Introduction
הכניסה של וירוס שפעת (IAV) היא תהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של הווירוס לקולטנים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 1. קולט לIAV הוא חומצת sialic אשר קיים במגוון גדול של גליקופרוטאינים וglycolipids. חלבון hemagglutinin (HA) של IAV אשר שוהה במעטפת הנגיפית נקשר לחומצת sialic ובכך מתווך קובץ מצורף של החלקיקים הנגיפיים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 2. הווירוס נכנס לתאים באמצעות אנדוציטוזה תיווך clathrin אלא גם מסלולי כניסה חלופיים, כגון macropinocytosis, תוארו 3-6. האינטראקציה בין HA וחומצת sialic נראית מספיק לתיווך שניהם, מצורף ומפעיל הפנמה של חלקיקים נגיפיים 7. עם זאת, קולטני כניסה חלופית הוצעו ותפקידיהם בכניסת IAV כרגע נחקרים 1,8,9.
כֶּלֶבrently, נעשים מאמצים לזהות גורמי מארח שמעורבים במחזור החיים של הנגיף במטרה לפתח טיפולים אנטי רומן צורך דחוף 10-12. כניסת וירוס תהיה צעד חיובי עבור מיקוד צמיחת IAV כדי לחסום זיהום ויראלי בשלב המוקדם ביותר שלה. מדידת שלבים שונים של כניסת IAV ניסוי היא מאתגרת כמו כמויות גדולות של וירוס בדרך כלל נדרשות לזהות את הווירוס הנכנס. בנוסף, טווח גילוי לשינויים בכניסת וירוס הוא ליניארי רק בשל חוסר השכפול נגיפי. זה מדגיש את הצורך במבחנים עם רגישות גבוהה.
Assay אנו מציגים כאן מאפשר זיהוי של וירוס מצורף על פני השטח של התאים, כמו גם זיהוי של וירוס הפנים ביחס לסכום הכולל של הווירוס הקשורים תא. השימוש בוירוס wildtype biotinylated מאפשר מדידה נוחה באמצעות צביעה עם STV-Cy3 וreadout ידי cytometry זרימה. וירוס Biotinylated קר-קשור לתאים כדי לאפשר מצורף אבל למנוע הפנמה של חלקיקים נגיפיים. יכולים להיות קבועים תאים, permeabilized ומוכתמים בSTV-Cy3 למדוד וירוס מצורף. האות מvirions תאית, מצורף יכולה להיות מבוטלת אם צעד חסימה מיושם לפני הקיבעון שבו התאים הודגרו עם streptavidin ללא כותרת (STV). בשלב הבא, לאחר התקשרות של IAV biotinylated, טמפרטורה מוסטת עד 37 מעלות צלזיוס והפנמה של חלקיקים נגיפיים מותר לקחת מקום. חלקיקים הפנימו מוגנים מכריכה של STV ובכך מאפשר האפליה בין וירוסים שמחוץ ולתאיים.
לתנאי ניסוי, ארבע דגימות נדרשות: 'דק' 0 ': המדגם הראשון, שכותרתו' דק '0', הוא למדוד וירוס הנכנס קר על פני התא. 'דק' 0 + STV ': המדגם השני, שכותרתו' דק '0 + STV', נותן את עוצמת האות הבסיסית של הניסוי. וירוס מצורף חסום שנינותSTV שעות והצביעה הבא האות עם STV-Cy3 צריך להיות נמוכים בהרבה בהשוואה למדגם '0 דקות'. '30 דקות ': המדגם השלישי, '30 דקות' מכילה מצורפים והפנימו וירוס עקב שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. '30 דקות + STV ': המדגם הרביעי, '30 דקות + STV' צעדי החלק תאיים של וירוסים. צעד חסימת STV מיושם לאחר תקופת הדגירה 30 דקות. כתוצאה מכך, חלקיקים נגיפיים בתא השטח כפופים STV עוזבים וירוסים רק הפנימו זמינים לצביעה עם STV-Cy3. הכמות היחסית של וירוס הפנים ניתן מחושבת כיחס של וירוס הפנים (נמדד בדקות '30 + STV 'המדגם) מחולק בסכום הכולל של וירוס (שתואר על ידי '30 דקות' לדוגמא).
כפקדים אנו מציעים לכלול תאים נגועים מדומים. האות הבאה מכתים STV-Cy3 של תאים נגועים מדומים נותנת רקעכתוצאה מהפרוטוקול מכתים. שליטה לקובץ מצורף IAV היא הטיפול מראש של תאים עם neuraminidase חיידקים (NA). דבק NA את חומצת sialic מגליקופרוטאינים סלולריים, ובכך להסיר קולטנים קובץ מצורף מתא השטח. אזיד הנתרן (SA) הוא מעכב חילוף חומרים חזק ובכך חוסם אנדוציטוזה 13. תאים שטופלו עם אזיד הנתרן צריכים להיות חיוביים לוירוס מחייב אך שליליים להפנמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שים לב לפני התחלה: זרימה למינרית שימוש מכסה המנוע והביו-אטום המתאים בעת עבודה עם נגיף חי. כאן אנו מתארים תנאי גידול מתאימים ל/ WSN זן נגיף שפעת התרבות / 33. פעמים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) ודגירה עשויות להשתנות בהתאם לזן נגיף בשימוש.
1. הכנת / WSN וירוס Biotinylated / 33
- זרע מדין-דארבי kindey כלבים (MDCK) תאים לתוך בקבוק סנטימטר T175 2 באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ופניצילין, סטרפטומיצין 1% (עט / סטרפטוקוקוס). תאי תרבות על 37 מעלות צלזיוס עד confluency כ -70% הוא הגיע.
- לפני הזיהום, להסיר בינוני ולשטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH7.0-7.3) על ידי הוספת נפח מספיק גדול כדי לכסות את monolayer התא.
- הסר PBS ולהדביק תאים עם / WSN / 33 עם משרד הפנים של 10 -4. לדלל וירוס בPBS בתוספת 0.02 מ"ג Mg 2 +, 0.01 מ"ג Ca 2 + </ Sup>, 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -1% פן / סטרפטוקוקוס (זיהום-PBS). השתמש בבידוד של 4 מיליליטר לבקבוק סנטימטר T175 2.
- דגירה תאים 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס. הסר הבידוד על ידי מיליליטר DMEM 10 שאיפה ופיפטה בתוספת 0.3% BSA, 20 מ"מ HEPES, ו -1% פן / סטרפטוקוקוס לתוך הבקבוק.
- דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 3 ימים עד השפעת cytopathic (CPE) הוא גלוי, ולאחר מכן supernatant קציר. יכול להיות מוכר כCPE עיגול של תאים ואחרי ניתוק ומוות של תאים 14.
- ספין supernatant ב 450 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תא. העברת supernatant לתוך צינור בז חדש וחזור על שלב זה עוד פעם אחת. מחק את כדורים.
- ההעברה supernatants לתוך צינורות ultracentrifuge וsupernatants יסוד עם 5 מיליליטר של סוכרוז 30% בדילול במאגר NTE (10 מ"מ טריס [pH 7.4], 100 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA). לאזן צינורות לפני ultracentrifugation ולמלא את עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. superna ספיןtants ב112398 XG (המקביל ל 25,000 סל"ד הרוטור SW28) למשך 90 דקות בultracentrifuge.
- מוציא בזהירות supernatant ידי pipetting ולספוג גלולה וירוס הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ב250 μl PBS. Resuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. למדוד את תכולת חלבון של וירוס מטוהר על ידי assay ברדפורד 15.
- השתמש בערכת biotinylation ליצור biotinylated / WSN / 33. בצע את ההוראות של היצרן.
- בקיצור, להוסיף את הכמות המתאימה של ביוטין לנגיף המטוהר ודגירה של 2H על קרח. העבר את הווירוס לצינור ultracentrifuge ולמלא את צינור עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. ספין וירוס ב112389 XG במשך 90 דקות בultracentrifuge. הסר supernatant ידי pipetting ולהוסיף 250 μl PBS. משרים גלולה במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot ולאחסן את וירוס Biotinylated מאוחסן ב -80 ° C שבו יהיה יציב לפחות 24 חודשים.
הערה: זה יכול להיות מועיל כדי לקבוע את כייל של p biotinylatedפיצוי של IAV ידי assay פלאק הסטנדרטי. עם זאת, יש לציין כי הפרוטוקול שלאחר מכן יהיה רק למדוד חלקיקי נגיף biotinylated. נותר חלקיקי unbiotinylated בשל biotinylation שלם יתרום לכייל זיהומיות ידי assay פלאק אבל לא לאות שנמדדה בassay המצורף / ההפנמה.
2. לקבוע את הכמות הנדרשת של וירוס Biotinylated
הערה: לפני assay המצורף / ההפנמה מתבצע, זה חשוב כדי לקבוע את כמות נגיף biotinylated הנדרשת כדי להדביק את כל התאים של מדגם.
- תרבות ותאי A549 trypsinize לפי הוראות היצרן. ספירת התאים באמצעות תא תא. תאי 200,000 A549 פיפטה לFACS deepwell צינורות. ספין 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלולה עם 200 μl PBS. תאים להתקרר על קרח למשך 10 דקות.
- הכן פי 5 דילולים סידוריים של biotiמניות וירוס nylated בזיהום-PBS.
- צינורות ספין המכילים את התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול עם 100 המכיל וירוס זיהום-PBS μl. כשימוש שליטה מדומה זיהום-PBS ללא וירוס biotinylated. דגירה צינורות על קרח עבור שעה 1.
- צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת.
- לקיבעון, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בשל paraformaldehyde 3.7% (PFA) 100 μl. דגירה של 10 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4).
- לpermeabilization, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב100 μl PBS המכיל 0.5% Triton X-100. דגירה של 6 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4).
- צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולאח בBSA 50 μl 2% בדילול מלא PBS המכיל STV-Cy3. (לתשומת לבך, את הריכוז המתאים של STV-Cy3 צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי התחל עם ריכוז של 1:. 200 ובדיקת דילולים פי 2 עד 1:. 2,400 בידיים שלנו, דילול של 1: 1,000 הוכיח להיות אופטימלי.)
- דגירה שעה 1 בחושך ב RT. ואז, צעד כביסה חוזרת מתואר ב2.4 אבל resuspend גלולה בBSA 200 μl 2% בדילול מלא PBS.
- ניתוח דגימות על ידי cytometry זרימה 16. שער על אוכלוסיית Cy3-החיובית. בחר את הריכוז הנמוך ביותר של וירוס biotinylated כתוצאה מהמספר המרבי של תאי Cy3-חיוביים באוכלוסיית A549.
3. לקבוע את הכמות הנדרשת של streptavidin
הערה: היעילות של חסימת האותות שמקורם וירוס תאי קובעת את טווח הגילוי של assay. לכן, חשוב לבטל את אות STV-Cy3 ככל האפשר. הדואר כמות הנדרשת של STV דרוש תלוי בכמות של מניות biotinylated וירוס משמשות (שנקבעו בסעיף 2).
- בצע את שלבים 2.1-2.4, אבל להשתמש בריכוז וירוס שנקבע בסעיף 2.
- הכן דילולים סידוריים פי חמישה של STV מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן.
- צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלולים בדילול STV 50 μl. כשימוש שליטה מדומה PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן מבלי STV. דגירה צינורות במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4.
- עקוב 2.5-2.9 צעדים. עבור assay ההפנמה, לבחור את הריכוז הנמוך ביותר של STV וכתוצאה מגוש חזק של Cy3-האות (בהשוואה למדגם שבו לא היה נוכח STV). לשם כך, ניתן להשתמש באחוז תאי CY3-חיובי או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. באופן אידיאלי, אות Cy3 של דגימות שטופלו STV צריכה להיות קרובה לאות ממדומה נגועתאים ככל האפשר.
4. קובץ מצורף / ההפנמה Assay
הערה: הקפד להכין את כל חומרים כימיים לפני שמתחיל assay. לשלושת קבוצות הביקורת שהוצגו בסעיף התוצאות (תאים נגועים מדומים, תאים טרום שטופלו neuraminidase ותאים אזיד הנתרן שטופלו) שינויים קטנים לפרוטוקול נדרשים.
- הכן 16 צינורות deepwell כל המכילים 200,000 תאי A549. בסמוך לסט הניסיוני בהיקף של 4 צינורות, יש 3 תנאי שליטה, כל 4 צינורות הדורשים: תאים נגועים מדומים, neuraminidase (NA) תאים -pretreated ותאים שטופלו אזיד הנתרן. כל קבוצה מורכבת מ -4 צינורות שכותרתו 'דק' 0 ',' דק '0 + STV', '30 דקות ', '30 דקות + STV'.
- צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS.
- צינורות ספין בC ° 4 ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולet 200 DMEM μl המכיל 0.3% BSA, 20 מ"מ HEPES ו -1% (בינוני דגירה) פניצילין, סטרפטומיצין. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: לשליטה neuraminidase: neuraminidase חיידקי השימוש (למשל sialidase מVibrio כולרה) בריכוז של 200 mU / מדולל מיליליטר במדיום דגירה לresuspend התאים. - צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת, ולאחר מכן צינורות מגניבים על קרח למשך 10 דקות.
- צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב100 μl biotinylated וירוס (להשתמש בריכוז הווירוס שנקבע בסעיף 2 בדילול מלא בזיהום-PBS). דגירה שעה 1 על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4.
הערה: לשליטה נגועות מדומה: השתמש זיהום-PBS ללא וירוס. לשליטה נתרן אזיד: השתמש וירוס בדילול מלא בזיהום-PBS בתוספת 0.1% אזיד הנתרן. - Processing של הדגימות לאחר הזיהום על קרח:
- לדגימות '0 דקות', בצע את דגימות שלב 2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס עד דוגמאות אחרות הם קבועים.
- ל'דק '0 + STV' דגימות, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לדגימות '30 דקות ', צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. - עבור '30 דקות + דגימות 'STV ספין צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בצע את השלבים 2.6-2.8 ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. לקבוע את אחוז התאים Cy3-חיוביים בכל דגימה.
- לחשב את וירוס אחוז מצורף וכמות היחסית של וירוס הפנים.
- כדי לחשב את כמות הנגיף מצורף, להשתמש באחוז Cy3-positiיש תאים מגודר או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. לשם השוואה, להגדיר תאים שלא טופלו עד 100% (איור 4).
הערה: אחוז הווירוס המצורף מתוארת על ידי המדגם "0 דקות". - כדי לחשב את כמות הנגיף הפנים, לקחת את היחס של "30 דקות + STV" מדגם מדגם "30 דקות" (איור 5).
הערה: כפי שצוין לעיל, אחוז תאי Cy3 החיוביים מגודרות או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3 ניתן להשתמש.
- כדי לחשב את כמות הנגיף מצורף, להשתמש באחוז Cy3-positiיש תאים מגודר או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. לשם השוואה, להגדיר תאים שלא טופלו עד 100% (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קריקטורה המתארת את ארבעת תנאי ניסוי שונים מוצגת באיור 1 תוצאות של ניסוי נציג מוצגות באיורים 2 -. 5. במדגם "0 דקות", וירוס biotinylated קר-מחויב למקד תאים שניתן דמיינו ידי מכתים STV-Cy3 (איורים 1 ו -2). כאשר צעד חסימה (ב" דקות 0 + STV "מדגם) מוחל, וירוס על פני התא כבר לא יכול להיות מזוהה על ידי צביעת STV-Cy3. כתוצאה מכך, עוצמת האות ב" דקות 0 + STV "מדגם חום מופחת בהשוואה למדגם" 0 דקות "(איורים 1 ו -2). עם העלאת הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, וירוס מצורף הוא נלקח לתאים (לדוגמא "30 דקות"). הווירוס הפנים אינו רגיש לחסימה עם STV ללא תווית שתוצאת ירידה דרמטית פחות בעוצמת אות ב& #8220; 30 דקות + STV "דגימות ביחס ל" מדגם 30 דקות", שבי אין חסימת STV יושמה (איורים 1 ו -2).
כפקדים אנחנו מועסקים זיהום מדומה, טיפול NA וטיפול SA. איור 3 מציג את האחוזים של תאי Cy3-חיוביים לכל תנאי הניסוי מתוארים בסעיף 4. תאים נגועים במוק לתת את עוצמת אות רקע לניסוי ולפעול שליטה שלילית ל קובץ מצורף וירוס (איור 4). בקרה נוספת לקובץ מצורף וירוס היא טיפול עם NA הביע bacterially. NA מסיר חומצת sialic, קולט לקובץ מצורף IAV, מגליקופרוטאינים על פני התא ובכך מפחית מחייב של הווירוס למקד תאים 17. כפי שניתן לראות באיור 4, טיפול עם NA מאוד מבטל מצורף IAV בכ -90% בהשוואה לתאים שלא טופלו. לגבי הפנמה, השתמשנו SA כשליטה. TR SA eatment מייד מכלה את רמות ה- ATP סלולריות ובכך מעכבות תהליכי אנרגיה רב כגון אנדוציטוזה 13. דגירה של תאים עם SA במהלך ואחרי הפנמת זיהום עכבות של חלקיקי נגיף. הכמות היחסית של הווירוס הפנים (המתואר באיור 5) הועלתה מ -10% ל -45% על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתאים שלא טופלו. בעקבות טיפול SA עם זאת, אחוז הווירוס הפנים יחסי הייתה כ -15% לשניהם, תאים טופחו במשך 30 דקות 0 ועל 37 מעלות צלזיוס. זה מצביע על כך אכן, SA מפחית את הספיגה היעילה של חלקיקים נגיפיים לתוך תאים.
איור 1. עיקרון של assay. קריקטורה המסבירה את העיקרון של assay המצורף / ההפנמה.= "_ Blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תוצאת נציג לקובץ מצורף IAV והפנמה. היסטוגרמה () מראה את עוצמת האות של אות Cy3 לתאים שלא טופלו. מוצגים הם "0 דקות", "דקות 0 + STV", "30 דקות" ו- "30 דקות + STV" מדגם. אחוז (B) של תאי Cy3 החיוביים מא אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תוצאת נציג להתקשרות והפנמה לרבות בקרות. Rong> אחוז תאי A549 Cy3 החיוביים לאחר טיפול המצוין. המוצגים הם מדומה נגוע, שלא טופל, טופל NA וטופל SA תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. עיכוב של קובץ מצורף וירוס על ידי neuraminidase. () היסטוגרמה המציגה את עוצמת אות Cy3 של דגימות "0 דקות". מוצג הם תאים שלא טופלו (בכחול) ושתי דגימות בקרה: תאים מדומים נגועים וטופלו NA (באדום וכתום, בהתאמה). אחוז (B) של תאי Cy3 חיוביים מא מוצגים הם מדומה, שלא טופל ומטופלי NA תאים מהמדגם "0 דקות". הערך לתאים שלא טופלו נקבע ל -100%.com / קבצים / ftp_upload / 53,372 / "target =" _ 53372fig4large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיכוב איור 5. של הפנמת וירוס על ידי אזיד הנתרן (SA). () היסטוגרמה המציגה את עוצמת אות Cy3 של "30 דקות" ו- "30 דקות + STV" דגימות ממטופל (באדום וכתום, בהתאמה) וסמ מטופלים (בכחול וירוק, בהתאמה) תאים. אחוז (B) של וירוס הפנים יחסי מהתאים שלא טופלו ומטופלים-SA אחרי 0 ו -30 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שלנו מתאר את דרך קלה של מדידה מצורף וירוס והפנמה על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר שימוש בוירוס wildtype שכותרת אשר מחקה באופן הדוק יותר זיהומי נגיף בהשוואה לשימוש בחלקיקים כמו וירוס (אן אל פי). בעוד הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למדידה מצורף והפנמה של IAV זה יכול בקלות להיות מותאם לוירוסים אחרים. בנוסף, כcytometry זרימה משמש לקריאת נתונים, ניתן להוסיף שיתוף stainings בקלות לדוגמא הפרוטוקול לבדוק רמות הביטוי הבאים מציאה או ביטוי יתר של חלבון של עניין. לפיכך, assay מאפשר לשינויים בפרוטוקול בהתאם לצרכים האישיים. ראוי לציין, assay יכול גם להתבצע לסדרה של נקודות זמן למדידת הפנמת וירוס לאורך זמן ולהשיג מידע קינטית. זה עשוי להיות חשוב במיוחד אם assay היה להיות מותאם לוירוס שונה עם קינטיקה הפנמה לא ידועה.
האוVer, יש לציין כי החלון של גילוי הוא יחסית קטן כמו הבדלים בקובץ מצורף או הפנמה מתרחשים בקנה מידה ליניארי בשל העדר השכפול הנגיפי. כדי להגדיל את הביטחון העצמי וכדי להפחית את הרעש אנו ממליצים לרבות בקרות (למשל הבקרות לתאר לעיל) וכמה חזרות. למרות התוצאות הראו מתארות ניסוי נציג, צפינו עקביות טובה על פני ניסויים שונים: לדוגמא, עבור קובץ מצורף, אחוז Cy3 החיובי התאים נע בין 60-80%; לוירוס מופנם השגנו ערכים הנעים בין 40-60%.
לפני assay הוא התחיל, חשוב לכיל ריכוזי העבודה של חומרים כימיים המשמשים כמו STV, STV-Cy3 ואת כמות נגיף biotinylated. שים לב שהכמות של חומרים כימיים ופעמים דגירה יכולה להשתנות בהתאם לקו התא וזן נגיף בשימוש. כדי להגדיל את החלון של איתור, אחוז התאים החיובי לווירוס attachmenלא צריך להיות גבוהים ככל האפשר ב" המינימום 0 ו" 30 דקות "מדגם (תלוי בכמות נגיף biotinylated בשימוש) והנמוכה ככל האפשר ב" דקות 0 + מדגם STV" (בהתאם לכמות של STV השתמש ). בנוסף, רעש יכול להיות מופחת על ידי שמירה על התאים ב 4 מעלות צלזיוס במהלך צנטריפוגה ועל ידי שטיפה עם PBS קר כקרח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_135278) לSST. MOP הוא המוטב של מענק דוקטורט מקרן מחקר AXA. אנו מודים פטרישיה Nigg לעזרה עם העיצוב של איור 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
