Introduction
インフルエンザAウイルス（IAV）のエントリは、標的細胞1の細胞膜上の受容体へのウイルスの結合で開始する多段階プロセスです。 IAVの受容体は、糖タンパク質および糖脂質の多種多様に存在するシアル酸です。ウイルスエンベロープ中に存在するIAVのヘマグルチニン（HA）タンパク質は、シアル酸に結合し、それによって標的細胞2の原形質膜へのウイルス粒子の付着を媒介します。ウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して細胞に入るだけでなく、マクロピノサイトーシスなどの代替エントリー経路は、3-6に記載されています 。 HAとシアル酸との間の相互作用は、付着およびウイルス粒子7の内在化をトリガ両方を媒介するのに十分であるように見えます。それにもかかわらず、代替エントリー受容体が提案されているとIAVエントリにおける役割は、現在、1,8,9を検討されています。
CURrently、努力が緊急に必要とされる、新規な抗ウイルス治療法10-12開発を目的としたウイルスのライフサイクルに関与する宿主因子を同定するために行われます。ウイルス侵入は、その最も早い時点でウイルス感染を阻止するために、IAV増殖を標的とするための有利なステップになります。ウイルスの通常大量の着信ウイルスを検出するために必要とされる実験IAVエントリの異なる段階を測定することは困難です。加えて、ウイルス侵入の変化の検出範囲のみによりウイルス複製の欠如に線形です。これは、高感度のアッセイのための必要性を強調する。
ここで本発明のアッセイは、細胞表面に付着したウイルスの検出ならびに細胞関連ウイルスの合計量に対する内在ウイルスの検出を可能にします。ビオチン化野生型ウイルスの使用は、STV-Cy3およびフローサイトメトリーによる読み出しに染色を通じて便利な測定を可能にします。ビオチン化ウイルスは、細胞に冷結合していますSを付着させるが、ウイルス粒子の内在化を防止することができます。細胞は、固定された透過性および添付のウイルスを測定するために、STV-Cy3で染色することができます。ブロッキング工程は、細胞が非標識ストレプトアビジン（STV）と一緒にインキュベートされた固定の前に適用される場合、細胞外、添付ビリオンからの信号を排除することができます。次のステップでは、ビオチン化IAVの取り付け後、温度を37℃にシフトされ、ウイルス粒子の内部移行を行わせます。内在粒子は、それによって細胞外および細胞内のウイルスとの識別を可能STVの結合から保護されています。
実験条件ごとに、4つのサンプルが必要とされている：「0分」：最初のサンプルは、標識された「0分」、細胞表面で冷間結合ウイルスを測定することです。 「0分+ STV '：' 0分+のSTV「標識された第二のサンプルは、実験のベースライン信号強度を与えます。添付ウイルスはウィットをブロックされていますSTV-Cy3で染色以下の時間STVと信号が「0分」のサンプルと比較してはるかに低いことが必要です。 '30分 '：第三のサンプル、'30分'が原因で30分間、37℃に温度シフトに取り付けられ、ウイルスを内在化含まれています。 '30分+ STV '：第4のサンプル、'30分+ STV」対策ウイルスの細胞内画分。 STVブロッキング工程は、30分のインキュベーション期間の後に適用されます。その結果、細胞表面でのウイルス粒子は、STV-Cy3で染色するための唯一の内在化ウイルスは、利用可能な脱離STVによって結合されます。内在化ウイルスの相対的な量は、「（サンプル'30分によって記述）ウイルスの総量で割った（サンプル'30分+ STVで測定される）「内在ウイルスの比として計算することができます。
コントロールとして、我々はモック感染した細胞を含むことを示唆しています。モック感染細胞のSTV-Cy3の染色以下の信号はバックグラウンドを提供します染色プロトコルに起因します。 IAV結合のためのコントロールは、細菌ノイラミニダーゼ（NA）を用いた細胞の前処理です。細胞性糖タンパク質からシアル酸をオフNAを切断し、それによって細胞表面から付着受容体を除去します。アジ化ナトリウム（SA）は、強力な代謝阻害剤であり、それによって、ブロックが13をエンドサイトーシス。アジ化ナトリウムで処理した細胞は、内在化のための結合ウイルスに陽性であるが負でなければなりません。
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Protocol
開始前の注意：使用層流フード、適切な生物学的封じ込め生ウイルスでの作業。ここで、我々は、培養インフルエンザウイルス株A / WSN / 33の適切な成長条件を説明します。感染多重度（MOI）およびインキュベーション時間は、使用されるウイルス株に依存して変化し得ます。
ビオチン化、A / WSN / 33ウイルスの作製
- シードマディンダービーイヌkindey（MDCK）を、10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、T175のcm 2のフラスコへの細胞。約70％コンフルエントになるまで37℃で培養細胞に到達します。
- 感染の前に、培地を除去し、細胞単層をカバーするのに十分大きな容量を追加することにより、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.0-7.3）で細胞を洗浄します。
- PBSを削除し、10 -4のMOIで、A / WSN / 33を細胞に感染します。 PBS中のウイルスを希釈0.02ミリグラムのMg 2+、0.01ミリグラムの Ca 2+ <を補っ/ SUP>、0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（感染-PBS）。 T175センチ2フラスコのために4ミリリットルの接種材料を使用してください。
- 細胞を37℃で1時間インキュベートします。フラスコに0.3％BSAを添加し、吸引ピペット10ミリリットルのDMEMによって接種物を取り除き、20mMのHEPES、及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン。
- その後、収穫上清表示されており、細胞変性効果（CPE）まで約37℃で3日間細胞をインキュベートします。 CPEは、細胞14の剥離や死に続いて細胞の切り上げとして認識することができます。
- 細胞の破片を除去するために5分間、450×gで上清をスピン。新しいファルコンチューブに上清を移し、この手順をもう一度繰り返します。ペレットを廃棄します。
- 超遠心管とNTE緩衝液（10mMトリス[pHが7.4]、100mMのNaCl、1mMのEDTA）で希釈した30％スクロース、5 mlの下敷き上清へ転送上清。超遠心分離の前にチューブのバランスをとり、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでいっぱい。スピンsuperna112398×gでtantsは、超遠心機で90分間（SW28ローターのための25,000 RPMに相当します）。
- ピペットで注意深く上清を除去し、250μlのPBS中に4℃で一晩ウイルスペレットを浸します。ピペッティングにより再懸濁ペレット。 Bradfordアッセイ15によって精製されたウイルスのタンパク質含有量を測定します。
- ビオチン化、A / WSN / 33を生成するために、ビオチン化キットを使用してください。製造元の指示に従ってください。
- 簡潔には、精製されたウイルスを、適切な量のビオチンを添加し、氷上で2時間インキュベートします。超遠心管にウイルスを移し、30ミリリットルの最終容量に到達するためにPBSでチューブを埋めます。超遠心機で90分間112389×gでウイルスをスピン。ピペットで上清を除去し、250μlのPBSを追加します。 4℃で一晩ペレットを浸します。ビオチン化ウイルスをアリコートし、格納、少なくとも24ヶ月間安定である-80℃で保存しました。
注：これは、ビオチン化Pの力価を決定するために役立つかもしれません標準的なプラークアッセイによりIAVの賠償。しかし、後続のプロトコルのみをビオチン化ウイルス粒子を測定することに留意すべきです。不完全なビオチン化のために残りの非ビオチン化粒子は、プラークアッセイにより感染力価に貢献ではなく、添付ファイル/内在化アッセイで測定された信号になります。
2.ビオチン化ウイルスの必要量を決定します
注：添付ファイル/内在化アッセイが行われる前に、試料の全ての細胞を感染させるために必要なビオチン化されたウイルスの量を決定することが重要です。
- 製造業者の指示に従ってA549細胞を培養し、トリプシン処理。セルチャンバーを用いて細胞を数えます。 FACSディープウェルチューブに20万A549細胞をピペット。スピン450×gで3分。上清を除去し、200μlのPBSでペレットを再懸濁。クールダウン細胞を氷上で10分間。
- biotiの5倍連続希釈液を調製します感染-PBS中にウイルスストックをnylated。
- 450 x gで3分間、4℃で細胞を含有するスピンチューブ。 100μlのウイルス含有感染-PBSで上清と再懸濁したペレットを削除します。モック対照として、ビオチン化ウイルス感染なし-PBSを使用しています。 1時間氷上でチューブをインキュベートします。
- 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。この手順をもう一度繰り返します。
- 固定のために、450 x gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）の100μl中にペレットを再懸濁。 RTで10分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。
- 透過性のために、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 0.5％のトリトンX-100を含む100μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。室温で6分間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄工程）を繰り返します。
- 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁STV-のCy3を含むPBSで希釈した50μlの2％BSAでら。 （STV-のCy3の適切な濃度は、実験を開始する前に決定されるべきで、注意してください1の濃度で開始します。1まで200及びテスト2倍希釈：2400我々の手では、1の希釈：1,000証明最適です。）
- 室温で暗所で1時間インキュベートします。その後、繰り返し洗浄工程は、2.4で説明したが、PBSで希釈した200μlの2％BSA中でペレットを再懸濁。
- 16フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。 Cy3で陽性集団の門。 A549集団中のCy3陽性細胞数の最大値が得られたビオチン化ウイルスの最低濃度を選択してください。
3.ストレプトアビジンの必要量を決定します
注：外ウイルス由来のシグナルを遮断する効率がアッセイの検出範囲を決定します。したがって、できるだけSTV-Cy3シグナルを排除することが重要です。目STVのE必要量は、（セクション2で決定）を使用し、ビオチン化ウイルスストックの量に依存する必要がありました。
- 手順2.1から2.4に従いますが、セクション2で決定したウイルス濃度を使用しています。
- 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈したSTVの5倍連続希釈液を調製します。
- 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。上清を除去し、50μlのSTVの希釈でペレットを再懸濁。モック対照としてSTVずに2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSを使用します。氷上で30分間チューブをインキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。
- ステップ2.5から2.9に従ってください。内在化アッセイのために、（何STVが存在しないた試料と比較して）のCy3シグナルの強力なブロックの結果STVの最低濃度を選択します。このため、CY3陽性細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。理想的には、STV処理サンプルのCy3シグナルは、偽感染からの信号の近くに配置してくださいできるだけ細胞。
4.添付ファイル/内在化アッセイ
注：アッセイを開始する前に、すべての試薬を準備していることを確認してください。プロトコルへの3つの制御結果セクション（モック感染細胞、ノイラミニダーゼ前処理した細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞）に提示グループの小さな変更のために必要とされます。
- それぞれ200,000 A549細胞を含む16ディープウェルのチューブを準備します。次の4管から成る実験セットに、3制御条件、4チューブを必要とする各があります：モック感染した細胞は、ノイラミニダーゼ（NA）は、細胞とアジ化ナトリウムで処理した細胞を-pretreated。各グループは、「0分」、「0分+ STV '、'30分'、'30分+ STV」とラベルされた4のチューブで構成されています。
- 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。
- 450×gで4℃でスピンチューブ。上清を除去し、ペルを再懸濁0.3％のBSA、20mMのHEPESおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（培養培地）を含有する200μlのDMEMにおいてら。 37℃で30分間インキュベートします。
注：使用細菌ノイラミニダーゼ（例えばシアリダーゼビブリオコレラから）mlの細胞を再懸濁するために、インキュベーション培地に希釈/ 200ムーの濃度で：ノイラミニダーゼ制御のため。 - 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 10分間氷上でチューブを冷却、その後、この手順をもう一度繰り返します。
- 450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 （感染-PBSで希釈したセクション2で決定したウイルス濃度を使用）、100μlのビオチン化ウイルスで上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で1時間インキュベートします。次に、2.4で説明した洗浄ステップを繰り返します。
注：モック感染制御の場合：ウイルス感染せず、PBSを使用してください。アジ化ナトリウムを制御するために：感染-PBSで希釈したウイルスを使用し、0.1％のアジ化ナトリウムを補充しました。 - プロの氷上での感染後のサンプルのcessing：
- 他のサンプルが固定されるまで、「0分」のサンプルについて、4℃でステップ2.5と店舗のサンプルに従ってください。
- 450×gで3分間、4℃で0分+ STV」のサンプル、スピンチューブ用。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4から2.5とストアのサンプルに従ってください。
- 450×gで3分間、4℃で'30分 'サンプル、スピンチューブ用。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4から2.5とストアのサンプルに従ってください。
注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。 - 「3の場合0分+ STV」のサンプルは、450×gで3分間、4℃でチューブをスピン。 2％BSAを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上清とペレットを削除します。 37℃で30分間インキュベートします。その後、450×gで3分間、4℃でスピンチューブ。 2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含むPBSで希釈した50μlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）（サンプルの処理中に内在化を防ぐために）で上清と再懸濁したペレットを削除します。氷上で30分間インキュベートします。 4℃でステップ2.4から2.5とストアのサンプルに従ってください。
注：アジ化ナトリウム制御について：使用PBSを37℃で30分間のインキュベーションのために、2％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウムを補充しました。
- 手順2.6から2.8に従って、フローサイトメトリーによってサンプルを分析。各サンプル中のCy3陽性細胞の割合を決定します。
- パーセンテージ添付ウイルスおよび内在化ウイルスの相対的な量を計算します。
- 付着したウイルスの量を計算するために、Cy3でPOSITIの割合を使用しゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度をまし。比較のために、100％（ 図4B）に未処理細胞を設定します。
注：添付ウイルスの割合を「0分」サンプルによって記述されます。 - 内在化ウイルスの量を計算するには、「30分」のサンプル（ 図5B）に「30分+ STV」のサンプルの比を取ります。
注：上記のように、Cy3の正のゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度の比率を使用することができます。
- 付着したウイルスの量を計算するために、Cy3でPOSITIの割合を使用しゲート細胞またはCy3シグナルの平均蛍光強度をまし。比較のために、100％（ 図4B）に未処理細胞を設定します。
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Representative Results
四つの異なる実験条件を説明する漫画は 、図1に示されている代表的な実験の結果を図2に提示されている- 。5。 「0分」のサンプルでは、ビオチン化したウイルスは、低温結合であるSTV-Cy3の染色によって可視化することができる細胞を標的とするために（ 図1および 2）。 （ "0分+ STV」サンプルで）ブロッキング工程が印加されると、細胞表面でのウイルスはもはやSTV-Cy3の染色によって検出することができません。その結果、 "0分+ STV」サンプルの信号強度が強く、「0分」サンプル（ 図1および2）と比較して低減されます。 37℃に温度を上昇させる際に、付着したウイルスを細胞（「30分」サンプル）に取り込まれます。内在ウイルスは＆＃における信号強度にあまり劇的な低下をもたらす非標識STVでブロックに対して敏感ではありません8220;ないSTVブロッキングが適用されなかった30分」サンプル30分+ STV」に対してサンプル」（図1および2）。
コントロールとして、我々はモック感染、NA処理およびSA処理を採用。4.モック感染細胞が実験のためにバックグラウンド信号強度を与えるための陰性対照として機能するセクションで説明したすべての実験条件のために3ディスプレイをCy3で陽性細胞の割合を図ウイルスの付着（ 図4）。ウイルス結合のための追加の制御は、細菌で発現されたNAの処理です。 NAは、細胞表面上の糖タンパク質からシアル酸、IAV結合のための受容体を除去し、それによってセル 17 を標的とするために、ウイルスの結合を減少させます。 図4に示すように、NAを用いた治療が強く、未処理細胞と比較して約90％のIAV付着を抑止します。内在につきましては、コントロールとしてのSAを使用していました。 SA TR eatmentは、速やかに、これにより、このようなエンドサイトーシス13等のエネルギー消費のプロセスを阻害する細胞ATPレベルを枯渇させます。感染の間および後のSAでの細胞のインキュベーションは、ウイルス粒子の内在化を阻害しました。 （ 図5に示されている）内在ウイルスの相対的な量は、未処理細胞中で37℃で30分間インキュベートすることにより45％まで、約10％から上昇させました。 SA処理後しかし、相対的な内在化ウイルスの割合は、両方のために、37℃で0および30分間インキュベートした細胞約15％でした。これは確かに、SAは、細胞へのウイルス粒子の有効取り込みを減少させることを示しています。
アタッチメント/内在化アッセイの原理を説明する図アッセイの1原理。漫画。= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IAVの付着および内在化のために図2の代表的な結果。未処理の細胞のためのCy3シグナルの信号強度を示す（A）のヒストグラム。示されている「0分」、「0分+ STV」、「30分」と「30分+ STV」のサンプルです。 AからのCy3陽性細胞の（B）の割合この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コントロールを含む添付ファイルと内在図3.代表的な結果。 栄>指示された治療の後のCy3陽性A549細胞の割合。示す偽感染、未処理、NA処理およびSA処理した細胞である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ノイラミニダーゼによるウイルス添付の図4阻害。 （A）ヒストグラムは「0分」サンプルのCy3シグナル強度を示します。モック感染およびNA-処理細胞（赤とオレンジで、それぞれ）：未処理（青色）細胞および二つの制御サンプルが表示されます。示さAからのCy3陽性細胞の（B）の割合は、「0分」のサンプルから、モック未処理およびNA処理した細胞です。未処理細胞の値を100％に設定しました。COM /ファイル/ ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図アジ化ナトリウム（SA）によるウイルス内在化の5阻害。（A）ヒストグラム「30分」のCy3シグナル強度を示すと、「30分+ STV「未処理のサンプル（赤とオレンジで、それぞれ）とSA-細胞（それぞれ、青色および緑色に）処理しました。 0と30分後に未処理およびSA-処理した細胞からの相対的内在化ウイルスの（B）の割合。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーにより、ウイルスの付着および内在化を測定する簡単な方法を説明します。これは、ウイルス様粒子（VLP）の使用と比較して、より厳密に模倣ウイルス感染標識野生型ウイルスの使用を可能にします。我々のプロトコルは、IAVの付着および内在化を測定するために最適化されているが、容易に他のウイルスに適合させることができます。フローサイトメトリーは、読み出しのために使用されるほかに、共染色が容易に目的のタンパク質のノックダウンまたは過剰発現以下の発現レベルを試験するためのプロトコルなどを添加することができます。したがって、このアッセイは、個々のニーズに応じて、プロトコルの変更が可能になります。注目すべきは、アッセイはまた、経時的にウイルスの内在化を測定した運動情報を取得するために一連の時間点について行うことができます。アッセイは、未知の内部移行動態と異なるウイルスのために適合されるならば、これは特に重要であるかもしれません。
ハウ版は、付着または内在化の違いは、ウイルスの複製の不在のために、リニアスケールで起こるように、検出窓が比較的小さいことに留意すべきです。自信を高めるためにし、ノイズを低減するために、我々は、コントロール（例えばコントロールは上記の記述）と、いくつかの反復を含むお勧めします。示された結果は、代表的な実験を示しているが、我々は、異なる実験全体の良好な一貫性を観察した：例えば、取り付けのために、Cy3で陽性細胞の割合が60〜80％の範囲でした。内在ウイルスのために私たちは40〜60％の間の範囲の値を得ました。
アッセイを開始する前に、それは、STV、STV-Cy3およびビオチン化されたウイルスの量として使用される試薬の作業濃度を滴定することが重要です。試薬およびインキュベーション時間の使用量は、細胞株とウイルス株によって異なりますのでご注意ください。検出のウィンドウを最大化するために、ウイルス陽性の細胞のパーセンテージattachmentは使用STVの量に応じて（0分+ STV「サンプル」で（使用するビオチン化ウイルスの量に応じて）サンプルとできるだけ低い "" 0分および「30分で可能な限り高くなければなりません）。また、ノイズは、遠心分離の間、4℃で細胞を維持することによって、氷冷PBSで洗浄することによって低減することができます。
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Acknowledgments
この作品は、のSStにスイス国立科学財団（31003A_135278）からの助成金によってサポートされていました。 MOPはAXA研究基金から博士助成金の受益者です。我々は、 図1の設計のヘルプはパトリシア・ニグに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
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