Abstract
Fagocytose er en grundlæggende proces, hvorigennem medfødte immunceller opsluge bakterier, apoptotiske celler eller andre fremmedlegemer med henblik på at dræbe eller neutralisere den indtagne materiale eller at præsentere den som antigener og igangsætte adaptive immunreaktioner. PH af fagosomer er en kritisk parameter regulerer fission eller fusion med endomembranes og aktivering af proteolytiske enzymer, arrangementer, der tillader den fagocytiske vacuole at udvikle sig til en nedbrydende organel. Desuden er translokation af H + kræves til produktion af høje niveauer af reaktive oxygenarter (ROS), som er afgørende for effektiv aflivning og signalering til andre værtsvæv. Mange intracellulære patogener undergrave fagocytisk drab ved at begrænse phagosomal forsuring, fremhæver betydningen af pH i fagosom biologi. Her beskriver vi en ratiometrisk metode til måling af pH i phagosomal neutrofiler ved hjælp af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket zymosan som fagocytisk Targets, og live-cell imaging. Assayet er baseret på fluorescens-egenskaber FITC, som er standset ved sur pH når den exciteres ved 490 nm, men ikke når den exciteres ved 440 nm, hvilket muliggør kvantificering af en pH-afhængig forhold, snarere end absolut fluorescens, af en enkelt farvestof. En detaljeret protokol for at udføre in situ farvestof kalibrering og konvertering af forholdet til reelle pH-værdier er også fastsat. Single-farvestof ratiometriske metoder anses generelt for overlegen i forhold til enkelt bølgelængde eller dual-dye pseudo-ratiometrisk protokoller, da de er mindre følsomme over for forstyrrelser, såsom blegning, fokus ændringer, laser variationer, og ujævn mærkning, som forvrider den målte signal. Denne fremgangsmåde kan let modificeres til at måle pH i andre fagocytiske celletyper og zymosan kan erstattes af enhver anden aminholdig partikel, fra inerte perler til levende mikroorganismer. Endelig kan denne fremgangsmåde tilpasses til at gøre brug af andre fluorescerende prober er følsomme over for forskellige pH-områder eller andre phagosomal aktiviteter, hvilket gør det en generel protokol for den funktionelle billeddannelse af fagosomer.
Protocol
Etik Statement: Alle dyr manipulationer blev udført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne i forskningsudvalget Animal fra University of Geneva.
1. Fremstilling af Fagocytiske Mål
- Der tilsættes 20 mg tørret zymosan til 10 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Vortex og varme i et kogende vandbad i 10 minutter. Cool og centrifugeres ved 2.000 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml PBS og sonikeres i 10 minutter i et vandbad sonikator. Overfør 500 ul til to 1,5 ml rør. Centrifuger ved 11.000 x g i 5 min.
- Gentag vask med 500 pi PBS. Den kogte zymosan kan alikvoteret, frosset og opbevaret ved -20 ° C.
- Vask zymosan to gange i 500 pi frisk fremstillede 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 som ovenfor (trin 1.2).
- Resuspender i 490 pi Efter den sidste vask. Tilsæt 10 pi 10 mg / ml FITC opløst i dimethylsulfoxide (DMSO), vortex, dække med folie og inkuberes under omrøring i 4 timer ved stuetemperatur.
- For at fjerne ubundet farvestof, der vaskes som beskrevet ovenfor (trin 1.2), først med 0,5 ml DMSO + 150 pi PBS, derefter 0,5 ml DMSO + 300 pi PBS, derefter 0,5 ml DMSO + 450 pi PBS, derefter PBS alene.
- Tæl zymosan anvendelse af et hæmocytometer. Tilsæt 1 pi zymosan til 500 pi PBS, vortex, derefter tilsættes 10 pi til kanten af hæmocytometeret kammeret, hvor den møder dækglasset placeres over den centrale gitter. Monter hæmocytometer på en lys-felt mikroskop udstyret med et 20 x objektiv.
- Fokus på det øverste venstre hjørne indeholder 16 pladser og tælle alle zymosan partikler på dette område ved hjælp af en hånd tally tæller. Gentag med det nederste højre hjørne. Beregn zymosan koncentration ved hjælp af følgende ligning: Zymosan koncentration = Count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Mærket zymosan kan alikvoteret, frosset og opbevaret ved -20 ° C.
- Opsonisere det mærkede zymosan wiTH kanin-anti-zymosan antistof ved 1: 100 fortynding. Vortexes og inkuberes i 1 time i et 37 ° C vandbad. Vask med 500 pi PBS som ovenfor (trin 1.2).
Bemærk: Sonikering anbefales, især efter opsonisering, som zymosan tendens til at danne klumper, der kan gøre analysen sværere senere. Opsonisering med 65% v / v rotte eller humant serum kan anvendes som et alternativ. - Tæl zymosan ved hjælp af et hæmocytometer som beskrevet i trin 1,7-1,8, og fortyndes til 100 x 10 6 partikler / ml. Opsonisering med andre fagocytiske stimulatorer, såsom komplement eller ingen opsonisering, kan alternativt udføres.
2. Live Video Microscopy
- Isoler primære muse neutrofiler som beskrevet detaljeret andetsteds 38.
- Alternativt kan du bruge en hvilken som helst fagocyterende celletype. Hold neutrofiler på is i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium suppleret med 5% føtalt kalveserum (v / v), 200 U penicillin / streptomycin, i en koncentration på 10 x 10 6 celler / ml indtil den er klar til brug. Andre celletyper kan podes 1-4 dage før.
- Tilsæt 2 x 10 5 (20 pi) af neutrofiler til midten af en 35 mm med glasbund skålen, sprede fald ved tilsætning af 50 pi medium og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter for at tillade cellerne at adhærere.
- Der tilsættes 1 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) opvarmet til 37 ° C indeholdende den specifikke MPO-inhibitoren 4-aminobenzoesyre hydrazid (4-ABH, 10 uM). Ikke-specifikke MPO-inhibitorer, såsom natriumazid (5 mM), kan også anvendes, men er for nylig blevet foreslået at udøve yderligere ikke-specifikke effekter på pH 39.
- Montere parabol på en Vidvinklet fluorescensmikroskop udstyret med et 37 ° C varmesystem og et 40X objektiv olie. Cellerne inkuberes uden billeddannelse til 10 minutter for at tillade celler og udstyr til at ækvilibrere.
- Juster mikroskop indstillinger til at erhverve et lyst-felt transmission billede [PHAselv, eller kontrast differential interferens (DIC), hvis tilgængelig] med 440 nm eller 490 nm excitation og 535 nm emission hver 30 sek.
- Juster eksponeringen tid og frekvens erhvervelse i henhold til mikroskop system for at undgå for meget fotoblegning og fototoksicitet og afhængigt af de eksperimentelle spørgsmål bliver stillet. Begynd billedoptagelse.
- Efter 2 min tilsættes 10 x 10 6 (50 pi) opsoniseret FITC-zymosan til midten af skålen. Juster mål-forhold afhængigt af typen af fagocyt og mål anvendes.
- Fortsæt billeddannelse til 30 min. Efter 30 minutter stopper time-lapse købet, og start en timer. Flyt scenen og fange 10 eller flere snapshots i forskellige synsfelter på billedet andre fagosomer, alle inden for 5 min.
3. Kalibrering og kontroleksperimenter
- Forbered opløsningerne pH-kalibrering (opskrifter er beskrevet i tabel 1) forud for dagen for eksperimentet og fryse i 10 ml alikvoter.Optø standardopløsningerne og varme til 37 ° C i et vandbad. PH kontrolleres med et pH-meter og registrere den faktiske pH af opløsninger.
- Montere en peristaltisk pumpe på glasbund fad før billedoptagelse og udfører live video mikroskopi som beskrevet ovenfor (afsnit 2).
- Ved afslutningen af 30 min erhvervelse periode tænde for pumpen for at fjerne opløsningen i skålen, tilsættes 1 ml af den første kalibreringsopløsning og stoppe pumpen.
- Vent, indtil signalet stabiliseres, normalt 5 min. Gentag med hver standardopløsning.
- Udføre mindst én kalibrering pr forsøgsdag, og kalibrere begyndende med den højeste pH og arbejde sekventielt til den laveste, samt ud fra den laveste pH og arbejde sekventielt mod den højeste.
- Som kontrol tilsættes 100 pi 100 pM NADPH oxidase inhibitor diphenyl propionium iodid (dpi) fortyndet i HBSS til celler i 900 pi HBSS i glasbund skålen, oginkuberes i 10 min.
- Start erhvervelse og tilføje zymosan som ovenfor (trin 2.7). Efter 15 minutter af fagocytose, tilsættes 10 pi 10 pM V-ATPase-inhibitor concanamycin A (ConcA) fortyndet i HBSS og fortsætte billeddannelse i yderligere 15 min.
4. Analyse
- Analyse af time-lapse film og fagosomet snapshots.
Bemærk: Følgende instruktioner er specifikke for ImageJ. Trin-for-trin instruktioner kan variere meget afhængigt af den software, der anvendes, men de funktioner, der beskrives i dette afsnit, er tilgængelige i de fleste professionelle image analyse software.- Åbn billeder med professionelt image analyse software. Fratræk baggrunden i 490-kanalen ved at tegne et lille torv ROI med kvadratet polygon markeringsværktøjet i et område, hvor der ikke er celler, og klikke på Plugins> BG subtraktion fra investeringsafkast. Så upload den samme ROI på 440 kanal ved at klikke på Rediger> Valg> Gendan Valg og gentag.
- Lav en 32-bit-forholdet billede af 490 kanals divideret med 440 kanal ved at klikke på Proces> Billede Calculator ..., vælge de relevante billeder i image1 og image2 rullemenuer, derefter vælge 'Divide "i Operation rullemenuen og kontrol af 32-bit (float) resultat afkrydsningsfeltet.
- Ændre farvekodning opslagstabel til et forhold-kompatibel farvekodning ved at klikke på Billede> opslagstabeller> Rainbow RGB. Threshold forholdet billedet for at eliminere 0 og uendeligt pixels ved at klikke på Billede> Juster> Threshold .... Juster rullepanelerne så zymosan vises i rødt og klik på Anvend, og sørg for Set baggrund pixels NaN afkrydsningsfeltet til er markeret.
- Ved at klikke på Billede Kombiner dette forhold stak med den lyse-field-kanal i en sammensat multi-kanal> Farve> Flet Kanaler, og vælge den lysfeltsbillede i det grå kanal rullemenuen og forholdet billedet i den grønne kanal rullemenuen, og vælgeHold kildebilleder check-box. Scan time-lapse film eller snapshots til at afgøre, hvilke fagosomer der skal analyseres. Den lysfeltsbillede kanal er anvendelige til dette.
- Tegn områder af interesse (ROI) ved hjælp af ovale polygon markeringsværktøjet rundt fagosomer, og tilføje dem til ROI Manager ved at klikke Analyser> Værktøjer> ROI manager> Tilføj. Måle deres zymosan intensitet forholdet ved at klikke på Mere> Multi-Mål og de-vælge en række pr skive afkrydsningsfeltet.
- For time-lapse film, track fagosomer et ad gangen ved at tegne et investeringsafkast, skrive Ctrl + M for at måle hvert tidspunkt, og flytte ROI når det er nødvendigt for at spore intensitetsværdier over tid. Kopier målingerne fra resultaterne vinduet i et regneark software.
Bemærk: Analyse af 15 (5 tidsforløbene pr eksperiment x 3) uafhængige eksperimenter er ideel, men kan kræves mere eller mindre afhængigt af variabilitet observeret. Lagring af ROIs anbefales altid. Nogle softwarepakker tillader billede registration og dynamisk opdatering af ROI'er, lette denne del af analysen.
- Omregning fra fluorescens pH-værdier
- Mål 490/440 ratio for fagosomer i kalibrering time-lapse film, som beskrevet i afsnit 4.1.
- I et regneark, plotte forholdsværdier over tid, og beregne de gennemsnitlige forholdsværdier fra alle fagosomer indenfor synsfeltet (normalt mellem 5-20) fra 5 tidspunkter inden midten af perioden svarende til hver pH-kalibrering løsning. (Se også de røde kasser i figur 5A.)
- Plot disse gennemsnitlige 490/440 forholdsværdier mod den faktisk målte pH-værdi. Kombiner mindst 3 uafhængige kalibreringer i en enkelt graf. Brug en statistisk eller numerisk softwarepakke til at udføre en ikke-lineær regression (bedste fit kurve), sædvanligvis til en S-formet ligning.
Bemærk: For eksempel i figur 5B ligningen anvendte var en Boltzmann S-formet [Y = Bund + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], hvor Y-værdier er de 490/440 nøgletal, X er de pH-værdier og top, bund, er V50 og hældning parametre beregnet af softwaren. - Brug opnåede ligning til at omdanne forholdsværdier til pH.
Bemærk: For eksempel i figur 5B ligningen opnået for kalibreringskurven i nærvær af natriumazid er 490/440 Ratio = 1.103 + [(2,89-1,103) / (1 + exp ((6,993-pH) /0.9291)] . Løsning til pH giver følgende ligning: pH = 6,993 - 0,9291 * [LN ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende er repræsentative resultater for et eksperiment, hvor phagosomal pH af primære muse neutrofiler isoleret fra knogle-marv af vildtype eller Hvcn1 - / - mus blev sammenlignet. For en vellykket eksperiment, er det vigtigt at opnå nok fagosomer indenfor synsfeltet under hele varigheden af time-lapse film, og samtidig undgå alt for mange fagosomer, som senere vil blive sværere at segmentet i løbet af billedanalyse. Figur 1 viser eksempler på gode og dårlige confluencies. For tidsafhængig og snapshot-analyser, skal eksterne zymosan partikler skelnes fra fagosomer og udelukket fra analysen. Figur 2 illustrerer, hvordan lysfeltsbillede kan være nyttigt at hjælpe med at skelne eksterne zymosan partikler fagosomer. Figur 3 viser eksempler på typiske fagosom pH time-kurser i vildtype sammenlignet med Hvcn1 - / - Figur 4 illustrerer virkningen af tilsætning af NADPH-oxidase inhibitor DPI, hvilket resulterer i en hurtig syrning, efterfulgt af tilsætning af V-ATPase-inhibitor ConcA, der vender syrningen. Sådanne eksperimenter kan være kritisk at bevise, at pH-følsomme sonder arbejder inden fagosomer som de burde. En typisk kalibrering tid-kursus er repræsenteret i figur 5, med rektangler angiver intervallet forholdsværdier der anvendes til fremstilling af kalibreringskurven. Figur 5 desuden viser, hvordan farvestof chlorering gennem MPO aktivitet kan påvirke intraphagosomal pH-reaktion FITC, fremhæver det faktum, at prober kan reagere anderledes end forventet i phagoso mal og betydningen af in situ kalibrering.
Figur 1. Passende konfluens og mål-forhold Det venstre panel viser et eksempel, hvor cellekonfluens er for sparsomme og mål. Celle-forholdet er for lav, mindskes sandsynligheden for, at en fagocytisk begivenhed vil opstå i synsfeltet. Den midterste panel viser et eksempel, hvor cellekonfluens er for høj, og cellerne er overfyldt. Under disse betingelser kan cellerne ikke har plads nok til at flytte og finde deres mål, eller kan kravle over hinanden gør analysen mere vanskelig senere hen. Den højre panel viser en ideel cellekonfluens og oprindelige mål: celle-forhold, hvor mange celler og mål kan ses og alligevel klart skelnes fra hver anden. FITC-zymosan vises i grønt og omfanget bar udgør 10 um. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kollienes fagosomer og uningested zymosan. Den venstre panel viser en fusioneret lysfeltsbillede og en 490/440 FITC-zymosan ratio, mens højre panel viser lysfeltsbillede alene. Fagosomer (små grønne pile) kan skelnes fra eksterne partikler, der enten ikke co-lokalisere med celler (korte røde pil) eller hvis fluorescens ikke passer sammen med en mørk center (lange røde pil) omgivet af en lysere ring, karakteristiske af fagosomer på lysfeltsbillede (grønne pile). Skalaen barer udgør 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Time kurser, gennemsnitlige pH og forholdet histogrammer for vildtype og Hvcn1 - / -. Neutrofile fagosomer (A) Typiske tidsforløb for phagosomal pH viser, at mens pH i vildtype neutrofiler (blå) er neutral (stiplet linje ) eller let basisk (fuldt optrukket linie) i den tidlige tidspunkter efter indtagelse, de fagosomer af Hvcn1 - / - neutrofiler (rød) kan enten alkalinize (fuldt optrukket linie) eller forsure (stiplet linje). (B) Oversættelse snapshots taget 30-35 minutter efter tilsætning af mål tillader den gennemsnitlige befolkning phagosomal pH skal beregnes ud fra en lang række fagosomer (vildtype: n = 5/1898/383 og Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 eksperimenter / fagosomer / celler, barer er middelværdier ± SEM, NS ikke signifikant). (C) histogrammer af FITC-zymosan nøgletal afslører forskelle i phagosomal pH mellem vildtype og Hvcn1 - / - neutrofiler. (Dette tal er blevet ændret fra [19], med tilladelse.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning af NADPH oxidase inhibitor DPI og V-ATPase-inhibitor ConcA på phagosomal pH. Præinkubering i 10 uM DPI resulterede i en hurtig syrning af fagosomer kort efter indtagelse, hvilket blev vendt ved tilsætning af 100 nM ConcA (pil). (Dette tal er blevet ændret fra [19], med tilladelse.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. pH kalibrering tidsforløb og virkninger MPO-inhibering på kalibreringen af FITC-zymosan. (A) En typisk pH kalibreringskurve intraphagosomal FITC-zymosan. Røde felter angiver intervallet forholdsværdier der anvendes til fremstilling af kalibreringskurven. De faktiske pH-værdier af de løsninger, der anvendes, og de tidspunkter, på hvilke de løsninger, er ændret, er angivet med pile. Kurven repræsenterer middelværdien af 10 fagosomer i et enkelt synsfelt. (B) Inhibition af MPO med den ikke-specifikke inhibitor natriumazid (5 mM, MPO Inh) øger det dynamiske område for intraphagosomal FITC-zymosan pH-afhængige reaktioner. Points er middel ± SEM (Dette tal er blevet ændret fra [19], med tilladelse.) Klik her for at se a larger version af denne figur.
| 1.1 | (2x) Base | |||||
| Buffere | Lager | Final (1x) | For 500 ml (2x) | |||
| KCI | 1 M | 140 mm | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Buffere | Lager | Final(1x) | Formål | ||
| MES | 1 M | 20 mM | til pH 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | til pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | til pH 5,5-6,7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | til pH 5,5-6,8 | |||
| 1.3 | Ionophorer | Lager (100% EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 uM | ||||
| 1.4 | For 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Buffer Type | Buffer Vol. | Nigericin | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 6,0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | ||
| 7,0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 8,0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 9,0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 pi | 5 pi | |
| Juster pH medKOH eller HCl | ||||||
Tabel 1. Opskrift på at forberede kalibereringsopløsninger. 1.1) Opskrift på at forberede 500 ml af en 2 x basis løsning. 1.2) Opskrift til fremstilling af de forskellige buffere anvendt ifølge pH af standardopløsningen. 1.3) Opskrift til fremstilling af ionophorer anvendes i standardopløsningerne. 1.4) Opskrift til fremstilling af 50 ml hver standardopløsning hjælp basen, buffere og ionophorer beskrevet i 1,1-1,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom mere tidskrævende end alternative metoder, såsom spektroskopi og FACS, som anvender en lignende strategi for anvendelse af et pH-følsomt farvestof koblet til mål, men måler den gennemsnitlige pH af en population af fagosomer, mikroskopi giver flere fordele. Første er, at intern og ekstern bundet, men ikke internaliseret, kan partikler let skelnes uden at tilføje andre kemikalier, såsom trypanblå eller antistoffer, at slukke eller mærke eksterne partikler, hhv. For det andet er, at der efter cellerne i realtid giver forskerne at observere flere aspekter af fagocyterende processen samtidig og så effekter på migration, sansning og bindende partikler kan nemt skelnes her, det kan være overset med befolkningens metoder. Derudover synkronisering af indledningen af fagocytose, ofte udføres ved at placere celler ved 4 ° C, som kunne forstyrre begivenheder anden ulovlig grund kuldechok 40,41, er ikket nødvendig, da tiden nul kan skelnes direkte. Faktisk, når optræder live mikroskopi, er dette 4 ° C synkronisering teknik anbefales ikke, hvis indfange perioder tæt på indledningen af fagocytose som kondens, der dannes på bunden af skålen under temperaturen skift kan blande med målsætningen fordybelse olie og temperaturforskelle mellem den opvarmning parabol og mikroskop komponenter kan forårsage fokus skifter. En tredje fordel stammer fra det faktum, at fagosomer er uløseligt Heterogen flere parametre, herunder, men ikke begrænset til, pH 42, og visse virkninger på fagosom pH kan være mere subtile, hvilket ændrer fordelingen af phagosomal pH snarere end den gennemsnitlige befolkning, som blev vist i figur 3. Sådanne observationer kan give dybere mekanistiske indsigt i reguleringen af phagosomal pH.
I den foreliggende undersøgelse blev FITC valgt som pH-følsomt farvestof valg, fordi det erbillig, almindeligt tilgængelige, og vigtigere har en pKa på 6,5 med et dynamisk område, der omfatter pH 3 til 9 i sin frie form 37, som matches oprindeligt forventet pH-område på neutral til svagt basisk, ifølge tidligere undersøgelser 29,30. Mere for nylig en undersøgelse, der anvender en anden pH-sonde kaldet snarf, som har en mere grundlæggende pKa på 7,5, uventet estimerede pH-værdier i intervallet 1-2 pH-enheder mere basisk til både vildtype- og Hvcn1 - / - neutrofile fagosomer 39. Således er valget af pH-føleren er en vigtig parameter til at overveje afhængigt af anvendelsen. I princippet kan fremgangsmåden præsenteres her let tilpasses til anvende andre pH-følsomme farvestoffer, såsom snarf og 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein (BCECF), hvis succinimidyl-esterderivater er let koblet til aminholdige partikler, såsom zymosan. Faktisk behøver sensorer ikke være begrænset til fluorescerende farvestoffer, som ratiometric pH-følsomme proteiner, såsom en SYPHER 43, kunne transduceres og udtrykkes af mikroorganismer. Flere ikke-ratiometriske alternativer findes også, navnlig den røde version af farvestoffet pHrodo, som kan anvendes i forbindelse med grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket proteiner eller pH-følsomme protein pHluorin. Men på grund af de potentielt store virkninger, den barske intraphagosomal miljø kan have på farvestoffer og proteiner målrettet deri, bør disse prober være minimum kombineret med pH ufølsomme prober, der skal anvendes i at udlede en pseudo-forhold. Som eksemplificeret i figur 5, kan kalibreringer eksperimenter udsætte virkningerne af farvestof skade som reduceres eller forvrænget dynamikområde. På en praktisk note, kalibrering eksperimenter er ikke altid perfekt, og kan være umuligt at udføre efter hver eksperiment. Følgelig kan forholdsværdier lejlighedsvis falder uden for området af kalibrering og opnåelse umulige værdier ved omregning til pH. Det kan approprIATE til enten udtrykke disse off-skala værdier som "større / mindre end eller lig med" maksimum og minimum kalibrering pH-værdier, eller for at udtrykke alle værdier som nøgletal og skøn pH-områder, at de gennemsnitlige nøgletal repræsenterer.
Som fremhævet af DPI og ConcA kontrollerer, ROS produktion og V-ATPase-aktivitet er vigtige faktorer, der bestemmer phagosomal pH. Ja, i mange situationer, kan ændringer i niveauet af ROS produktion til grund forskelle i phagosomal pH, især i neutrofiler, og måling af phagosomal ROS produktion og pH ofte går hånd i hånd. Ét ord af forsigtighed er, at begge lægemidler udlåne indblik i aktiviteten af de enzymer, de hæmmer, men ikke til deres placering i cellen. Begge enzymer er multi-subunit komplekser, hvis individuelle komponenter skal trafik til fagosomer 4 og deres manglende aktivitet på fagosomer kan skyldes defekter menneskehandel eller montage snarere end direkte virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
