Abstract
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een belangrijke oorzaak van de visuele handicap in de ontwikkelde wereld. De ziekte manifesteert zich door de vernietiging van het midden van het netvlies, de macula, wat resulteert in het verlies van het centrale gezichtsvermogen. Vroege AMD wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van kleine, geelachtige letsels soft droesem welke vooruitgang op late AMD zoals geografische atrofie (droge AMD) of neovascularisatie (natte AMD). Hoewel de klinische veranderingen goed beschreven, en het begrijpen van de genetische invloeden op overdracht AMD kans krijgt steeds gedetailleerder, een gebied ontbreekt belangrijke vooruitgang inzicht in de biochemische consequenties van genetisch risico. Dit is deels te wijten aan problemen bij het begrijpen van de biochemie van Bruch's membraan, een zeer dunne extracellulaire matrix die fungeert als een biologisch filter materiaal uit de bloedtoevoer en een steiger waarop het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen monolaag bevindt. Drusen fORM binnen Bruch's membraan en hun aanwezigheid verstoort voedingsstoffen stroom naar de RPE cellen. Alleen door het onderzoeken van de eiwitsamenstelling van Bruch's membraan, en inderdaad hoe andere eiwitten interageren met het, kan de onderzoekers hopen de biochemische mechanismen die ten grondslag liggen drusen vorming, de ontwikkeling van AMD en de daaropvolgende verlies van het gezichtsvermogen te ontrafelen. Deze paper Gegevens methoden voor het verrijken hetzij geheel Bruch's membraan, of alleen van de macula gebied, zodat het kan worden gebruikt voor downstream biochemische analyse, en voorbeelden van hoe dit reeds het begrip van Bruch's membraan biochemie veranderen.
Introduction
Het gebruik van de post mortem menselijk oogweefsel in oogheelkundig onderzoek is een bron van onschatbare waarde voor het begrip van oogziekte pathogenese. Analyse van humane donorogen heeft een belangrijke bijdrage aan de mechanismen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), die de belangrijkste oorzaak van blindheid in de westerse wereld 1 onderscheiden gemaakt. Wereldwijd AMD goed voor ongeveer 8,7% van alle blindheid en een toenemende vergrijzing, wordt voorspeld te beïnvloeden 196 miljoen mensen in 2020 2. AMD resulteert in het verlies van centrale visie en heeft een grote invloed op de patiënt de onafhankelijkheid en kwaliteit van leven 3. Vroege AMD wordt gekenmerkt door de vorming van drusen en kan ontwikkelen tot geografische atrofie (soms aangeduid als "droge" AMD) of choroïdale neovascularisatie (ook wel neovasculaire of natte AMD). Terwijl anti-VEGF injecties kan stabiliseren of verbetering van het gezichtsvermogen in neovasculaire AMD het iks niet curatief, en momenteel bestaat geografische atrofie geen behandeling.
Hoewel bepaalde genetische varianten bleken AMD risico wijzigen 4 - 8, minder bekend over hoe deze varianten beïnvloeden de macula op biochemisch niveau. Een belangrijke plaats in AMD pathogenese is Bruch's membraan. Drusen vorm binnen deze structuur en diverse onderzoeken hebben bewijs van complementactivering die in en rond Bruch's membraan 9 AMD. Bruch membraan een vel van extracellulaire matrix die het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen scheidt van de choroidea, en is ongeveer 4 urn dik. Bruch's membraan overgaat in de choriocapillaris, een laag van de choroidea die gefenestreerde capillairen en buiten deze bevat zijn lagen met grotere bloedvaten 10 (Figuur 1A).
Bruch membraan is een pentilaminar vel extracellulaire matrix (ECM), en deze methodologie beschreven hoe u Bruch's membraan isoleert, samen met de ECM van de onderliggende choriocapillaris (hierna te Bruch's membraan verrijkt), die grotendeels gedecellulariseerde en vrij van rode bloedlichaampjes. Verrijkt Bruch's membraan werd vervolgens gebruikt voor western blotting experimenten en histologie. Bovendien methoden voor het verrijken van Bruch's membraan uitsluitend uit de macula gebied van het oog beschreven, die van bijzonder belang die het onderzoeken van de biochemische aspecten van AMD.
Protocol
Menselijk oogweefsel toestemming voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen uit de Manchester Royal Eye Hospital Eye Bank na verwijdering van het hoornvlies voor transplantatie. Het gebruik van menselijke weefsels voor onderzoek in overeenstemming was met de Human Tissue Act (2004) richtlijnen, en met instemming van de Universiteit Research Ethics Committee (referentie 11305).
1. Verrijking van Whole Bruch's membraan
- Reinig de werkruimte rond en onder de dissectiemicroscoop met 1% desinfecterend middel (v / v) en veeg omlaag met 70% (v / v) ethanol.
- Zorg ervoor dat de volgende bij de hand: een nieuwe disposable scalpel, twee steriele cel scrapers (vaak gebruikt in weefselkweek) en drie paar pincet (hier vermeld als A, B en C, zie lijst materialen).
- Plaats de oogbol in een wegwerp petrischaal, behoud van de deksel voor later gebruik. Met behulp van een nieuwe disposable scalpel, verwijder eventueel resterende oogzenuw, die kunnen interfereren met het creëren van een vlakke mount van het weefsel. Maak vervolgens vier insnijdingen gelijke afstand van elkaar tot vier kwadranten te maken, als u doorgaat met deel 3 (verrijking van macula Bruch's membraan) niet dwars door de macula regio.
- Ervoor zorgen dat de insnijdingen zich door de gehele diepte van het oogweefsel - van de binnenste neurosensorische retina (NSR), door de choroid en sclera (oogwit). Blijven de incisie helemaal door het oog van de marge van de oogschelp aan de oogzenuw. Hierdoor kan de oogschelp te worden afgevlakt (zie figuur 1B).
- Die één kwadrant van afgeplatte oogschelp met pincet A (tot choroïdea onthechting te voorkomen), gebruik maken van de grotere pincet B grip het glasvocht en de onderliggende NSR en trek dit weefsel weg van de retina pigment epitheel (RPE) vanaf de periferie, op weg naar het centrum van de geopende oogschelp en vervolgens aan de tegenoverliggende kant. Meestal, maar niet altijd, zowel glasvocht en NSR los als één. Gebruik de Scalpel om eventuele NSR verankerd op de optische schijf accijnzen.
- Nogmaals, terwijl die een kwadrant weefsel vast met pincet A Gebruik de steriele celschraper zachtjes los het RPE monolaag van het gehele binnenoppervlak van de oogschelp. Deze cellen gemakkelijk los en kan worden gezien als donkerbruine gepigmenteerde klonten. Spoelen met PBS om zachtjes weg te spoelen verdreven RPE cellen uit de oogschelp.
- Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig afpellen de bovenliggende donkerrood weefsel (zowel Bruch's membraan en de choroidea) uit alle 4 de gaten kwadranten. Plaats de weggesneden weefsel in een schone schotel.
- Met behulp van de afgeplatte rand van een cel schraper om het uitgesneden weefsel zijn plaats te houden, gebruik maken van de tweede schraper om voorzichtig schrapen het weefsel. Draai het weefsel boven en herhaal, het verwijderen van zo veel overtollig materiaal mogelijk. Uiteindelijk zal een doorschijnend membraan blijft: dit is de grof verrijkte membraan van Bruch. Het gebruik van de dissectiemicroscoop ten minste 20X vergrotingessentieel ondersteuning van de verwijdering van vaatvlies en verrijking van Bruch's membraan.
- Met behulp van een Pasteur pipet kort spoel het membraan van Bruch met ultrapuur water om resterend vaatvlies en bloed te verwijderen voordat het membraan in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Suspendeer de verrijkte membraan van Bruch ongeveer 1 ml ultrazuiver water en vortex kort (ongeveer 15 sec) om lyseren verontreinigend cellulair materiaal (zie figuur 2). Centrifugeer het monster bij 500 xg gedurende 30 seconden aan het membraan pellet en zuig van de supernatant.
Opmerking: De resterende verrijkte Bruch's membraan is nu klaar voor solubilisatie later (zoals beschreven in paragraaf 2 hieronder) of opslag bij -80 ° C voor gebruik.
2. Oplossen van Whole verrijkte Bruch's membraan en Western Blot Analyse
- Uittreksel eiwit uit verrijkte Bruch's membraan door dompelen van het weefsel in 500 pi 8 M urEA 6 uur bij kamertemperatuur in 1,5 ml microcentrifuge buisjes (figuur 3A).
- Centrifugeer opgeloste monsters bij 10.000 xg gedurende 10 min om alle resterende extracellulaire aangelegenheid pellet. Verwijder het supernatant en overbrengen naar 3.500 Da MWCO dialysemembraan en plaats het monster in 1 liter PBS gedialyseerd gedurende 16 uur bij 4 ° C.
- Voor elk monster, voeg 40 ul proteïne isolatieparels en draai monster / bead mix (20 rpm op een roterende mixer) bij KT gedurende 30 min.
- Centrifugeer monsters bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om de kralen pellet. Verwijder supernatant en oplosbaar eiwit gebonden aan korrels in 30 ul 2x monster laadbuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) glycerol, 0,01% broomfenolblauw, 3% β-mercaptoethanol).
- Incubeer de monsters bij 100 ° C gedurende 10 min, en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om de resterende korrels pellet.
- Laad het supernatant dat de vrijgemaakte eiwitten op een pre-cast bevat SDS-pagina gradiënt gel (zie lijst) voor het eiwit scheiden.
- Visualiseren gescheiden eiwitbanden met behulp van een gemeenschappelijke kleuringsprotocol, bijvoorbeeld, Coomassie blauw.
- Kortom, voeg 20 ml van de briljante blauwe vlek (0,1% brilliant blue (w / v), 50% methanol, 10% ijsazijn, 40% water) aan de gel en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden .
- Gooi de kleuroplossing en was de gekleurde gel met gedemineraliseerd water totdat achtergrond kleuring voldoende wordt gereduceerd tot lood eiwit band visualisatie mogelijk te maken.
- Alternatief overdracht gescheiden eiwitbanden op nitrocellulose voor Western-analyse, zoals hieronder beschreven.
- Transfer gescheiden eiwitbanden op nitrocellulosemembraan bij 80 mA gedurende 2,5 uur gebruik halfdroog overdrachtsapparaat in overdrachtsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% [v / v] methanol).
- Blokkeer het membraan in 10 ml PBS, 10% (w / v) melk en 0,02% (w / v) BSA gedurende 16 uur bij 4 ° C vóór the toevoeging van de gewenste primaire antilichamen voor eiwitdetectie.
Opmerking: Als voorbeeld, Figuur 3C toont een representatieve immunoblot van het gesolubiliseerde membraan van Bruch drie afzonderlijke donoren gezocht heeft naar een regulator van de complement cascade, factor H-achtig eiwit 1 (FHL-1).
3. Verrijking van Macula Bruch's membraan
- Volg stap 1,1 - 1,3 zoals eerder beschreven.
- Terwijl de NSR is nog steeds op zijn plaats, zoek de gele foveale kleur die de centrale macula regio (zie figuur 4) vertegenwoordigt. Met behulp van een steriele 6 mm biopsie punch, plaats deze boven de foveale regio en stevig snijden in om de macula.
- Het bijhouden van de biopsie punch op zijn plaats, maak een aparte incisie met een scalpel vanaf de rand van de oogschelp aan de rand van de biopsie punch blade, en vervolgens met behulp van pincet B, afpellen de omringende oog materiaal om een schone biopsie te bereiken.
- Met behulp van pincet C, verwijderende 6 mm schijf van weefsel uit de punch en plaats op de schone petrischaal deksel. Plaats de petrischaal deksel en macula stempel onder de microscoop ontleden.
- Verwijder de dunne NSR schijf (controleer gele foveal kleuring om de nauwkeurigheid van de biopsie afleiden). Gebruik een steriele celschraper om voorzichtig verwijderen van de RPE cellen.
- Zet de macula disc via de sclera met behulp van de tips van een pincet, en langzaam loskomen van het vaatvlies en de membraan van Bruch complex met pincet C. Ook gebruiken de cel schraper om ongewenste choroidea en bloed kwestie van Bruch's membraan verwijderen.
- Plaats de macula Bruch's membraan in een 1,5 ml microcentrifugebuis en schorten in 1 ml ultrapuur water. Vortex kort (ongeveer 15 sec) te helpen lyseren eventuele besmetting van cellulaire materie. Centrifugeer het monster bij 500 xg gedurende 30 seconden aan het membraan pellet en zuig van de supernatant.
Opmerking: Het verrijkte Bruch's membraan geïsoleerd uit de macula kan nu gebruikt worden voor een proteomischealysis behulp voorkeur spijsvertering protocollen van de gebruiker.
Representative Results
De hierboven beschreven protocol verrijkte Bruch's membraan resulteert in de isolatie van de membraan van Bruch, de ECM van de choriocapillaris en verwijdert de meeste cellen / celresten inclusief alle RPE (Figuur 2). Het wassen van de verrijkte Bruch's membraan in water is een essentiële stap in het lyseren resterende choroïdale cellen. De druk tijdens de sloop van het vaatvlies uitgeoefend lijkt een van de weinige resterende celkernen te comprimeren in het gebied verstaan Bruch's membraan (Figuur 2B).
De solubilisatie van verrijkt Bruch's membraan maakt stroomafwaarts analyse van het eiwitgehalte. De scheiding van eiwitbanden van oplosbaar verrijkt Bruch's membraan met een 4-12% gradiënt SDS-PAGE gel, terwijl niet bruikbaar op zichzelf op eiwitgehalte identificeren demonstreert het vermogen van deze techniek om verontreinigende bloedeiwitten die ar minimaliserene niet-specifiek gebonden (Figuur 3B). In dit opzicht, een grote afwezige van het eiwit gel run is een aanzienlijke band van humaan serumalbumine (~ 66 kDa) die anders ervoor latere western blotting moeilijker te interpreteren: de histologische analyse van verrijkt Bruch's membraan getoond in figuur 2 eveneens steunen deze. Inderdaad, als onderdeel van het werk eerder beschreven 11, gesolubiliseerd Bruch's membraan uit een reeks afzonderlijke donors werden onderzocht voor een aantal eiwitten met specifieke antilichamen via Western blotting (Figuur 3C). In het hier getoonde geval een antilichaam (genaamd OX23) 12 gericht tegen een 155 kDa regulator van aangeboren immuniteit, genaamd complement factor H (FH) werd toegepast en toonde de aanwezigheid van een lager molecuulgewicht band in Bruch's membraan monsters uit drie afzonderlijke donors (Figuur 3C). Dit vervolgens bleek factor H-achtig eiwit 1 zijn (FHL-1)Een 49 kDa eiwit in verband met FH of voortkomen uit een splice variant van hetzelfde gen 13. FHL-1 lijkt de belangrijkste aanvulling regulator die aanwezig zijn in de membraan van Bruch 11 zijn.
Figuur 1. Dissectie van het menselijk oog en Verrijking van Bruch's membraan. (A) Bruch's membraan een extracellulaire matrix barrière. De choroid bevat een laag gefenestreerd capillairen die continu overgaan in Bruch's membraan (de choriocapillaris) en deze gescheiden van de rest van het vaatvlies (met grote bloedvaten) vanaf het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen monolaag, die fysiologisch ondersteunt fotoreceptorcellen van de neurosensorische netvlies (NSR). (B) Vier insnijdingen in het menselijk oogschelp worden gemaakt waardoor het kan worden geopend om een platte berg te maken. Deglasvocht kan worden verwijderd met behulp van een pincet. De NSR losraakt met het glaslichaam, maar kan ook worden verwijderd met een pincet. Een cel schraper wordt gebruikt om de RPE cellaag van Bruch's membraan te verwijderen terwijl nog steeds wordt verankerd aan het vaatvlies en sclera. Het membraan van Bruch / choroid complex verwijderd van de sclera worden gepeld en met een nieuwe cel schraper kan de buitenste choroidea verwijderd. Een laatste wasbeurt in ultrapuur water lyseert alle resterende cellulaire kwestie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Histologie van Bruch's membraan en Choroid. H & E gekleurde coupes vóór (A) en na (B) wegschrapen de buitenste choroïdale structuren van Bruch's membraan en wassen in ultrazuiver water genereren verrijkt Bruch's membraan. Schaal balken geven 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Solubilisatie van verrijkte Bruch's membraan Protein Content Analysis. (A) eiwit kan uit verrijkte Bruch's membraan wordt geëxtraheerd door incubatie in 8 M ureum gedurende 6 uur bij kamertemperatuur, alvorens gedialyseerd tegen PBS. Voor Western-analyse, kunnen eiwitten van het gehele membraan van Bruch dialysaat geïsoleerd met behulp van proteïne isolatieparels en geëlueerd door koken met Laemmli verminderen monster laadbuffer. (B) Een representatieve Coomassie blauw gekleurde SDS-PAGE gel, waarbij zowel netjes en verdunning oplosbaar membraan van Bruch (BM) met de methode d. escribed in (A) (C) Een vertegenwoordiger western blot van oplosbaar Bruch's membraan van 3 individuele donoren (lanen 1-3). gesondeerd voor factor H-achtig eiwit 1 (FHL-1) Klik hier om een grotere versie te bekijken dit cijfer.
Figuur 4. Isolatie van verrijkte Bruch's membraan van de Macula. De macula gebied van de retina is een 5 mm gebied dat gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door de gele kleur van de bovenliggende fovea, en de nabijheid van de aangrenzende optische disc. Met behulp van de fovea als een gids, plaats een 6 mm biopsie punch op het vlakke gemonteerd menselijk oog op een 6 mm macula weefsel blok accijnzen. Verwijder de bovenliggende NSR en afschrapen RPE cellen uit de weggesneden macula. De resterende Bruch's membraan / choroidea complex kan den weg van de sclera worden geschild en grondig geschraapt om choroïd verwijderen, Lyse overgebleven celmateriaal door onderdompeling in ultrapuur water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier beschrijven we de verrijking van Bruch's membraan voor verdere analyse waardoor de daaropvolgende analyses met inbegrip van western blotting 11, massaspectrometrie en de diffusie-eigenschappen van Bruch's membraan met behulp van gemodificeerde Ussing kamers 11,14. Kritische stappen omvat a) het grondig schrapen en wassen van de binnenkant van het oog om alle RPE cellen b) het herhaaldelijk en voorzichtig schrapen van het onderliggende choroidea verwijderen zonder dat de Bruch's te desintegreren en c) het wassen van de uitgesneden Bruch in ultrazuiver water lysis van resterende cellen te verzekeren. Indien daarenboven verrijkte Bruch's membraan wordt gebruikt voor proteoomanalyse, eiwitextractie ureum behandeling het meest effectief in het afbreken van dit verende weefsel in vergelijking met andere werkwijzen zoals mechanische homogenisatie. Histologie verrijkte Bruch's membraan geeft de ECM van de choriocapillaris niet verwijderd. Dit is af tewachte als buitenlaag van pentilaminar Bruch's membraan wordt gevormd door choriocapillaris endotheliale basale membranen. Inderdaad kan het voordelig zijn dat de ECM van de choriocapillaris blijft veranderingen optreden in deze AMD inbegrip van de depositie van terminale complement complex / membraan attack complex (MAC) 15. Opgemerkt zij dat voor gedetailleerde histologische analyse van Bruch's membraan, de structuur zou beter behouden als gesegmenteerd in aanwezigheid van sclera, choroidea en Bruch's membraan. Inderdaad wordt de histologie in Figuur 2 uitsluitend bedoeld om de verrijking gevolg van de in dit manuscript beschreven techniek tonen.
Verrijking van macula Bruch's vereist een zorgvuldige dissectie van de oogschelp, zodat de NSR en in het bijzonder de fovea niet beschadigd; anders identificatie en daarmee isolering van het macula niet mogelijk. De integriteit van de Tissue is ook belangrijk om dit proces en het wordt daarom aanbevolen dat de monsters onder 48 uur post mortem tijd worden gebruikt. De mate van verrijking vereist varieert tussen donoren en kan worden beïnvloed door donorleeftijd, post-mortem tijd en de aanwezigheid van elke oog pathologie. Het gebruik van de term verrijkte opzettelijk in het erkennen beperking van de techniek, zijnde dat "zuivering" of "isolatie" van het membraan van Bruch met deze methode gewoonweg niet mogelijk. Inderdaad, aangezien de ECM van de choriocapillaris overgaat in de membraan van Bruch er volledige scheiding niet haalbaar.
Inzicht in de biochemische veranderingen van de respectievelijke oculaire weefsel is essentieel bij het begrijpen oog ziekteprogressie. Deze unieke verrijking van Bruch's membraan faciliteert dit begrip; lopende studies onderzoeken de proteoom verrijkte macula membraan van Bruch met massaspectrometrie in verschillende stadia van AMDen in monsters afkomstig van patiënten met verschillende genotypes beter inzicht in de moleculaire pathologie van AMD verbeteren. Al de hier beschreven techniek werd met succes gebruikt FHL-1 te identificeren als voornaamste complement regulator Bruch's membraan 11 en bestudeerd verrijkt Bruch's membraan waarschijnlijk leiden tot nieuwe inzichten in de moleculaire pathologie van AMD.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Isaac Zambrano en het personeel van de Manchester Eye Oogziekenhuis Bank voor de levering van de menselijke donor oogweefsel, en Mr. Pete Walker van de faculteit Life Sciences Histologie faciliteit voor de H & E gekleurde beelden te erkennen. Speciale dank gaat uit naar de heer Roger Meadows voor zijn hulp bij de microscopie. SJC is een ontvanger van een Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1) en de auteurs erkennen ook andere recente financiering van onderzoek van MRC (G0900538 en K004441), Vecht voor Sight (1866) en The Macula Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auxillary objective 0.5X | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
| Biopsy Punch 6 mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
| Bovine serum albumin | Sigma - Aldrich | A3059 | |
| Bromophenol Blue | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
| CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
| Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
| Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma - Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
| (A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100 mm) and straight |
| (B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample |
| (C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
| Glycerol | Sigma - Aldrich | G1345 | |
| Glycine | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
| Methanol | Sigma - Aldrich | M/4000/17 | |
| Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
| Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90 mm, used as a dish for samples |
| Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T3253 |
References
- Coleman, H. R., Chan, C. -C., Ferris, F. L., Chew, E. Y.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Coleman, A. L., et al. Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures. Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).
- Hageman, G. S., et al. A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 385-389 (2005).
- Haines, J. L., et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 419-421 (2005).
- Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 421-424 (2005).
- Fritsche, L. G., et al. Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).
- Clark, S., Bishop, P. Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration. J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).
- Clark, S. J., et al. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).
- Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H). Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).
- Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. The complete amino acid sequence of human complement factor H. Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).
- Moore, D. J., Clover, G. M. The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).
