Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53313

⸱

4 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Авторы представляют протокол сбора свиных салфеток для носа для обнаружения и изоляции вирусов гриппа А.

Аннотация

Надзор за вирусов гриппа А свиней имеет решающее значение для здоровья человека и животных, потому что вирус гриппа А быстро развивается в свиней населения и новые штаммы постоянно появляются. Свиной могут быть заражены различными линий вируса гриппа A делая их важных узлов для возникновения и поддержания нового вируса гриппа штаммов. Отбор проб свиней в различных условиях, таких как коммерческие свинофермах, сельскохозяйственных ярмарок и рынков живой животных важно обеспечить полное представление о циркулирующих в настоящее время штаммов IAV. В настоящее время прижизненной техника выборки золотой стандарт (т.е. сбор носовых мазков) является трудоемким, потому что это требует физического сдержанность свиней. Носовые салфетки включают потирая кусок ткани через морде свиньи с минимальной до не ограничением животного. Носовая протрите Процедура проста для выполнения и не требует персонала с профессиональной ветеринарии или подготовки обработки животных. Втотя чуть менее чувствительны, чем носовых мазков, обнаружение вирусов и изоляции ставки являются адекватными для правильного носового салфетки жизнеспособную альтернативу для отбора проб отдельных свиней, когда методы отбора проб с низким стресс требуется. Протокол исходя излагаются шаги, необходимые для сбора жизнеспособной носовой стереть с индивидуальной свиньи.

Введение

Вирусы гриппа (IAV) вызывают респираторные заболевания у многих видов, в том числе домашних птиц, свиней и человека. Благодаря рекомбинации сегментированного генома ИФО быстрого вирусного эволюции может произойти и новых штаммов ИФО часто появляться. Свиной являются виды, которые могут служить в качестве емкости для смешивания для реассортации IAVS из нескольких видов хозяев. 1 Есть в настоящее время три основных подтипа IAV обычно циркулирующие среди североамериканских свиней (H1N1, H1N2, H3N2), но несколько введений IAV от человека имеют привело к широкому разнообразию IAV в этих подтипов. 2 Быстрое развитие IAVS поражающих свиней была очевидна с 1998 года, когда тройка реассортант ИФО, содержащий сегменты гена от человека, птиц и свиней вирусы 3 получил широкое распространение среди свиней в США. 4 Внутренний ген сегменты из этой тройной реассортантного IAV остаются весьма распространена среди IAVS настоящее время поражающих свиней. 5

"> Во всем мире, ИФО является существенной причиной респираторных заболеваний у свиней, в которой типичные клинические признаки включают лихорадку, анорексию, вялость, кашель, затрудненное дыхание, чихание, выделения из носа и плохой набор веса. ИФО может быть особенно дорого, чтобы посеять фермы, где репродуктивного недостаточность вследствие IAV индуцированной лихорадкой и слабых поросят, родившихся были задокументированы. 6,7 В Соединенных Штатах, ИФО обычно обнаруживается в коммерческих свиного стада и обширной антигенной и геномной разнообразия и непрерывной эволюции среди IAV заражения свиней препятствует контроль это Вирус 8-11.

Общественные проблемы со здоровьем по поводу возникновения пандемического штамма IAV результате рекомбинации у свиней были реализованы в 2009 году, когда свинья-линия ИФО, содержащий сегменты гена от тройной реассортант Северной Америки свиного происхождения и Евразийского птичьего как свиной родословной вызвало всемирную пандемию в людях. 12 пандемический вирус (A (H1N1) pdm09) с тех порreassorted эндемическим свиней штаммов ИФО 13,14, и некоторые из этих новых штаммов reassorted были переданы обратно в человека. 15 Частота рекомбинации событий и появления новых штаммов ИФО с пандемическим потенциалом делает активное наблюдение циркулирующих вирусов IAV свиней императивного, особенно на границе свиного человеку.

Интерфейс свиного человека имеет важное значение для двунаправленной передачи межвидовой IAV. Человека к свиного передачи, происходящих в коммерческой свиноводстве несет ответственность за большого количества IAV разнообразия в настоящее время в популяции свиней. Сельскохозяйственные ярмарки являются крупнейшие настройки для comingling людей и свиней в Соединенных Штатах и, как известно, участки для передачи зоонозных IAV. 15-21 в 2012 году, во время вспышки вариант H3N2 IAV, 93% случаев сообщили посещаемость сельскохозяйственной ярмарке в дни до начала заболевания. 15 геномный анализвирусных изолятов из выставочных свиней по сравнению с человека изолятов подтвердил зоонозных передачу. 21 выставочного свиней, инфицированных IAV часто не показывают клинические признаки болезни, 21-23, указывающие на необходимость прямых диагностических тестов.

Отбор больных заметно свиней в одиночку не будет успешно идентифицировать распространенность ИФО в свиней и не могут полагаться на выявление новых штаммов IAV возникающих среди свиней. Активное наблюдение является абсолютно необходимым для выявления возникающих деформаций IAV в свиней, и оценки их опасности для обоих свиней и общественного здоровья. Большинство мероприятий по надзору IAV являются добровольными и поэтому минимально разрушительные методы необходимы. Три основные процедуры сбора пробы до наступления смерти для ИФО заражения свиней являются: носовые тампоны, оральные жидкости и носовые салфетки. Текущие рекомендации для отбора проб индивидуальный свиней, чтобы обнаружить списку ИФО вставку синтетического волокна тампоны в ноздри, как предпочтительного методасобрать выделения из носа и эпителиальные клетки. 24,25 Поскольку свиньи могут попытаться избежать этой процедуры, команда обученного персонала должны сдерживать свиней либо вручную, либо с сетью в зависимости от размера животного. 26 Процесс сдержанность является трудоемким для персонал, и стресс для свиней. Кроме того, выставка свиней часто участвуют в различных соревнованиях на ярмарке, так что восприятие добавленного напряжения на конкурсной животного может сделать владельцы устойчивы к усилиям наблюдения.

С вероятностью обнаружения IAV, начиная от 80-100% в IAV зараженные стада, устные жидкости стали популярной альтернативой носовой мазки для молекулярной обнаружения IAV в популяциях свиней. 27,28 Кроме того, оральные жидкости могут обеспечить более широкий окно Обнаружение ИФО, чем носовых мазков после заражения. Тем не менее, изоляция ИФО из устных жидкостей было проблематичным с только 50% попыток выделения вируса в результате И.А.В восстановление. 29

Использование носовые салфетки вместо носовых мазков во время IAV надзора в свиней преодолевает ограничения, описанные выше. Носовые салфетки не требуют использования удерживающего петлю и могут быть выполнены, не подчеркивая животных или свидетелей в порядке. Минимальная техническая подготовка нужна, чтобы собрать носовые салфетки, что позволяет без ветеринарных специалистов, в том числе владельцев свиней, чтобы собрать образцы наблюдения. Носовые салфетки ранее сравнению с носовых мазков для обнаружения и выделения вируса гриппа А 30 и Подробный протокол этого неинвазивного способа дискретизации описано ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все свиньи используются в коллекции следующих данных были под защитой Комитета Институциональная животных уходу и использованию Университета штата Огайо (животное использование номер протокола 2009A0134-R1).

1. Подготовка вирусной транспортной среде и сбору проб Флаконы

  1. Добавить 37 г сердечно-мозговым экстрактом 900 мл очищенной воды и тщательно перемешать с мешалкой и магнитной мешалкой при нагревании до 70 ° С до полного растворения порошка.
  2. Автоклав бульон при 121 ° С в течение 15 мин. Прохладный на скамейке верхней до бульона достигнет комнатной температуры. Охлаждают при 4 ° С в течение ночи, если это необходимо.
  3. Растворить, путем смешивания со магнитной мешалки, 6,02 г пенициллин G натриевой соли и 10 г стрептомицина сульфата в 50 мл очищенной воды при комнатной температуре. Добавление дополнительных очищенной воды с доведением общего объема до 100 мл. Фильтр решение через мембрану 0,22 полиэфирсульфона мкм в стерильный флакон,
  4. Соблюдая правила асептики, добавьте отфильтрованный пенициллин и стрептомицин решение в охлажденный Brain Heart Infusion Broth и тщательно перемешать мешалкой (или закружить колбу вручную), чтобы сделать вирусный транспортную среду.
  5. Консерванта проверить рН вирусной транспортной среде; при необходимости, доведения рН до 7,4 ± 0,2, используя HCl или NaOH.
  6. Выполните контроль качества обеспечения по вирусной транспортной среды тестирования на грипп A матрицу белок вируса от рОТ-ПЦР, как описано Zhang и Хармон. 22
  7. Разлить по 5 мл в вирусной транспортной среде в стерильные полиэтилена высокой плотности бутылки вместимостью 8 мл. Этикетка флаконы для использования в полевых условиях.
  8. Хранить готовые к использованию флаконов в стандартных крио-боксов при -20 ° С до сбора образца.

2. Сбор носовой салфетки от свиного

  1. Оттепель соответствующее количество флаконов непосредственно перед образец коллекции; один флакон будут необходимы на свинью пробы. Размораживание при комнатнойТемпература занимает примерно 30-45 мин. Держите размороженные флаконы не охлаждаться на льдом до использования.
  2. Дон соответствующими средствами индивидуальной защиты в зависимости от характера ситуации (например, комбинезон, бахилы респиратор, беруши и т.д.).
  3. Введите область животных. При необходимости, не ограничиться свинью небольшой площади но не сдерживать. Не поднять отдыхает животных.
  4. Наденьте одноразовые перчатки экзамена. Позаботьтесь, чтобы не загрязнить перчатки, касаясь свиней, людей, или неодушевленных предметов.
  5. Используйте руку в перчатке, чтобы удалить стерильные 5,08 см × 5,08 см (2 в. × 2 в.) Хлопок марлевый тампон из упаковки. Стерильные марлевые прокладки следует использовать всякий раз, когда это возможно. Индивидуально обернутые марлевые прокладки удобнее в использовании, чем те, завернутые с двумя марлевыми подушечками на упаковке.
  6. Держите хлопок марлевый тампон с кончики пальцев одной руки подвергая столько площадку как можно для отбора проб.
  7. Протрите через марлевый тампон морде свиньи, принимаядополнительная забота, чтобы войти внешних ноздри, если это возможно. Соберите видимые выделения из носа (примерно 1 мл) с той же марлевым тампоном.
  8. Используя ту же руку, сложите марлевым тампоном на себя, чтобы облегчить размещение в пробирку, содержащую вирусную транспортную среду.
  9. Использование другой стороны, снимите крышку из флакона и поместите сложенную марлевую прокладку в пробирке. Напомним флакон и встряхнуть флакон, чтобы обеспечить перемешивание марлевой подушечкой и вирусной транспортной среде.
  10. Снимите перчатки и место в соответствующую емкость. Изменить перчатки между каждой свиньи.
  11. Убедитесь, флакон идентификатор. Запись идентификации свиней количество, возраст, пол, клинические признаки, и другие замечания будут сочтены необходимыми следователя.
  12. Охладите образцы сразу после сбора. Рассмотреть вопрос аликвот образца до замораживания, чтобы предотвратить многократные циклы замораживания-оттаивания. Как можно скорее после сбора, разместить образцы на сухом льду для транспортировки в лабораторию. Хранить при -80 флаконов° C до испытания не инициируется.

3. Обнаружение Вирус гриппа А нуклеиновых кислот

  1. Оттепель образцы в 37 ° С по сухому борта бане в течение 5 мин, а затем закончить оттаивания образцов на скамейке верхней при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Одновременное добавление нескольких ампул с шариками вызовет ванны для нагрева; следует проявлять осторожность, чтобы не перегреть флаконов.
  2. Удалить 100 мкл вирусной транспортной среде для выделения РНК.
    1. Использование высокой пропускной (96-луночный планшет формата) магнитного бисера платформы для извлечения РНК из большого количества образцов. 31
  3. Используйте в режиме реального времени обратной транскриптазы ПЦР для быстрого обнаружения гриппа вирус. 31

4. Выделение Вирус гриппа А носовые салфетки из

  1. Растаяйте образцы, как описано выше в разделе 3.1
  2. Лечить размороженные образцы с сульфатом гентамицина (1000мкг / мл), амфотерицин В (22,5 мкг / мл), и сульфата канамицина (325 мкг / мл).
  3. Посев в Madin Darby-почки собаки (MDCK) эпителиальные клетки, как описано выше. 32

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное применение этого метода дает рОТ-ПЦР результаты, которые, в сопровождении с использованием внутреннего контроля во время экстракции РНК и ПЦР-рОТ, шоу образцы не содержат ингибиторы ПЦР с любого экологического мусора подобрал во время отбора проб. После прививки образца, выделение вируса скважин должны быть свободны от видимой окружающей среды мусора из образца. Существует разумное согласие между результатами рОТ-ПЦР и результатов выделения вируса с пониманием, что ПЦР часто дает более высокую скорость ИФО поло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сбор образцов из свиней с использованием полиэфирных наконечником носовые тампоны оказался полезным в проведении ИФО наблюдение; Однако, использование процедуры носовой тампон препятствует усилиям наблюдения из-за необходимости использования сети для пресечения. Носовые салфетки представляют собой уточнение современных методов отбора проб свиной, чтобы минимизировать нагрузку на людей и свиней во время сбора образца. Хотя метод был разработан для и утверждена в настройках выставка свиней, она может быть легко применятьс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована за счет федеральных средств от Центров передового опыта по исследованию и надзору за гриппом (CEIRS), Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения, Министерства здравоохранения и социальных служб, в соответствии с контрактом No. HHSN272201400006C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BBL Brain Heart InfusionBecton, Dickinson and Company211059
Пенициллин G Натриевая сольMP Biomedicals, LLC0211945371500 ед/мг
стрептомицина сульфатаAMRESCO LLC0382
Gentamicin SolutionMediatech, Inc.30-005-CR50 мг/мл
раствор амфотерицина BFisherS 2425 250 мкг/мл
Канамицина сульфатTeknovaK21055000 мкг/мл
TPP Rapid Filtermax SystemTPP Techno Plastic Products AG 99150
Диагностические флаконы NalgenThermo Scientific342002-9025HDPE с белой крышкой из полипропилена
Марлевая губка для дермацеи, 8 слоевCovidien4412115,08 см и 5,08 см (2 дюйма × 2 дюйма)  
Нитриловые смотровые перчаткиSaftey Choice19-170-010 (A-D)

Ссылки

  1. Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications. J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).
  2. Nelson, M. I., Vincent, A. L. Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface. Trends Microbiol. 23, (2015).
  3. Zhou, N. N., et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).
  4. Webby, R. J., et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).
  5. Vincent, A., et al. Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research. Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).
  6. Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).
  7. Zhou, N. N., et al. Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs. Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).
  8. Corzo, C. A., et al. Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).
  9. Lorusso, A., et al. Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008. J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).
  10. Loving, C. L., et al. Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v. J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).
  11. Vincent, A. L., et al. Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs. Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).
  12. Smith, G. J., et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).
  13. Vijaykrishna, D., et al. Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine. Science. 328 (5985), 1529(2010).
  14. Ducatez, M. F., et al. Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).
  15. Jhung, M. A., et al. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States. Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).
  16. Vincent, A. L., et al. Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States. Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).
  17. Killian, M. L., et al. Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair. Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).
  18. Wong, K. K., et al. Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).
  19. Bowman, A. S., et al. Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012. Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33(2012).
  20. Wells, D. L., et al. Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission. JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).
  21. Bowman, A. S., et al. Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012. Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).
  22. Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).
  23. Gray, G. C., et al. Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).
  24. Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W. Ch. 40, Influenza virus. Diseases of Swine. Zimmerman, J. J. , Wiley-Blackwell. 557-571 (2012).
  25. Culhane, M. R., Detmer, S. E. Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine. Methods in Molecular Biology. Spackman, E. Animal Influenza Virus, Methods in Molecular Biology; 1161. 259-263 (2014).
  26. Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. Animal Restraint for Veterinary Professionals. , Mosby. (2006).
  27. Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples. J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).
  28. Goodell, C. K., et al. Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time. Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).
  29. Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs. Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).
  30. Edwards, J. L., et al. Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations. Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).
  31. Zhang, J., Harmon, K. M. Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 277-293 (2014).
  32. Zhang, J., Gauger, P. C. Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 265-276 (2014).
  33. Bowman, A. S., et al. The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature. Zoonoses Public Health. , (2015).
  34. Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).
  35. Prickett, J., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).
  36. Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. Collection of oral fluid from individually housed sows. J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эпизоотический надзор за свиньямисбор образцовбульон BHIраствор антибиотикатранспортировка вирусовмарлевая салфетканизкий уровень стресса
Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.