Abstract
Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er en førende årsag til synshandicap i den udviklede verden. Sygdommen manifesterer sig ved ødelæggelsen af centrum af nethinden, kaldet macula, hvilket resulterer i tab af det centrale syn. Tidlig AMD er karakteriseret ved tilstedeværelsen af små, gullige læsioner såkaldte bløde drusen, der kan udvikle sig på slutningen af AMD såsom geografisk atrofi (tør AMD) eller neovaskularisering (våd AMD). Selvom de kliniske ændringer er godt beskrevet, og forståelsen af genetiske påvirkninger af overdragelse AMD risiko bliver stadig mere detaljeret, et område der mangler store fremskridt er en forståelse af de biokemiske konsekvenser af genetiske risiko. Dette skyldes til dels problemer med at forstå biokemi Bruchs membran, en meget tynd ekstracellulære matrix, der fungerer som et biologisk filter af materiale fra blodforsyning og et stillads, hvor den retinale pigment epitel (RPE) cellemonolaget bor. Drusen form inden Bruchs membran og deres tilstedeværelse forstyrrer næringsstoffer flow til RPE celler. Kun ved at undersøge protein sammensætning Bruchs membran, og faktisk hvor andre proteiner interagerer med det, kan forskerne håber at opklare de biokemiske mekanismer der ligger til grund drusen dannelse, udvikling af AMD og efterfølgende synstab. Dette papir beskriver metoder til berigelse enten hele Bruchs membran, eller bare fra macula regionen, så den kan bruges til nedstrøms biokemisk analyse, og giver eksempler på, hvordan det er allerede ændre forståelsen af Bruchs membran biokemi.
Introduction
Brugen af post mortem øjenvæv menneske i oftalmologiske forskning er en uvurderlig ressource for forståelsen af øjensygdom patogenese. Analyse af human donor øjne har ydet vigtige bidrag til kræsne de mekanismer der ligger til grund aldersrelateret makuladegeneration (AMD), som er den hyppigste årsag til blindhed i den vestlige verden 1. Globalt AMD tegner sig for ca. 8,7% af al blindhed og med en stadig mere aldrende befolkning, er det forventes at påvirke 196 millioner mennesker i 2020 2. AMD resulterer i tab af det centrale syn og har en dybtgående indvirkning på patientens uafhængighed og livskvalitet 3. Tidlig AMD er karakteriseret ved dannelsen af drusen og det kan udvikle sig til geografisk atrofi (undertiden benævnt "tørre" AMD), eller choroideaneovaskularisering (også benævnt neovaskulær eller "våde" AMD). Mens anti-VEGF injektioner kan stabilisere eller forbedre vision i neovaskulær AMD det jeger ikke helbredende, og på nuværende tidspunkt, findes der ingen behandling for geografisk atrofi.
Mens visse genetiske varianter har vist sig at ændre AMD risiko 4 - 8, er mindre kendt om, hvordan disse varianter påvirker macula på et biokemisk niveau. Et vigtigt sted i AMD patogenese er Bruchs membran. Drusen form inden denne struktur og forskellige undersøgelser har fremlagt dokumentation for komplement aktivering i og omkring Bruchs membran i AMD 9. Bruchs membran er et ark af ekstracellulær matrix, der adskiller de retinale pigment epitel (RPE) celler fra årehinden, og er ca. 4 um tyk. Bruchs membran fletter ind i choriocapillaris, et lag af årehinden, der indeholder fenestrerede kapillærer og uden for denne er lag indeholdende større blodkar 10 (figur 1A).
Bruchs membran er en pentilaminar ark ekstramatrix (ECM), og denne metode detaljer hvordan man isolerer Bruchs membran, sammen med ECM af de underliggende choriocapillaris (herefter benævnt beriget Bruchs membran), hvilket stort set decellulariserede og fri for røde blodlegemer. Enriched Bruchs membran blev derefter anvendt til Western blotting og histologiske forsøg. Endvidere beskrives metode til at berige Bruchs membran alene fra macula område af øjet, hvilket vil være af særlig interesse for dem at undersøge de biokemiske aspekter af AMD.
Protocol
Humant øjenvæv samtykket til forskningsformål blev opnået fra Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank efter fjernelse af hornhinden til transplantation. Brugen af humant væv til forskning var i overensstemmelse med den menneskelige lov Tissue (2004) retningslinjer, og med Universitets Forskningsfond etiske komité godkendelse (referere 11305).
1. Berigelse af Whole Bruchs membran
- Rengør arbejdsområdet omkring og under dissektionsmikroskop med 1% desinfektionsmiddel (v / v) og derefter tørre ned med 70% (v / v) ethanol.
- Sikre følgende er ved hånden: en ny engangs skalpel, to sterile celle skrabere (almindeligvis anvendes i vævskultur) og tre par pincet (opført her som A, B, og C, se materialer liste).
- Placer øjeæblet i en engangs petriskål, fastholde låget til senere brug. Ved hjælp af en ny engangs skalpel, fjerne eventuelle synsnerven, hvilket kan forstyrre skabe en flad moUNT af vævet. Dernæst gør fire indsnit samme afstand fra hinanden for at skabe fire kvadranter, hvis du fortsætter til del 3 (berigelse af makulært Bruchs membran) ikke skære gennem den gule plet regionen.
- Sikre, at indskæringerne strækker sig gennem hele dybden i øjenvæv - fra den inderste neurosensoriske nethinde (NSR), gennem årehinden og sclera (hvide i øjet). Fortsæt snittet hele vejen rundt om øjet fra margenen af øjestykket til synsnerven. Dette vil gøre det muligt øjestykket skal fladet ud (se figur 1B).
- Holding en kvadrant af fladtrykt øjestykket hjælp pincet A (for at forhindre årehinden løsrivelse), skal du bruge større pincet B at gribe glaslegemet og underliggende NSR og træk dette væv væk fra retinale pigment epitel (RPE) starter ved periferien, bevæger sig mod centrum af den åbnede øjestykket og derefter til den modstående side. Normalt, men ikke altid både glaslegemet og NSR løsnes som én. Brug scalpel til udskæring enhver resterende NSR forankret på den optiske disk.
- Igen, mens du holder en kvadrant af væv på plads ved hjælp af pincet A, bruge sterile celleskraber til forsigtigt løsne RPE monolag fra hele indersiden af øjestykket. Disse celler let løsnes og kan ses som mørke brune pigmenterede klumper. Skyl med PBS til forsigtigt at vaske væk løsnes RPE celler fra øjestykket.
- Dernæst bruge pincet A til forsigtigt skrælle overliggende mørkerød væv (omfattende både Bruchs membran og årehinden) fra alle 4 kvadranter øjet. Placer udskårne væv i en ren skål.
- Brug af den udfladede kant af en celle skraber til at holde udskårne væv på plads, bruge den anden skraber til at skrabe forsigtigt vævet. Vend vævet og gentage, at fjerne så meget overskydende materiale som muligt. Til sidst vil en gennemskinnelig membran forbliver: dette er groft beriget Bruchs membran. Anvendelsen af dissektionsmikroskop til mindst 20X forstørrelse erafgørende i medvirken fjernelsen af choroid og berigelse af Bruchs membran.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, kortvarigt skyl Bruchs membran med ultrarent vand for at fjerne resterende årehinden og blod før placere membranen i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Suspendere beriget Bruchs membran i ca. 1 ml ultrarent vand og vortex kortvarigt (ca. 15 sek) for at hjælpe lysere eventuelle kontaminerende cellulære stof (se figur 2). Centrifugeres prøven ved 500 x g i 30 sek for at pelletere membranen og aspireres supernatanten.
Bemærk: Den resterende beriget Bruchs membran er nu klar til solubilisering (som beskrevet i afsnit 2 nedenfor) eller opbevaring ved -80 ° C til senere brug.
2. Opløsning af Whole beriget Bruchs membran og Western blot-analyse
- Uddrag protein fra beriget Bruchs membran ved at nedsænke vævet i 500 pi 8 M urea i 6 timer ved stuetemperatur i 1,5 ml mikrocentrifugerør (figur 3A).
- Centrifuger solubiliserede prøver ved 10.000 xg i 10 min for at pelletere eventuelle resterende ekstracellulære spørgsmål. Fjern supernatanten og overføre den til 3.500 Da MWCO dialysemembran, og derefter placere prøven i 1 liter PBS til dialyse i 16 timer ved 4 ° C.
- For hver prøve, der tilsættes 40 pi proteinisolerings- perler og rotere prøven / bead mix (20 rpm på en roterende mixer) ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Centrifuger prøverne ved 10.000 xg i 5 min for at pelletere kuglerne. Fjern supernatanten og opløseliggøre protein bundet til perler i 30 pi 2 x prøvepåsætningsbuffer (65,8 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (vægt / volumen) glycerol, 0,01% bromphenolblåt, 3% β-mercaptoethanol).
- Inkuber prøverne ved 100 ° C i 10 minutter, og derefter centrifugeres ved 10.000 xg i 5 min for at pelletere de resterende perler.
- Indlæse supernatanten, der indeholder de frigivne proteiner på en forud støbt SDS-side gradient gel (se materialer listen) for protein separation.
- Visualisere adskilte proteinbånd ved hjælp af en fælles farvningsprotokol, f.eks Coomassie blå.
- Kort sagt, tilsættes 20 ml af brilliant blå farve (0,1% brilliant blue (w / v), 50% methanol, 10% eddikesyre, 40% vand) til gelen, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring .
- Kassér farvningsopløsning og vask den farvede gel med deioniseret vand, indtil baggrundsfarvning reduceres tilstrækkeligt til at tillade farvede proteinbånd visualisering.
- Alternativt overførsel adskilt proteinbånd til nitrocellulose til Western-analyse, som beskrevet nedenfor.
- Transfer adskilt proteinbånd på nitrocellulosemembran ved 80 mA i 2,5 timer under anvendelse af halvtør overførsel apparat transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 10% [v / v] methanol).
- Blokere membranen i 10 ml PBS, 10% (w / v) mælk og 0,02% (w / v) BSA i 16 timer ved 4 ° C før the tilsætning af de ønskede primære antistoffer til protein detektion.
Bemærk: Som et eksempel her, figur 3C viser et repræsentativt immunoblot af solubiliseret Bruchs membran fra tre separate donorer probet for en regulator af komplementkaskaden, faktor H-lignende protein 1 (FHL-1).
3. Berigelse af Macula Bruchs membran
- Følg trin 1.1 - 1.3 som tidligere beskrevet.
- Mens NSR er stadig på plads, lokalisere den gule farve foveal der repræsenterer centrale macula region (se figur 4). Ved hjælp af en steril 6 mm biopsi punch, placere den over det foveale regionen og fast klippe i den gule plet.
- Holde biopsitang på plads, foretage en særskilt snit med en skalpel fra kanten af øjestykket til kanten af biopsi stansestempelsnitplade, og derefter bruge pincet B, skalle det omgivende øjet materiale for at opnå en ren biopsi.
- Ved hjælp af pincet C, fjern6 mm plade af væv fra dornen og sted på den rene petriskål låget. Placer petriskål låget og makulært dorn under dissektionsmikroskop.
- Fjern den tynde NSR disken (tjek for gul foveal farvning at udlede nøjagtigheden af biopsi). Brug en steril celle skraber til forsigtigt at fjerne RPE celler.
- Fastgør makulært disken via sclera hjælp spidsen af pincetten A, og langsomt skalle årehinden og Bruchs membran kompleks hjælp pincet C. Igen anvender cell skraber til at fjerne uønsket årehinden og blod stof fra Bruchs membran.
- Placer makulært Bruchs membran i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og den suspenderes i 1 ml ultrarent vand. Vortex kortvarigt (ca. 15 sek) for at hjælpe lysere noget forurenende cellemateriale. Centrifugeres prøven ved 500 x g i 30 sek for at pelletere membranen og aspireres supernatanten.
Bemærk: Den berigede Bruchs membran isoleret fra macula kan nu bruges til en proteomiskANALYSE hjælp brugerens foretrukne fordøjelse protokoller.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokol til at producere beriget Bruchs membran resulterer i isoleringen af Bruchs membran, ECM af choriocapillaris og fjerner de fleste af de celler / cellerester herunder alle RPE (figur 2). Vask af beriget Bruchs membran i vand er et vigtigt skridt i lyse eventuelle resterende choroidale celler. Presset ved skrotning af årehinden synes at komprimere nogle af de få tilbageværende cellekerner i regionen defineret som Bruchs membran (figur 2B).
Solubilisering af beriget Bruchs membran tillader nedstrøms analyse af proteinindhold. Adskillelsen af proteinbånd fra solubiliseret beriget Bruchs membran under anvendelse af en 4 - 12% gradient SDS-PAGE-gel, mens ikke anvendelige i sig selv at identificere proteinindhold, gør demonstrere evnen af denne teknik for at minimere kontaminerende blodproteiner, der are non-specifikt bundet (figur 3B). I denne henseende en bemærkelsesværdig fraværende fra proteinet gel løb er en betragtelig bånd af humant serumalbumin (~ 66 kDa), som ellers kan gøre efterfølgende Western blotting vanskeligere at fortolke: den histologiske analyse af beriget Bruchs membran vist i figur 2 understøtter også denne. Faktisk som en del af arbejdet beskrevet tidligere 11, opløst Bruchs membran fra en række individuelle donorer blev probet for en række proteiner under anvendelse af specifikke antistoffer via Western blotting (figur 3C). I det viste tilfælde her, et antistof (betegnet OX23) 12 rettet mod et 155 kDa regulator af medfødte immunitet, kaldet komplement faktor H (FH), blev anvendt og viste tilstedeværelsen af en lavere molekylvægt bånd i Bruchs membran prøver fra tre separate donorer (figur 3C). Dette viste efterfølgende at være faktor H-lignende protein 1 (FHL-1), En 49 kDa protein relateret til FH og som følge af en splejsning variation af det samme gen 13. FHL-1 synes at være den vigtigste supplement regulator til stede i Bruchs membran 11.
Figur 1. Dissektion af det menneskelige øje og Berigelse af Bruchs membran. (A) Bruchs membran er en ekstracellulær matrix barriere. Årehinden indeholder et lag af fenestrerede kapillærer, der kontinuerligt går over i Bruchs membran (kaldet choriocapillaris), og disse adskille resten af årehinden (indeholdende store blodkar) fra det retinale pigment epitel (RPE) cellemonolag, som fysiologisk støtter fotoreceptorcellerne af neurosensoriske nethinde (NSR). (B) Fire indsnit i den menneskelige øjestykke bliver gjort så den kan åbnes for at skabe en flad mount. Deglaslegemet kan fjernes med anvendelse af en pincet. NSR kan komme ud sammen med glaslegemet, men kan også fjernes med en pincet. En celle skraber anvendes til at fjerne RPE cellelaget fra Bruchs membran, mens det stadig er forankret til årehinden og sclera. Den Bruchs membran / choroidea-komplekset kan skrælles væk fra sclera og ved hjælp af en ny celle skraber, kan den ydre årehinden fjernes. En endelig vask i ultrarent vand lyserer eventuelt resterende cellulære materiale. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Histologi af Bruchs membran og årehinden. H & E-farvede sektioner før (A) og efter (B) skraber de ydre choroiodale strukturer fra Bruchs membran og vask i ultrarent water at generere beriget Bruchs membran. Scale søjler repræsenterer 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Solubilisering af beriget Bruchs membran til Protein Content Analysis. (A) Protein kan ekstraheres fra berigede Bruchs membran ved inkubering i 8 M urinstof i 6 timer ved stuetemperatur, før den blev dialyseret mod PBS. Til Western analyse kan proteiner fra hele Bruchs membran dialysat isoleres ved anvendelse proteinisolerings- perler og elueres ved kogning med Laemmli reducere prøvepåsætningsbuffer. (B) En repræsentant Coomassie-blåfarvede SDS-PAGE-gel, der viser både pæne og fortyndet solubiliseret Bruchs membran (BM) ved anvendelse af fremgangsmåden d. escribed i (A) (C) En repræsentant western blot af opløst Bruchs membran fra 3 individuelle donorer (bane 1 - 3). undersøgt for faktor H-lignende protein 1 (FHL-1) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Isolation af beriget Bruchs membran fra Macula. Den gule plet område af nethinden er en 5 mm område, der let kan identificeres af den gule farvning af det overliggende fovea, og dens nærhed til den tilstødende optisk disk. Brug af fovea som en guide, placere en 6 mm biopsi punch på den flade monteret menneskelige øje at udskære en 6 mm macula væv blok. Fjern den overliggende NSR og skrabe RPE celler fra det udskårne gule plet. De resterende Bruchs membran / choroidea komplekst kann blive skrællet væk fra sclera og grundigt skrabet for at fjerne årehinden, lyse resterende cellulært materiale ved nedsænkning i ultrarent vand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her beskriver vi berigelsen af Bruchs membran til yderligere analyse tillader efterfølgende analyser herunder western blotting 11, massespektrometri og udbredelse egenskaber Bruchs membran under anvendelse af modificeret Ussing kamre 11,14. Kritiske trin omfatter a) grundig skrabning og vask af den indre overflade af øjet for at fjerne alle RPE B-celler) den gentagne og omhyggelig skrabning af den underliggende choroid uden at forårsage Bruchs at gå i opløsning og c) vask af den udskårne Bruchs i ultrarent vand at sikre lysis af tilbageværende celler. Desuden, hvis den berigede Bruchs membran skal anvendes til proteomanalyse, protein ekstraktion med urinstof behandling er den mest effektive til at nedbryde denne elastiske væv sammenlignet med andre fremgangsmåder, såsom mekanisk homogenisering. Histologi af beriget Bruchs membran angiver ECM af choriocapillaris er ikke fjernet. Dette er for at være exventet som det ydre lag af pentilaminar Bruchs membran er dannet af choriocapillaris endotelcelle-basalmembraner. Faktisk kan det være fordelagtigt, at ECM af choriocapillaris forbliver som der sker ændringer i det i AMD herunder deposition af terminalen komplementkompleks / membran (MAC) 15. Det skal bemærkes, at for detaljeret histologisk analyse af Bruchs membran, dets struktur ville være bedre bevaret, hvis snit i nærvær af sclera, choroidea og Bruchs membran. Faktisk er histologi præsenteret i figur 2 udelukkende til formål at demonstrere graden af berigelse som følge af teknikken beskrevet i dette manuskript.
Berigelse af makulært Bruchs kræver omhyggelig dissektion af øjestykket, der sikrer, at NSR og især fovea ikke beskadiges; ellers identifikation og dermed isolering af macula er ikke mulige. Integriteten af tissue er også vigtigt at denne proces, og det anbefales derfor, at prøverne under 48 timer post mortem tidspunkt anvendes. Graden af berigelse kræves varierer mellem donorer og kan påvirkes af donor alder, post mortem tid, og tilstedeværelsen af en hvilken som helst øjet patologi. Brugen af udtrykket beriget er bevidst i at anerkende en begrænsning af den teknik, hvilket er at "rensning" eller "isolation" af Bruchs membran ved hjælp af denne metode er simpelthen ikke muligt. I betragtning, at ECM af choriocapillaris går over i Bruchs membran der fuldstændig adskillelse ikke er mulig.
Er vigtigt at forstå øjensygdom progression forstå de biokemiske forandringer af de respektive øjenvæv. Denne unikke berigelse af Bruchs membran letter denne forståelse; igangværende studier undersøger proteom af beriget makulært Bruchs membran under anvendelse af massespektrometri på forskellige stadier af AMDog i prøver stammer fra individer med forskellige genotyper at forbedre forståelsen af den molekylære patologi for AMD. Allerede her beskrevne teknik er blevet anvendt til at identificere FHL-1 som den dominerende supplement regulator i membran 11 og yderligere undersøgelser Bruchs på beriget Bruchs membran vil sandsynligvis resultere i flere nye indsigter i den molekylære patologi AMD.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Isaac Zambrano og personalet på Manchester Eye Hospital Eye Bank for levering af human donor øje væv, og Mr. Pete Walker fra Det Biovidenskabelige Fakultet Histologi facilitet for H & E-farvede billeder. Særlig tak går til Mr. Roger Meadows for hans hjælp med mikroskopi. SJC er en modtager af en Medical Research Council (MRC) Karriereudvikling Fellowship (MR / K024418 / 1) og forfatterne også anerkender andre nylige forskningsmidler fra MRC (G0900538 og K004441), Kæmp for Sight (1866) og The Macula Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auxillary objective 0.5X | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
| Biopsy Punch 6 mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
| Bovine serum albumin | Sigma - Aldrich | A3059 | |
| Bromophenol Blue | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
| CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
| Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
| Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma - Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
| (A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100 mm) and straight |
| (B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample |
| (C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
| Glycerol | Sigma - Aldrich | G1345 | |
| Glycine | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
| Methanol | Sigma - Aldrich | M/4000/17 | |
| Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
| Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90 mm, used as a dish for samples |
| Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T3253 |
References
- Coleman, H. R., Chan, C. -C., Ferris, F. L., Chew, E. Y.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Coleman, A. L., et al. Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures. Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).
- Hageman, G. S., et al. A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 385-389 (2005).
- Haines, J. L., et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 419-421 (2005).
- Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 421-424 (2005).
- Fritsche, L. G., et al. Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).
- Clark, S., Bishop, P. Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration. J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).
- Clark, S. J., et al. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).
- Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H). Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).
- Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. The complete amino acid sequence of human complement factor H. Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).
- Moore, D. J., Clover, G. M. The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).
