מהירות כדי לבודד Ad RC והקמנו מערכת נטולת תאים המתאימה לביצוע מחקרים מורפולוגיים, פונקציונליים וקומפוזיציוניים של מבנים תת-גרעיניים אלה המושרים על ידי נגיף, כמו גם לחקור את השפעתם על אינטראקציות בין תא מארח.
מבוא
Adenoviruses מכיל הגנום גדילי דנ"א כפול שמשכפל בגרעין התא הנגוע. כאשר ה- DNA הנגיפי נכנס לגרעין, זה localizes סמוך לגופים גרעיניים PML 1. בעקבות ביטוי גנים נגיפי מוקדם, הארכיטקטורה הגרעינית היא מחדש באופן דרמטי, וישכנע היווצרות של מייקרו-סביבות נגיפיות, המכונה תאים לנגיפיים שכפול (RC) 2. מאז אדנווירוס RC (מודעות) הם אתרים שבם שכפול הגנום נגיפי וביטוי של גנים נגיפיים מאוחר יתקיימו, הם מספקים סביבה לגיוס של כל הגורמים הנגיפיים וסלולריים הצורך המשתתפים בתהליכים אלה. מעניין, מגוון רחב של חלבונים תאיים אחראים לתגובה אנטי הסלולרית, כגון תגובת הנזק לדנ"א, התגובה החיסונית המולדת ודיכוי גידול הם לאתרים הנגיפיים אלה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
תרבית תאי 1. HFF ומודעות-זיהום
- הפץ וירוס Ad5 WT בmonolayers של HEK-293 תאים וכיילו כיחידות ניאון יוצרים (FFU) בתאי HFF כפי שתואר לעיל 8.
- לגדול fibroblasts העורלה האדם (HFF) ב 10 מיליליטר של DMEM 10% שור עוברי סרום (FBS) במנות מ"מ סטרילי תרבות 100 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO / 2 בחממה humidified. לקבוע את המספר הסלולרי באמצעות תא נויבאואר על ידי ספירת תאים בארבעת סטים של 16 מ"ר. מספר התאים למ"ל מתקבל על ידי חישוב מספר התאים הממוצע בארבעת סטים של 16 מ"ר והכפלת מספר זה ב -....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מאז תאים נגיפיים שכפול (RC) הם מבנים הנוצרים על-נגיפיים subnuclear המורכב מחלבונים וחומצות גרעין, בדומה לתחומים אחרים גרעיניים, הם הוכיחו שניתנים לבידוד על ידי מילויים מהירות המבוססים על תכונות ביוכימיות. צעדים קריטיים בפרוטוקול חלוקה הם באיור 1. בכל שלב הדגימות צריכים להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר כדי להבטיח את השלמות של שברי משנה הסלולר השונים. לדוגמא, כאשר נפיחות התאים, זמן דגירה במאגר hypotonic צריך להיות אחיד כדי להתנפח ציטופלסמה הימנעות נזק לגרעינים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
על מנת להבהיר את המנגנונים המולקולריים השולטים בוויסות הפעילות התאית על ידי זיהום נגיפי, הבנת ההרכב והפעילויות הקשורות ל-RC תהיה אינסטרומנטלית. לכן, כדי לבצע ניתוח מפורט של RC, הקמנו מערכת נטולת תאים המנצלת את הגודל וההרכב הביוכימי של מבנים אלה המושרים על ידי וירוסים, כדי לבודד שברים תת-גרעיניים מועשרים ב-RC באמצעות הליך פשוט המסתמך על שיפועי מהירות עם כריות סוכרוז. השלבים הקריטיים של ההליך הדורשים סטנדרטיזציה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש הם: 1) סטנדרטיזציה של הזמנים המשמשים לנפיחות תאים כדי למנוע שיבוש של גרעינים; ii) ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) ו-Promep-SEP עבור R.A.G.; P.H. קיבל מלגה מ-CONACyT (447442).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 12100-046 | חם ב 37 &; אמבט מים C לפני השימוש |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 12484-028 | |
| סוכרוז, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | הכינו תמיסת מלאי של 2.55 M ואחסנו ב-4 º C |
| Dounce הומוגנייזר | חברת זכוכית קונטס | 884900-0000 | |
| ברנסון 1800 אמבט אולטרסאונד | ברנסון | Z769533 SIGMA | יש להפעיל 15 דקות לפני השימוש. |
| נוגדן משני IgG1 נגד עכבר עזים, Alexa Fluor 488 מצומד | Life Technologies | A-21121 | השתמש בדילול של 1:2,000 בשקופיות PBS |
| Silane-Prep | Sigma | S4651-72EA | פתוח בארון זרימה למינרי |
| SuperSignal West Pico מצע כימילומינסנט | Pierce ThermoScientific | 34080 |
מקורות
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-142....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
