פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטרה של פרוטוקול זה היא ללמוד המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב intraepidermal. לכן, פותחו טכניקות הדמיה וניתוח 3D לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה ולהעריך הנוצרות על-ידי מחלת שינויים של המיטוכונדריה בקצה הדיסטלי של העצבים החישה. הפרוטוקול משלב אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות ניתוח תמונה תלת-ממדית כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. פרמטרים מפורטים מוגדרים לכל אורך ההליכים על מנת לספק דוגמה מוחשית כיצד להשתמש הטכניקות הללו כדי לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה. נוגדנים שימשו כדי לתייג עצב, אותות מיטוכונדריאלי בתוך מקטעי רקמת העור אגרוף ביופסיות, אשר בעקבות immunofluorescence עקיף כדי להמחיש את העצבים ואת המיטוכונדריה עם אות ניאון אדום וירוק בהתאמה. Z-סדרת תמונות נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, נעשה שימוש בתוכנות ניתוח תלת-ממד כדי לעבד ולנתח את האותות. אין צורך לעקוב אחר הפרמטרים המדויק תיאר בתוך, אבל חשוב להיות עקביים עם אלה שנבחרו לאורך מכתים, צעדים analysis של רכישת. הכוח של פרוטוקול זה היא שזה ישים למגוון רחב של נסיבות שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד אחרים אותות שאחרת היה בלתי אפשרי ללמוד לבד.
מבוא
המיטוכונדריה לשרת פונקציות הסלולר חיוניים הכוללים הפקת אנרגיה בתא, מאגרי סידן, ועל ויסות נמק ו מוות תא מוות1,2,3. למערכת העצבים יש שיעור חילוף החומרים גבוה לעומת גוף4 רומז כי נוירונים לייצר רמה גבוהה של האנרגיה התאית בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך נשימה מיטוכונדריאלי. הרבה מסמכים ראיות כי פונקציות עצביים תלויות ב- ATP5, במיוחד בזמן הסינפסות6. לכן, ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך הנוירונים הוא חשוב.
במהלך 10 השנים האחרונות שהרבה מידע הראה ש של סחר בבני אדם, עגינה של המיטוכונד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נושאים גויסו מרשת טיפול ראשוני בקהילה גדולה במרכז לסוכרת אוניברסיטת יוטה (סולט לייק סיטי, יוטה), ביופסיות ניקוב עור התקבלו. מחקר זה היה אושרו על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים באוניברסיטת מישיגן, פעלו לפי עקרונות הצהרת הלסינקי. נכתב מדעת היה המתקבלים לכל נושא לפני בדיקות.
1. קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה
- הכן ביופסיות אגרוף עבור אימונוהיסטוכימיה סיבי עצב intraepidermal:
- עור 3 מ מ לבצע ביופסיות מאת רפואי צוות ולמקם את הביופסיה כל 1.5 mL זמבוני ' s מקבע פתרון (2% paraformaldehyde, חומצה picric 0.3% רווי buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את דגימות עם פתר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ויזואליזציה, כימות של המיטוכונדריה בתוך IENFs אנושי
קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה מאפשר תיוג סימולטני של אותות מרובים בתוך ביופסיות העור האנושי לדמיין העצבים המיטוכונדריה, גרעינים. צלחת 96-ובכן הוא דרך נוחה כדי לארגן את השלבים שבהליך אימונוהיסטוכימיה. איור 1 מראה כי חשבונות תצורה זו עבור עד 8 סעיפים להיות מעובד דרך השלבים 12 של פתרונות. השיטה לתרשים משולב עם עצבנות עדין עם כיס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה תוכנן כדי לבודד, לכמת ולנתח את גודל ואת ההפצה של המיטוכונדריה עצבים ספציפיים בתוך IENFs תלת-ממד של ביופסיות העור האנושי. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות לתרשים נועד להכתים וניתוח אותות מרובים בכל מדגם, מתן מתודולוגיה תכליתיות עבור מחקר לקטעים44,45. הליך זה מאפשר חדירה של הנוגדנים לתוך הרקמה על מנת למקסם את רכישת תמונות לאורך כל המקטע 50 מיקרומטר, אשר יש צורך לרכוש תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תלת-ממד. עוד צעד קרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי עניינים להכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08 NS061039-01A2, תוכנית למחקר נוירולוגיה & גילוי, א אלפרד טאובמן רפואי מכון המחקר של אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו נעשה שימוש של מורפולוגיה הליבה ניתוח תמונה של מרכז מחקר סוכרת מישיגן, הממומן על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 90 P 5 DK-20572 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה. המחברים רוצה להודות ג'י רובינסון סינגלטון ו א גורדון סמית ' (אוניברסיטת יוטה) לתרומה הנדיבה שלהם של דגימות העור האנושי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2% היצע החדשים הקבוע של זמבוני | , מידלטון, ויסקונסין | 1459A | 2% פרפורמלדהיד, 0.2% חומצה פיקרית רוויה בתמיסת מלח בופר פוספט (PBS), pH 7.4 |
| 10x מי מלח בופר פוספט (PBS) | פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה | BP399-4 | כדי להרכיב 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס | I36933 | משפר את אותות הצבע של Alexa Fluor על ידי הפחתת מוצר גן אנטי-חלבון מחייב לא ספציפי |
| 9.5 נוגדן (ארנב פוליקלונלי) | Proteintech Group Inc. רוזמונט, אילינוי | 14730-1-AP | מקוצר כ-PGP9.5, מחליף את AbD Serotec שהופסק (Cat. מס' 7863-0504) נוגדן |
| נגד פירובט דהידרוגנאז E2/E3bp נוגדן (עכבר מונוקלונלי) | abcam, קיימברידג', MA | ab110333 | בקיצור PDH |
| עז נגד עכבר נוגדן משני Alexa Fluor 594 מצומד | ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס | A-11034 | משני מצומד פלואורסצנטי |
| אדום עז נגד ארנב נוגדן משני Alexa Fluor 488 מצומד | ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס | A-11032 | נוגדן משני מצומד ירוק-פלואורסצנטי |
| אלבומין, מסרום בקר | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO | A7906-100 | בקיצור BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO | T9284 | בקיצור TX-100 |
| 0.22 ומיקרו; m פילטר | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 ומיקרו; m מסנן Millipore |
| Parafilm M | Fisher Scientific, פיטסבורג, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| לולאה לא מכוילת | פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, PA | 22-032092 | לולאת חיסון מאת Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | צלחת תחתונה שטוחה 96 בארות |
| Prolong Gold antifade Reagent עם DAPI | ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס | P-36931 | DAPI מכתים של גרעינים |
| מיקרוסקופ כיסוי זכוכית 50 x 24 מ"מ | פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, PA | 12-550-15 | מיקרוסקופ שקופיות |
| Leica SP5 סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica Microsystems, באפלו גרוב, IL | SP5 | מיקרוסקופ קונפוקלי |
| Volocity x64 תוכנה | Perkin Elmer, Waltham , MA | גרסה 4.4.0 | תוכנת Volocity משמשת לשלבים 3.1 ו-3.2 בפרוטוקול לעיבוד תמונה |
| Imaris x64 תוכנת ניתוח תלת מימדי | Bitplane, Concord, MA | גרסה 7.7.1 | תוכנת Imaris משמשת לשלבים 3.3 עד 3.5 בפרוטוקול לניתוח תמונות |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | תוכנת גיליון אלקטרוני של Excel משמשת לשלב 3.6 בפרוטוקול לסיכום תכונות מורפומטריות |
| תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | בקיצור OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat לחיתוך 50 ומיקרו; m חלקים |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס | C10600 | משמש כבקרה פוזיטיבית לתיוג מיטוכונדריה עם אות פלואורסצנטי ירוק |
מקורות
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
