Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Summary

Мы подробно описываем протокол мониторинга поведения нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных венах в равновесных и воспалительных условиях с использованием прижизненной конфокальной микроскопии на мышах под наркозом.

Abstract

Эффективное иммунный ответ зависит от быстрой мобилизации лейкоцитов крови к месту инфекции или травмы. Исследуя миграцию лейкоцитов в естественных условиях имеет решающее значение для понимания молекулярной основы лейкоцитов трансэндотелиальной миграции и взаимодействия с сосудистого эндотелия. Один мощный подход предполагает прижизненный микроскопии на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес.

Здесь мы приводим протокол для визуализации моноцитов и нейтрофилов в CX ₃ CR1 ^{GFP / мас} мыши IV введенного с оранжевыми красителя помечены нейтрофилов с инверсной конфокальной микроскопии. Покадровой фильмы собрались от 30 мин до нескольких часов визуализации позволяют анализировать поведение лейкоцитов в брыжеечных вен под обеих стационарных и воспалительных состояний. Мы также описать шаги, чтобы побудить локально судно воспаление крови с TLR2 / TLR1 агониста Pam3SK4 и контролировать subsequeнт набор нейтрофилов и моноцитов.

Представленная методика может также использоваться для мониторинга других популяций лейкоцитов и исследовать молекулы, замешанных в лейкоцитов или торговли, используя другие стимулы или трансгенных мышей.

Introduction

Нейтрофилов и моноцитов в клетки врожденной иммунной системы, которые непрерывно циркулируют в крови. После травмы или инфекции, воспалительные сигналы вызывают лейкоцитов диапедез в поврежденные и инфицированные ткани, в данном инициирования клеточного иммунного ответа ^1-3. Быстрота мобилизации лейкоцитов определяет положительный результат иммунных реакций. Эти сложные процессы зависят от специфических молекул (например, Селектины, эндотелий-хемокинов связаны), присутствующих на воспаленной эндотелия, которые помогают для создания липких контактов между циркулирующих лейкоцитов и эндотелия ^1-3 .Чтобы получить представление о моле....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были проведены в соответствии с институциональной Комитетом по этике уходу за животными в Женеве, Швейцарии и кантона ветеринарии. Номер разрешения GE / 63/14.

1. Подготовка Единой клеточной суспензии из костного мозга

1. Жертва мыши (8-12 недель) путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать задние ноги с 70% этанола. Удалить кожу от задних ног.
2. Рассеките из бедра мыши и большеберцовые кости и удалить ткань с ног с помощью скальпеля. Промыть ноги с 90% -ным этанолом и поместить в культуральную чашку, наполненную PBS.
3. Под капот культуры, чистой ткани из бедра и большеберцовые кос....

Results

Рукопись описывает оптимизированный протокол легко контролировать поведение моноцитов и нейтрофилов в брыжеечных вен наркозом мышей в режиме реального времени. Использование 37 ° C-термостатированный камеры является обязательным для поддержания температуры мыши, а также из-за зависящей от температуры движения лейкоцитов. Подготовка мыши отображается на рисунке 1. Рисунок 2 показывает всю площадь видел под микроскопом. Проходящий свет позволяет идентифицировать брыжеечных вен (красная ст.......

Discussion

Методологии, описанные в этой рукописи обеспечить последовательный подход, чтобы эффективно изучить моноцитов и нейтрофилов в поведение брыжеечных вен в стационарных и воспалительных состояний.

Решающим шагом в подготовке является иммобилизация кишечника с PBS, контактирующих с тканями. Если выполнены должным образом, мезентериальных сосудов красиво выставлены на покровное для получения изображения. Это позволяет выбрать из нескольких областях, представляющих интерес для мониторинга поведени.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 мл трубки из полистирола с круглым дном	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45    DT:4mm	Nikon
20x CFI план Apochromat VC 0.75 DT:1мм	Трекер для клеток Nikon
Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Погружное масло типа А	Nikon		любое вязкое масло
Life Box Система контроля температуры	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R конфокальный микроскоп	Nikon	A1R	, инвертированный микроскоп, моторизованный x/y/z столик, элементы NIS программное обеспечение
PBS	Life Technologies	D8537
фенол красный свободный DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	любая феноловая красная свободная среда подходит
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	restatus in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		включен в набор EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Чашка для культуры тканей 100	TPP	93100