腭扁桃体是B淋巴细胞和T淋巴细胞的丰富来源。本文提供了一种简便、高效且快速的从人腭扁桃体中分离B淋巴细胞和T淋巴细胞的实验方案。该方法已特别优化，适用于研究已知为扁桃体炎的扁桃体炎症的病毒病因学。
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本文内容
摘要
摘要
扁桃体是免疫系统的一部分，可为抵御吸入性病原体提供第一道防线。通常，“扁桃体”一词指的是位于咽部口咽部侧壁的腭扁桃体。手术切除的腭扁桃体为研究外来病原体与宿主免疫系统之间的相互作用，提供了方便且易获取的B淋巴细胞和T淋巴细胞来源。本视频方案描述了手术切除的人腭扁桃体的解剖与处理过程，随后从同一组织样本中分离出独立的B细胞和T细胞群体。我们介绍一种利用抗体依赖性亲和法高效分离扁桃体B细胞和T淋巴细胞的方法。此外，我们应用该方法证明人腺病毒特异性感染扁桃体T细胞组分。所建立的方案可广泛适用于高效、快速地分离扁桃体B细胞和T细胞群体，以研究不同类型病原体在扁桃体免疫应答中的作用。
引言
扁桃体是一团团未完全包裹的淋巴组织，位于上呼吸道和消化道的上皮下方并与之接触。通常，“扁桃体”一词指的是位于咽部口腔部分侧壁的成对腭扁桃体。成对的腭扁桃体、咽鼓管扁桃体、舌扁桃体以及鼻咽扁桃体（腺样体）共同构成所谓的“瓦尔代耶环”（Waldeyer's ring）。该结构负责吸入或摄入的病原体与呼吸消化道淋巴组织之间的初始接触1,2。事实上，大量研究报告表明，可在腭扁桃体组织样本中检测到细菌性和病毒性抗原2-6。
腭扁桃体由致密的淋巴组织构成，表面覆盖着复层鳞状非角化上皮。扁桃体具有大量隐窝，即上皮内陷结构，深入实质以增加表面积。组织学上，腭扁桃体含有大量带有生发中心的淋巴滤泡，是B细胞成熟与分化的场所（B细胞区）。同时，腭扁桃体也包含T细胞，主要分布于滤泡外区域（T细胞区）。除B细胞和T细胞外，还可于腭扁桃体中检测到多种滤泡树突状细胞1,2。
由于解剖位置的关系，腭扁桃体易于通过外科手术进行干预。例如，被称为扁桃体切除术的扁桃体外科切除术在全球范围内常规开展7。对于患有扁桃体增生的儿童，有时采用扁桃体部分切除术（扁桃体切开术），以减少术后疼痛。鉴于扁桃体内可积聚多种病原体，手术切除的扁桃体为研究病毒和细菌因子对扁桃体淋巴细胞功能的影响提供了独特的机会2,8。此外，还可研究某些病原体是否倾向于定植于特定的细胞亚群....
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方案
本方案描述了从人类患者样本中分离淋巴细胞的过程，因此需要获得伦理批准。本研究开展的工作已获得乌普萨拉伦理审查委员会的许可（批准号：2013/387）。
1. 从人腭扁桃体中分离单个核细胞（MNCs）
警告：所有未经筛查的人源性材料，如血液、组织或体液，均应被视为可能具有感染性的物质。因此，应遵循推荐的生物安全操作规程来处理人体组织。
注意：为避免污染， 所有溶液和细胞培养设备必须保持无菌。所有缓冲液和溶液应预先冷却并置于冰上保存。扁桃体组织及分离的细胞应始终在冰上保存和操作。
- 从接受扁桃体切除术或扁桃体部分切除术的患者处获取新鲜扁桃体组织 (图2)。将组织块立即浸入装有冰上预冷的无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS）的50 ml离心管中，HBSS中需添加5%胎牛血清（FBS）、10 mM谷氨酰胺、0.05 mg/ml庆大霉素及1%抗生素-抗真菌素混合液（青霉素、链霉素和两性霉素B）。
- 始终将含有浸没扁桃体组织样本的离心管置于冰上。应尽快处理扁桃体组织，最迟不得超过手术切除后3小时。
- 将扁桃体置于冰上的60 mm塑料细胞培养皿中，并用HBSS保持组织湿润。使用洁净的镊子清除扁桃体表面可见的血凝块、脂肪组织和结缔组织。
- 准备一个新的含5 ml H....
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结果
高效分离扁桃体单个核细胞（MNCs）可获得高度纯化的B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群。该结果通过流式细胞术分析得到证实，分别使用抗CD20和抗CD2抗体检测B淋巴细胞和T淋巴细胞群体（图3A）。相比之下，低效的MNCs分离则导致细胞组分中混杂了B淋巴细胞和T淋巴细胞两个亚群的细胞（图3B）。
分离得到的扁桃体B细胞和T细胞（图3A）具有足够质量，可用于后续分析，如核酸提取。在本方案中，从B细胞和T细胞中提取的DNA和RNA分别用于检测腺病毒DNA和细胞RNA。结果显示，腺病毒DNA在扁桃体T细胞中被特异性检出（图4）。此外，从扁桃体B细胞和T细胞中分离的RNA在质量和数量上均满足后续实验应用的要求（图5）。
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讨论
影响本实验方案结果的最重要因素之一是使用新鲜的扁桃体组织作为起始材料。因此，扁桃体样本应在手术后3小时内进行处理。扁桃体组织可来自成人或儿童。由于儿童通常接受部分扁桃体切除术（扁桃体切开术），其扁桃体组织通常较小。因此，从扁桃体切开术样本中获得的单个核细胞（MNC）数量（1 × 107–1 × 108）少于扁桃体全切除术样本（1 × 108–2 × 109）。然而，无论手术类型如何，细胞分离过程均相同。
为获得磁性激活细胞分选法中高纯度的细胞亚群，需对实验条件进行优化。CD3磁性抗体的用量与孵育时间，以及上样至分选柱的单个核细胞（MNC）数量是需要优化的主要因素。上样细胞过多会导致分选柱堵塞，从而降低细胞亚群的富集效率。在本方案的优化过程中，我们发现当上样至分离柱的MNC数量超过3 × 107时，会导致柱子堵塞，并产生不纯的细胞组分（图3B）。因此，以3 × 107 MNC为起始细胞量，可获得质量与数量均足以用于DNA.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了瑞典癌症协会（11 0253，13 0469）、瑞典研究理事会（K2012-99X-21959-01-3）、马库斯·博尔格斯特伦基金会以及瑞典研究理事会通过资助乌普萨拉RNA研究中心（2006-5038-36531-16）提供的支持。我们非常感谢乌普萨拉大学BioVis核心设施在FACS分析方面给予的大力帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14175-053 | 含5%胎牛血清（FBS）、10 mM 谷氨酰胺 、0.05 mg/ml 庆大霉素及1% 抗生素-抗真菌素混合液 |
| 冻存液 | 90% FBS 和 10% DMSO | ||
| MACS 缓冲液 | PBS（pH 7.2）、0.5% BSA 和 2 mM EDTA | ||
| PBSA | 含0.2% BSA 的 PBS | ||
| PFA | 含1% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。现配现用。PFA 为疑似致癌物，操作时需佩戴手套和护目镜。 | ||
| 抗生素-抗真菌素混合液 | Gibco | 15240-062 | |
| 60 mm 培养皿 | Nunc | 150326 | |
| 解剖镊 | Fisher Scientific | 1381241 | |
| 直剪虹膜剪 | Fisher Scientific | 12912055 | |
| 一次性手术刀片 | Swann-Morton | REF 0501 | |
| 100 μm 塑料细胞滤网 | Corning Life Sciences | 352360 | |
| 40 μm 塑料细胞滤网 | Corning Life Sciences | 352340 | |
| 2 ml 塑料注射器 | BD Biosciences | 300185 | |
| 15 ml 锥形离心管 | SARSTEDT | 62554502 | |
| 50 ml 锥形离心管 | SARSTEDT | 62547254 | |
| 带固定角或摆动桶转子的低速离心机 | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R | ||
| Ficoll–Hypaque | Sigma-Aldrich | F5415-50ML | Ficoll 溶液 |
| 胎牛血清 | Biological industries | 040071A | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | SIGMA | D2650-5X5ML | |
| MACS MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MACS 人 CD3 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-092-881 | |
| MACS 分离器（Octo MACS） | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck Millipore | 1120180100 | |
| EDTA | AnalaR NORMAPUR | 20302.293 | |
| 与别藻蓝蛋白偶联的 CD2（CD2-APC） | BD Biosciences | 560642 | |
| 与异硫氰酸荧光素偶联的 CD20（CD20-FITC） | BD Biosciences | 556632 | |
| 人血清 | Rockland Immunochemicals | D119-0100 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Thermo Scientific | F-530L | |
| FACS 管 | BD Falcon | 352003 | |
| 冻存管 | SARSTEDT | 72379 | |
| BD LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 4.1 软件 | BD Biosciences | ||
| Nucleospin 血液 | Macherey-Nagel | 740951.50 | DNA 提取试剂盒 |
| TRIzol 试剂 | Life technologies | 15596 | RNA 提取试剂 |
| 血细胞计数板 | The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 0610030 | 细胞计数装置 |
| GelRed | Biotium | 41003 | 核酸凝胶染料 |
参考文献
- Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
- Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J.
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重印与许可
