Summary
ألياف النانو Electrospun لديها مساحة عالية لنسبة الوزن، السلامة الميكانيكية ممتازة، ودعم نمو الخلايا وانتشارها. هذه ألياف النانو لديها مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية. نحن هنا افتعال الكيراتين / ألياف النانو PCL، وذلك باستخدام تقنية العزل الكهربائي، وتوصيف الألياف للتطبيقات الممكنة في هندسة الأنسجة.
Abstract
العزل الكهربائي، وذلك بسبب تنوعها وقدرتها على التطبيقات في مختلف المجالات، ويجري كثيرا ما تستخدم لتصنيع ألياف النانو. إنتاج هذه ألياف النانو التي يسهل اختراقها هي ذات أهمية كبيرة نظرا لخصائصها الفيزيائية الفريدة. نحن هنا وضع على تصنيع الكيراتين التي تحتوي على بولي (ε-caprolactone) (PCL) ألياف النانو (أي PCL / قرنين الألياف مركب). تم استخراج الكيراتين للذوبان في الماء لأول مرة من شعرة الإنسان ومختلطة مع PCL في نسب مختلفة. تحولت حل المخلوطة من PCL / الكيراتين في الأغشية nanofibrous باستخدام العزل الكهربائي مختبر تصميم اقامة. لوحظ مورفولوجيا الألياف والخواص الميكانيكية للألياف نانوية التي تم الحصول عليها وتقاس باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح واختبار الشد. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة التحلل والكيميائية خصائص ألياف نانوية من قبل FTIR. وأظهرت لقطات SEM مورفولوجيا سطح موحدة للألياف PCL / الكيراتين من تركيبات مختلفة. هذه PCL / keratiأظهر الألياف ن أيضا خصائص ميكانيكية ممتازة مثل معامل والفشل نقطة يونغ. استطاعت أن نعلق وتتكاثر مما يثبت بقاء الخلية جيدة الخلايا الليفية. على أساس الخصائص المذكورة أعلاه، يمكننا القول بقوة أن ألياف النانو المخلوطة البوليمرات الطبيعية والاصطناعية يمكن أن تمثل تطورا ممتازة من المواد المركبة التي يمكن استخدامها لالتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة.
Introduction
يتم الاعتراف العزل الكهربائي كوسيلة السائد في تحقيق ألياف النانو بوليمر. يمكن أن تنتج الألياف على مقياس النانو وخصائص الألياف قابلة للتخصيص 1. وكانت هذه التطورات وخصائص ألياف النانو electrospun مثيرة للاهتمام خاصة بالنسبة للتطبيقات في الهندسة الطبية الحيوية وخاصة في هندسة الأنسجة. ألياف النانو electrospun تمتلك التشابه إلى المصفوفة خارج الخلية، وبالتالي تعزيز التصاق الخلية والهجرة وانتشار 2. ونتيجة لهذا التشابه إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) والألياف electrospun يمكن استخدامها كمواد للمساعدة في تضميد الجروح، وتسليم المخدرات، والأنسجة الهندسية مثل الكبد والعظام والقلب والعضلات 3.
وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البوليمرات المختلفة المنشأ الاصطناعية والطبيعية لخلق الألياف electrospun لمختلف تطبيقات الهندسة الطبية (4). في الآونة الأخيرة كان هناك تزايد فيterest في تطوير ألياف النانو المركب عن طريق مزج الاصطناعية وبوليميرات طبيعية (4). في هذه التراكيب المنتجات النهائية يرث عادة القوة الميكانيكية المرتبطة البوليمر الاصطناعية بينما تبني أيضا الاشارات البيولوجية والخصائص من البوليمر الطبيعي.
في هذه التجربة، وتعرض PCL والكيراتين مثل البوليمرات الاصطناعية والطبيعية لاستخدامها في تركيب وألياف نانوية مركب. الكيراتين هو بوليمر الطبيعية التي وجدت في الشعر والصوف والأظافر. أنه يحتوي على العديد من بقايا الأحماض الأمينية. من مصلحة بارزة هي السيستين 4،5. من الناحية المثالية البوليمر التي تحدث بشكل طبيعي سيكون biorenewable، حيويا وقابلة للتحلل. الكيراتين تمتلك كل ثلاثة من هذه الخصائص في الوقت الذي تعزز أيضا تكاثر الخلايا والتعلق الحيوية قد أدرج في 6.
Polycaprolactone (PCL) هو البوليمر الاصطناعية resorbable التي هي كبيرة فيهندسة الأنسجة 4. وقد سبق أن أشاد هذا البوليمر لتحقيق الاستقرار الهيكلي والميكانيكي لها، ومع ذلك، فإنه يفتقر إلى تقارب الخلية ويسلك معدل تدهور طويلة. طبيعة مسعور من PCL هي على الأرجح المسؤولة عن عدم وجود خلية تقارب 7. ومع ذلك، PCL يعوض عن حدودها من خلال كونها غير قابلة للامتزاج للغاية مع البوليمرات الأخرى. وPCL / مركب قرنين وينبغي أن يبين الخصائص الميكانيكية للPCL وتتضمن الخصائص البيولوجية من الكيراتين، مما يجعلها خيارا مثاليا لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع كل بروتوكول للمبادئ التوجيهية للمكتب جامعة ولاية نورث كارولينا A & T الامتثال البحوث والأخلاق.
1. إعداد الكيميائية للكيراتين استخراج 4
- لإعداد 1000 مل من 2٪ بالوزن / المجلد محلول حمض البيروكسي (PAS)، تحت غطاء الدخان إضافة 20 مل من حمض البيروكسي إلى 980 مل من منزوع الأيونات الماء (DI).
- لإعداد 1000 مل من 100 ملي تريس حل قاعدة (TBS)، إضافة 12.2 غرام من قاعدة تريس إلى 1000 مل من الماء DI ويقلب حتى يذوب تماما.
- تحضير محلول مخفف حمض الهيدروكلوريك (DHAS) في غطاء الدخان بصب 4 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 30 مل من الماء DI.
- شراء حوالي 20 غراما من قصاصات شعر الإنسان التي لم يتم معالجتها كيميائيا أو تغييرها. الشعر يمكن أن يكون أي طول.
- يغسل الشعر جيدا، من جهة، مع الماء الدافئ والصابون. استخدام منزوع الأيونات الماء (DI) للشطف النهائي.
- وضع الشعر الى قسمين 600 مل الأكواب ومكان في س 80 درجة مئويةفين لمدة 1 ساعة.
- استنزاف السائل من أسفل الكأس ووضعها مرة أخرى في الفرن حتى شعر جاف تماما.
- الفجوة تجفف الشعر بالتساوي بين 600 مل فنجان، وضع 10 غرام من الشعر في كل كوب. لا تسمح للشعر لملء أكثر من 500 مل.
- صب 500 مل من نظام تقييم الأداء في كل كوب مع التأكد من تغطية جميع من الشعر. تغطية الأكواب مع بارافيلم وتخزينها لمدة 12 ساعة.
2. إعداد كيراتين استخراج الحل
- فصل الشعر من نظام تقييم الأداء باستخدام منخل 500 ميكرون. جمع PAS النفايات في وعاء منفصل. شطف الشعر جيدا بالماء DI لإزالة أي بقايا نظام تقييم الأداء.
- وضع الشعر تشطف في قارورة 500 مل. صب 400 مل من TBS في قارورة، والتأكد من أن يتم تغطية الشعر. مكان دورق في حمام تهز مجموعة إلى 38 درجة مئوية، و 65 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
- بعد 1 ساعة، وإزالة من اهتزاز حمام وصب السائل، ما يقرب من 400 مل من محلول استخراج الكيراتين (KES)، طn لدورق 1000 مل.
- صب 400 مل من الماء DI في قارورة تحتوي على شعر ضمان أن يتم تغطية الشعر والمكان مرة أخرى في الحمام تهز لمدة 1 ساعة. إزالة قارورة من الحمام تهتز وصب 400 مل المتبقية من KES في دورق 1000 مل مع KES التي تم جمعها سابقا. لم يعد هناك حاجة للشعر، ويمكن أن تكون ملقاة خارج القارورة والتخلص في أقرب وعاء القمامة.
3. تركيز الكيراتين استخراج الحل
- ملء حمام rotodistiller إلى السطر العلوي مع الماء المقطر وتعيين إلى 90 درجة مئوية. ضبط سرعة دوران إلى 200 دورة في الدقيقة. تشغيل المبرد المبرد مضخة وتعيين إلى -10 درجة مئوية.
- باستخدام مقياس درجة الحموضة لمراقبة درجة الحموضة في KES، واستخدام ماصة لإضافة ببطء 1 ملم DHAS إلى KES حتى تصل درجة الحموضة 7.0. يحرك ببطء كما يتم إضافة الحل.
- صب KES تحييدها في 500 مل قارورة جولة القاع حتى حوالي ربع كامل. تشغيل التقطير وفقا لالصانعبروتوكول مقابل 1.25 ساعة.
- وقد تم استخلاص كرر الخطوة 3.3 حتى كل من KES. تأكد من أن قارورة متصل بإحكام.
4. غسيل الكلى من القرتين استخراج الحل
- صب حل KES بالتساوي إلى 12 أنابيب مخروطية 14 مل منفصلة. أنابيب الطرد المركزي في 1050 x ج لمدة 10 دقيقة.
- صب KES طرد في دورق نظيفة، والتأكد من أن تصب بعيدا عن الحطام التي تم جمعها. كرر حتى تم طرد كل من KES.
- ملء 2000 مل تخرج اسطوانة بالماء DI.
- خفض غسيل الكلى غشاء أنابيب السليلوز إلى 24 بوصة، وكليب واحدة من نهاية الأنابيب لأنه عقد مغلقة.
- تراجع طول الأنبوب في الاسطوانة من الماء DI لجعلها أكثر مرونة وأسهل لفتح.
- فتح نهاية غير قص الغشاء السليلوز غسيل الكلى أنابيب وتصب ببطء 60 مل من محلول KES طرد في أنابيب. استخدام مقطع آخر لإغلاق هذا نهاية الأنبوب.
- وضع ديأنبوب alysis في الاسطوانة 2000 مل من الماء DI والسماح للجلوس لمدة 24 ساعة. تغيير الماء DI في الاسطوانة كل 3 إلى 4 ساعات.
- بعد فترة 24 ساعة، تفريغ حل KES مدال في الجرار توج، ويجري التأكد من ترك مساحة في الجزء العلوي وضعها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
5. تجفيد من القرتين استخراج الحل
- تعيين مجفاد إلى -86 درجة مئوية.
- إزالة الجرار التي تحتوي المجمدة KES من الثلاجة، واتخاذ قبعات الخروج من الجرار، ووضعها في أمبولات مجفف تجميد. وضع الأختام على أمبولات وتحويل مقبض الباب لإنشاء ضغط الفراغ من 0.133 ميللي بار. يجفد العينات لمدة حوالي 48 ساعة حتى ذهب كل من الرطوبة.
6. إعداد حلول العزل الكهربائي (10٪ بالوزن كيراتين الحل)
- إزالة مسحوق قرنين من مجفاد وتزن عليه.
- إضافة الماء DI إلى مسحوق كيراتين لخلق الوزن 10٪ / الوزنحل الكيراتين.
7. إعداد 10٪ بالوزن PCL الحل
- الحصول على PCL (ε-caprolactone البوليمر، المنغنيز 70-90 كيلو دالتون)، وtrifluoroethanol (TFE). إعداد 10٪ من وزنها PCL في TFE عن طريق اثارة O / N والحصول على مزيج متجانس.
8. إعداد كيراتين / PCL الحل
- الحصول علي 10٪ بالوزن PCL حل معدة مسبقا وحل قرنين 10 وزن٪. إضافة الكيراتين إلى انخفاض حل PCL الحكمة من أجل خلق 10 مل PCL / حلول الكيراتين من 90:10، 80:20، 70:30، 60:40 و النسب.
- استخدام vortexer للحصول على خليط متجانس من حل PCL / كيراتين قبل العزل الكهربائي.
9. إنتاج Electrospun PCL / ألياف الكيراتين
- ضع حوالي 8 مل من PCL / حل قرنين في 10 مل حقنة واحدة مزودة 0.5 ملم أنبوب قطره البلاستيك. وضع حقنة في ضخ حقنة حيث يتم تعيين معدل تدفق ليكون 2.5 مل / ساعة.
- التفاف طبل جامع مع رقائق الألومنيوم قبل تشغيل العينة. تأكد من أن رقائق الألومنيوم هو مستقر من خلال تطبيق الشريط وضع العلامات على حد سواء.
ملاحظة: إن الألياف تتشكل على رقائق الألومنيوم (انظر الشكل 2)، وتخزين الألياف مغطاة احباط في RT.
10. تحليل الميكانيكية من PCL / كيراتين ألياف النانو
- قطع العينة إلى 60 مم 8 مم. تأكد من تسجيل سمك باستخدام ميكرومتر الرقمية. لكل تكوين إعداد، استخدم خمس عينات.
- إرفاق العينة 60 × 8 ملم في اختبار الشد. استخدام مصممة خصيصا صاحب العينة إرفاق العينة. شطيرة العينة بين أصحاب العينة التي تتم من بطاقة الرقم القياسي باستخدام مزدوجالشريط جانب. تطبيق الخلية 10 N الحمل بمعدل تشريد 10 مم / دقيقة.
ملاحظة: تم تصميم حامل العينة ليكون 62 مم 40 مم مع نافذة الداخلي 50 ملم بنسبة 38 مم. - تمديد تسجيل والقيم الحمل من خلال البرنامج وفقا لبروتوكول البرمجيات.
- حساب الإجهاد عن طريق قسمة القوة من قبل منطقة من العينة التي تم اختبارها. بعد ذلك، حساب سلالة بقسمة التغير في طول بواسطة طول الأولي.
- توليد منحنى الإجهاد والانفعال عن طريق التآمر التوتر في المحور ص لمقابلة قيمة الضغط في محور س.
- حساب معامل يونغ من المنطقة الخطية حيث يساوي المنحدر إلى معامل المرونة. تحديد قوة الشد من سلالة مؤامرة الإجهاد عن طريق أخذ 0.2٪ يقابلها في سلالة ورسم خط مواز لمنحنى المنطقة الخطية.
- إجراء التحليل الإحصائي للبيانات التي تم الحصول عليها الميكانيكية في ثلاث نسخ مسبقا باستخدام تحليل التباين الأحادي باستخدام برامج التحليل 8. القيم ف <0.05 نحنإعادة النظر في دلالة إحصائية.
11. سطح الصرف والهيكلية توصيف
- استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) مع المعلمات تسريع الجهد 15 كيلو فولت وتيار 5 أمبير لمراقبة التشكل من الألياف electrospun.
- قبل التصوير مع وزارة شؤون المرأة، وقطع 2 سم 2 القسم من الألياف ونعلق عليه إلى مرحلة SEM باستخدام شريط النحاس. وضع المسرح داخل المغطى تفل ومعطف مع الذهب عند 15 أمبير لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية لخلق طبقة الذهب حوالي 11 نانومتر سميكة. تحميل العينة إلى الغرفة ووزارة شؤون المرأة. مراقبة عينات من الألياف.
- استخدام تحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) لوصف الروابط الكيميائية بين PCL والكيراتين. وضع القسم 2 سم 2 من الغشاء electrospun ألياف نانوية في حامل المغناطيسي وتطهير النظام مع الهواء الجاف قبل إجراء الاختبار. الحصول على أطياف 200 بمسح وتحليل الأطياف باستخدام ستابرنامج ndard وفقا لبروتوكول البرمجيات.
- لتحليل الطيف باستخدام البرمجيات القياسية واستخدام يثلث من كل نسبة ألياف نانوية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
دراسة 12. التفاعل الخلوي الألياف
- قطع الألياف إلى 16 مم 2 العينات. استخدام حيويا، القائمة على السيليكون الغراء لإصلاح كل عينة لcoverslips التي يبلغ قطرها 12 ملم.
- الغراء واحدة من نهاية عينة من الألياف إلى الجزء الخلفي من انزلاق الغطاء، والتفاف العينة حول ساترة، ثم الغراء نهاية خالية من العينة إلى الجزء الخلفي من انزلاق الغطاء كذلك، وترك الجزء العلوي من زلة مغطاة فقط عينة من الألياف.
- وضع عينات من الألياف في 24 لوحة جيدا. تعقيم العينات عن طريق غمر في 80٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة.
- شطف الإيثانول من العينات باستخدام المياه DI. ثم، ماصة 2 مل من المتوسط القاعدية على العينات، مع التأكد من تغطية العينة كلها. إزالة المتوسطة بعد 5 دقائق.
- استخدام الخلايا الليفية 3خلايا T3 إلى البذور وعينات من الألياف. تعليق الخلايا في المتوسط تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع المضادات الحيوية و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) حتى لا يكون هناك ما يقرب من 62000 خلية / سم 2 في 1 مل من DMEM.
- إسقاط 1 مل من التي تحتوي على الخلايا حل 3T3 DMEM في كل لوحة جيدا ضمان أن يتم تغطية كل عينة الألياف مع ما يقرب من 62000 خلية / سم 2. احتضان لوحات جيدا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. ملاحظة: استخدام 5٪ CO 2 لهذا المستوى يمكن عادة الحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام خلية في نطاق الفسيولوجية لعدة أيام.
13. تدهور ألياف نانوية مصفوفة
- قطع المجففة PCL / الأغشية ألياف نانوية الكيراتين في مربع حوالي 30 ملم × 30 ملم.
- تعقيم 900 مم 2 العينات مع 80٪ من الكحول لفترة حضانة 10 دقيقة ويغسل جيدا بالماء DI. احتضان العينات في 15 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.5، في 37 درجة مئوية. استبدال BUFفر كل 3 أيام.
- خذ الأغشية من الحل في فترات زمنية محددة، 1 أسبوع و 7 أسابيع، ويشطف بالماء DI.
- وضع العينات الغشاء في أمبولات مجفف تجميد. وضع الأختام على أمبولات وتحويل مقبض الباب لخلق فراغ. يجفد لمدة 24 ساعة، حتى تجف تماما.
- إرفاق العينة المجففة إلى مرحلة SEM باستخدام شريط النحاس. وضع المسرح داخل المغطى تفل ومعطف مع الذهب عند 15 أمبير لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية.
- تحميل العينة إلى الغرفة ووزارة شؤون المرأة. مراقبة عينات من الألياف في الجهد تسريع 1.5 كيلو فولت أمبير و 5 الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الألياف الصرف
تم الحصول على الصور ووزارة شؤون المرأة من الألياف لجميع مكونات الألياف. انظر الشكل 3. صورة الألياف تؤكد أن الألياف وتوجه بشكل عشوائي.
اختبار الميكانيكية
ميكانيكيا وعادة ما يطلب ألياف قوية لمختلف التطبيقات هندسة الأنسجة. وينبغي لهذه الألياف تحتفظ بما يكفي من القوة والمرونة تحت ضغط معين والظروف البيئية 9. عموما، فإن المطلوب من الدعائم لديك الرجوعية وثيقة لذلك من النسيج المستهدف لتجنب أي إجهاد يحمي الآثار والحفاظ على ما يكفي من القوة خلال في الجسم الحي و / أو في نمو الخلايا في المختبر 10. تم استخدام اختبار الشد لقياس معامل يونغ وكسر قوة من الألياف. معامل الشباب (باسكال) من PCL / الكيراتين في نسب 100: 00، 90:10، 80:20، 70:30 و ثكما تبين أن 10 ± 2، 8 ± 1، 5 ± 1.5 و 4.5 ± 1.6، على التوالي 4. وبالمثل، وكسر قوة (ميغاباسكال) من PCL / الكيراتين في نسب 100: +00، 90:10، 80:20، 70:30، ووجد أن 3 ± 1.2، 2 ± 0.5، 1 ± 0.2، و 1 ± 0.3 على التوالي 4 كما يتضح من الجدول 1 الشكل 4 يعرض الاتجاه رسومية من الاختلاف من معامل يونغ مقابل نسب PCL.keratin. خط الترند في المساعدات الرسم البياني في زيادة فهم معدل استطالة كسر.
الهيكلي والمورفولوجية توصيف
في الشكل 5، FTIR النفاذية الأطياف لPCL / ألياف النانو مركب الكيراتين تظهر العصابات في 2950 سم -1، 1050 سم -1، و1،240 سم -1 بسبب الاهتزازات تمتد غير المتكافئة من CH 2، أول أكسيد الكربون وCOC مجموعات، على التوالي. ذروة امتصاص الكربونيل في 1720 سم -1 ثاt غير سمة من سمات PCL هي أيضا واضحة 4،11. عصابات امتصاص في (3286 سم -1)، (3056 - 3075 سم -1)، (1600 - 1700 سم -1)، (1480 - 1580 سم -1)، و (1220 - 1300 سم -1) تدل على الكيراتين البروتينات. وقد دلت على العصابات وأميد A، B، الأول والثاني، والثالث على التوالي.
العصابات والقمم الحالية في التغيير FTIR أطياف مع زيادة تركيز الكيراتين في المركب. مظهرهم يدل على وجود والتشكل الهيكلي سلاسل الكيراتين، ومع ذلك، فإن التفاعلات بين القمم وشرائح لم يسبب بعض الصعوبات. على سبيل المثال، أميد أنا الفرقة الحاضر في 1600 - وعادة ما تستخدم 1700 سم -1 لدراسة الكيراتين، ومع ذلك، فإن الفرقة مشوهة قليلا من ذروة PCL. لحسن الحظ، فإن الفرقة أميد الثاني تكفي لإثبات وجود قرنين، التشكل سلسلة قرنين، والتفاعلات الترابط بين PCL ومجموعة الكيراتين وظيفية.
خلية الألياف التفاعل
باستخدام المجهر الإلكتروني ودرس التفاعل خلية من الألياف. ويبين الشكل (6) والصور SEM من الخلايا الليفية 3T3 التي كانت تربيتها على عينات ألياف نانوية لمدة 24 ساعة. التصاق الخلايا إلى عينات ألياف نانوية مرئيا ويظهر أن أرجل كاذبة خيطية الخلية تميل إلى اتباع محاذاة ألياف النانو عندما كانت متشابهة في قطر. تم تنفيذ ألمار الأزرق (AB) فحص لتحديد جدوى 3T3 الخلايا في الألياف. AB هو ريسازورين الكيميائية. هذه الصبغة غير فلوري يدخل الخلايا الحية، reductases الميتوكوندريا يقلل ريسازورين إلى resorrufin وهو الوردي والفلورسنت. لم يكن هناك اختلاف كبير في مستويات سمية من نسب مختلفة من PCL / الكيراتين.
< ر /> الشكل 1. صور من عملية الكيراتين استخراج (A) تنظيف الشعر البشري قبل استخراج؛ (ب) الشعر بعد استخراج قرنين. (C) الكيراتين استخراج الحل. (D) المجففة بالتبريد مسحوق الكيراتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. كاميرا رقمية صور من ألياف Electrospun. صور من حيث الألياف توليفها من CL / الكيراتين مع نسب مختلفة تم جمعها على رقائق الألومنيوم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ه 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53381 / 53381fig3.jpg "/>
الشكل 3. الصور ووزارة شؤون المرأة من PCL / قرنين ألياف النانو. (AC) وصور من ألياف النانو نسج من الحلول مع PCL / نسب الكيراتين من 70:30، 80:20، 90:10 و، على التوالي. وإدراجات تظهر الصور التكبير أعلى من كل صورة SEM المقابلة. الصور SEM (DF) و (GI) تمثل الألياف هو مبين في الصور (AC) بعد الاختبارات تدهور 1- و7 أسابيع، على التوالي. شريط النطاق في إدراجات يمثل 500 نانومتر (انظر جدول نقابة المحامين في صورة C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. رسم بياني لمعامل مقابل نسب PCL / الكيراتين. رسم بياني للتركيز الكيراتين مقابل يونيظهر ز في معامل الاتجاه رسومية من الاختلاف من معامل يونغ. المساعدات خط الاتجاه في فهم كسر معدل استطالة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. FTIR أطياف PCL / ألياف النانو الكيراتين مع نسب مختلفة. الطيف يؤكد الترابط من PCL إلى الكيراتين. ذروة الرئيسية تقاس في 1722 سم -1 يوافق مع القياسات الأساسية القياسية من الفرقة امتصاص PCL ومرئيا في كل الأطياف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. SEM صور عرض مورفولوجية 3T3 الخلايا الليفية المصنف على PCL / الكيراتين ألياف نانوية غشاء. صور A، B و C تمثل PCL / الكيراتين مع نسب 90/10، 80/20، 70/30 و، على التوالي. الصور (A)، (B)، و (C ') هي أعلى صور التكبير من (أ) و (ب) و (ج)، على التوالي. المناطق الداكنة في الصور تدل على مكان وكل الخلايا الليفية تعلق على رأس وطوال تضاريس ألياف نانوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نسب | معامل يونج (الأم) | كسر قوة (الأم) |
| 100/0 | 10 ± 2 | 3 1.2 ± |
| 90/10 | 8 ± 1 | 2 ± 0.5 |
| 80/20 | 5 ± 1.5 | 1 ± 0.2 |
| 70/30 | 4.5 ± 1.6 | 1 ± 0.3 |
الجدول 1. الخواص الميكانيكية لPCL / ألياف الكيراتين
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تحقق استخراج الكيراتين من الشعر البشري بنجاح. حمض البيروكسي تصرفت باعتبارها عامل مؤكسد على شعرة الإنسان، والسماح للالكيراتين سيتم استخراجها من قاعدة تريس. كان إنتاج مسحوق قرنين على نطاق صغير يرجع ذلك إلى حقيقة أن تم القيام به فقط لأغراض البحث. وقد تم بالفعل تأسيس هذا الإجراء في صناعة لإنتاج على نطاق واسع. وكان الغرض من استخراج الكيراتين على نطاق صغير للسيطرة على التلوث، وتقلب دفعة، والفعالية من حيث التكلفة.
استخراج الكيراتين هو الحد خطوة من هذا الإجراء. العائد من مسحوق قرنين منخفض جدا، 0،7-2٪. 20g من الشعر البشري أسفرت ،14-0،4 ز الكيراتين. خطوة حاسمة أخرى في إنتاج الألياف electrospun بصياغة حل غير مناسبة للالعزل الكهربائي. وقد فرقت الكيراتين بسهولة في الماء DI، ومع ذلك، على العزل الكهربائي، والحل الكيراتين / المياه لم تسفر عن تشكيل الألياف. لتوفير م ضروريوقدم التفاعلات olecular لإنشاء ألياف النانو كوبوليمر إلى الحل. PCL الذائبة في TFE، كان قادرا على التفاعل بقوة أكبر مع الكيراتين من خلال الرابطة الهيدروجينية. كان TFE مسؤولة إلى حد كبير عن استقرار المجمعات البوليمرات بسبب الكهربية والسلوك الحمضي.
خلط الحل قرنين مع الحل PCL تطرح تحديات جديدة بسبب حقيقة ان PCL أنه من المعروف أن مسعور في حين يعرف الكيراتين أن تكون محبة للماء. كما قمنا بزيادة نسبة الكيراتين كان من الصعب الحصول على مزيج متجانس. تم حل هذه المشكلة عن طريق إضافة الكيراتين انخفاض الحل الحكيم إلى حل PCL، وvortexing لذلك يدويا لمدة 30 دقيقة.
تظهر الصور ووزارة شؤون المرأة مورفولوجيا سطح الممتاز الذي يعتبر مثاليا لنمو الخلايا وانتشارها. تظهر نتائج FTIR المقارنة امتزاج جيد بين PCL والكيراتين في ألياف electrospun. قد يكون بسبب الجزيئات الهيدروجين ب هذاonding بين PCL والكيراتين. وثمة عامل آخر هو السرعة التي الألياف electrospun ترسيخ منع تجميع PCL في الخليط. تتم المحافظة على السلامة الهيكلية والميكانيكية عن طريق التفاعلات الجزيئية بين PCL والكيراتين، مما يجعل من مادة مناسبة لتطبيقات الطب التجديدي. تم العثور على هذه الألياف electrospun أن يكون الرجوعية الشباب تغلق أن من النسيج الأصلي. ميكانيكيا الألياف قوي قادر على دعم التصاق الخلية والانتشار. أظهرت ألياف النانو / كيراتين PCL التوحيد جيدة، السلامة الهيكلية، خصائص ميكانيكية مناسبة، والتوافق الخلوية. تم العثور على 00، 90:10، 80:20، 70:30 و لتكون 10 ± 2، 8 ± 1، 5 ± 1.5 و 4.5 ± 1.6، على التوالي: معامل يونج (الأم) لPCL / الكيراتين في نسب 100 . انخفضت الرجوعية أنها نسبة الكيراتين المضافة زادت. التصاق الخلية والانتشار على PCL / الألياف الكيراتينية يؤكد أن الألياف ليست سامة وتوفر الدعم لنمو الخلايا.نمو أرجل كاذبة خيطية على طول ألياف النانو يشير التفاعل الايجابي وبين الخلايا الليفية وألياف PCL / الكيراتين.
تم استخدام تقنية العزل الكهربائي بنجاح لتجميع PCL / ألياف النانو كيراتين مقرها. هذه التقنية، على عكس الطرق الأخرى القائمة، وقد ثبت أن تكون موثوقة وفعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن تستخدم في إنتاج ألياف نانوية على نطاق واسع. من هذه الدراسة، فإننا نستنتج أن السقالات nanofibrous المركبة PCL / قرنين يؤسس لديها القدرة على أن تستخدم في التطبيقات الطبية الحيوية وECM الطبيعي تقليد لتطبيقات هندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
سيكون الكتاب أود أن أشكر مؤسسة الوطنية للعلوم من خلال مركز بحوث الهندسة لالحيوية المعدني ثورة في (ERC-0812348) وتقنية النانو الجامعية التعليم (EEC 1242139) لتمويل الدعم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Hair | Obtained from Local Barber Shop in Greensboro | ||
| Peracetic acid | Sigma Aldrich | ||
| PCL (e-caprolactone polymer) | Sigma Aldrich | 502-44-3 | Mn 70-90 kDa |
| Trifluoroethanol (TFE) | Sigma Aldrich | 75-89-8 | |
| Tris Base (TrizmaTM Base Powder) | Sigma Aldrich | >99.9% crystalline | |
| Hydrochloric Acid | Fischer Scientific | A144C-212 Lot 093601 | Waltham, MA |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | Sarasota, FL | |
| Cellulose membrane | Sigma Aldrich | 12 - 14 kDa molecular cut off | |
| optical microscope | Olympus BX51M | BX51M | Japan |
| scanning electron microscope | Hitachi SU8000 | SU8000 | Japan |
| Table-Top Shimadzu machine | North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series | AGS-X Series | Columbia, MD |
| Fourier transform infrared spectroscopy | Bruker Tensor 2 Instrument | Billerica, MA | |
| Microcal Origin software | Northampton, MA | ||
| X-ray diffraction (XRD) | Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer | Madison, WI | |
| Fibroblast 3T3 cell | American Tissue Type Culture Collection | Manassas, VA | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM | Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Spectra max Gemini XPS microplate reader | Molecular Devices | Sunnyvale, CA | |
| Student- Newman-Keuls post hoc test | SigmaPlot 12 software |
References
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).
- Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications. J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).
- Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence. Biochem J. 236, 705-712 (1986).
- Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata. J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).
- Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds. Tissue E. 6, 605-617 (2000).
- Fortin, M. -J.
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue E. 7, 679-689 (2001).
- Bhattarai, N., et al. Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications. Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).
