섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.
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방법 논문
FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
섬유 아세포는 세포 외 기질을 분비에 대한 책임 원칙 세포의 유형과 여러 장기와 조직의 중요한 구성 요소입니다. 섬유 아세포의 생리와 병리 여러 기관에서 fibroses, 비후성 흉터 다음 화상, 허혈 다음 심장 기능 상실, 암 기질의 형성을 포함하여 임상 기관의 스펙트럼을 기초. 그러나, 섬유 아 세포는 크게 인해 고유의 이질성에, 셀의 잘못 특성화 유형 남아있다. 섬유 아 세포의 분리를위한 기존의 방법은 근본적으로 세포의 표현형과 행동에 영향을 미치는 세포 배양의 시간이 필요합니다. 따라서, 섬유 아세포 생물학을 연구 많은 연구는 체외 조작에 의존하고 정확하게 생체 내에서 섬유 아세포의 동작을 캡처하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 preservi함으로써, 세포 배양을 필요로하지 않는 성인 마우스의 등쪽 피부 섬유 아세포의 분리에 대한 FACS 기반 프로토콜을 개발생리적 전사 및 각 셀의 프로테옴 프로파일을 겨. 우리의 전략은 혈통 음의 게이트를 통해이 아닌 중간 엽 계통의 배제를 허용 (린 -)가 아니라 특정 표면 마커를 발현하는 섬유 아 세포의 하위 집단의 사전 선택 또는 농축을 방지하고이 이질적인에서 가능한 한 포함 될 수있는 긍정적 인 선택 전략을보다 세포 유형.
서론
섬유 아세포는 자주 플라스틱 기판에 부착 스핀들 모양의 세포로 형태 학적으로 정의된다. 합성 섬유 아세포 및 배아 및 성체 기관 (1)의 세포 외 매트릭스를 리모델링을 담당 원리 세포 유형이다. 섬유 아세포는 포유류의 개발에 중요하며, 따라서 각 조직 및 기관에 존재하는 세포 유형 이웃의 동작에 영향을 미치는 세포 외 환경에 실질적으로 기여한다.
섬유 아세포는 엄청난 임상 부담의 원인이 의료 조건의 다양한 세트 뒤에 주요 세포 유형입니다. 병리학 섬유 아세포 활성은 정상 조직의 기능 손상 및 피부 상처 치유, 죽상 동맥 경화증, 전신성 경화증, 혈관 손상 2-5 후 아테롬성 플라크의 형성 다음 조직 (예 : 폐, 간 등) 장기 섬유증, 반흔을 포함한다. 특히 상처 치유, 모두 급성과 만성, D를 포함정상 조직 등에도 유사한 기능이나 그것을 둘러싼, 다양한 병리학 적 상태에 걸쳐 상당한 이환율을 초래 흉터 조직의 eposition. 손상 후,이어서, 구조적 ECM 성분을 분비하는 세포 유형에 인접한 주변 분비 효과를 발휘하고, 흉터 조직 (6)을 증착하여 기계적 안정성을 복원 근섬유 아세포로의 전환이있다.
피부 조직에서 발달 시간에....
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프로토콜
이 프로토콜은 실험 동물 관리에 스탠포드 대학 행정 패널에 의해 승인 된 방법을 따른다.
쥐 진피 1. 소화
- 케타민 100 ㎎ / ㎏ + 자일 라진 (20) ㎎ / ㎏ + 아세 프로 마진 3 ㎎ / ㎏의 복강 내 주사하여 마취 후 경추 탈구로 쥐를 안락사.
참고 : 다양한 연령과 배경을 사용할 수 있습니다. - 면도와 지느러미 피부를 털을 뽑다. 약 100,000 세포 등쪽 피부 조각 X 100mm 60mm로부터 분리 될 수있다.
- 깨끗한 건조 멸균 표면에 70 % 에탄올 대신에 마우스를 담근다.
- 즉시 멸균 해부 가위를 사용하는 등의 마우스 피부를 수확. 암컷 마우스에서 유방 조직을 포함한 피.
- 꼬리의 기초부터 텐트까지 피부에 집게를 사용하여 문헌-근막면을 따라 절개하기 전에 가로 절단을합니다.
- 조심스럽게 수확하는 동안 어떤 피하 지방을 포함하지 않도록피부. 어떤 피하 지방의 수확 피부를 검사하고 조심스럽게 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 긁어.
- 얼음에 PBS 세척을 5 배 뒤에 betadine에서 수확 피부를 씻어.
주 : 오염을 방지하기 위해 가능한 무균에 가까운 피부를 유지하는 것이 중요하....
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결과
이 방법 (도 1)의 유효 기간은 27 일 최근의 간행물에 상세하게 검사 할 수있는 방법의 다수 확인되었다. 이러한 분류 세포 대량 세포와 갓 분류 세포의 단일 세포 전사 분석의 면역 세포를 포함한다. 섬유 아세포를 정렬 직접보다는 더 정확하게 문화에 의존하는 것은 자신의 생체 표현형을 캡처합니다. 오히려 긍정적 인 선택 방식보다 혈통 부정적인 고갈 방식 (그림 2A)를 사용하면 특정 하위 집단에 대한 사전 선택을 방지 할 수 있습니다. 이 접근법의 값은 최근 전술하지 진피의 수준에서 CD26 양성 섬유 아세포의 존재를 식별 Rinkevich 외. (27)에 의해 입증되었다.
섬유 아세포의 배양 과정은 유전자 발현에서 유의 한 변화를 유도하는지 확인하기 위해, 우리는 섬유 아세포에 교양 배양 섬유 아세포를 비교하는 마이크로 어레이를 이용했다. 우리는 섬유 아세포를 배양즉 두 가지 기술이 원고 및 공지 조직 이식편 프로토.......
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토론
이 논문에 설명 된 프로토콜이 하위 집단을 위해 선택 또는 후속 분석하기 전에 세포 배양에서의 시간이 필요하거나 기존의 방법에 비해, FACS 기반 정렬하여 섬유 아세포를 분리하는 수단을 제공한다. 섬유 아세포의 선별을 피부로부터 채취 필요한 시간은 약 6 시간이고; 그러나, 수확에 사용 된 마우스의 수는이 추정에 영향을 미칠 것이다.
프로토콜의 몇 가지 포인트는 특별한주의가 필요합니다. 첫째는 분리 과정과 원심 분리 소화 다음 소화 상청 상부 지방층을 제거하기 전에 피부에서 지방의 제거에 의해 지방 세포의 오염을 제한한다. 일부 지질 구성 요소가 튜브의 플라스틱 벽에 부착 이후 펠렛 세척을 오염시킬 수 있으므로 세포 펠렛 후 또한 신선한 튜브로 변경하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 두 번째 점은 표피에서 별도의 진피에 세심한주의를 포함표피 - 진피의 접합을 따라. 표피 세포를 오염하는 것은 FACS 고갈 전략에 의해 제거되지만, 여기에 오염을 제한하는 노력이 계속되어야한다.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 (HPL에) NIH 보조금 R01 GM087609, (MTL에) (HPL에) 앤서니 슈, NIH 보조금 U01의 HL099776의 명예에 잉그리드 라이 빌 슈의 선물, Hagey 실험실에서 보조금에 의해 부분적으로 지원 소아 재생 의학 및 오크 재단 (MTL에, GCG와 HPL). GGW 의학의 스탠포드 대학, 스탠포드 의료 과학자 훈련 프로그램에 의해 지원 및 NIGMS 훈련 보조금 GM07365했다. ZNM는 성형 외과 재단 연구 활동 그랜트와 Hagey 가족 기금에 의해 지원되었다. MSH는 캘리포니아 재생 의학 연구소 (CIRM) 임상 연구원 교육 교부금 TG2-01159, 악안면 외과 의사의 미국 사회 (ASMS) / 악안면 외과 재단 (MSF) 연구 그랜트 수상하고, 이식 및 조직 공학 원정대 수상에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 외과 겸자, | Kent Scientific | INS650916 | |
| 마이크로 가위 | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone 요오드 준비 용액 | Dynarex | 1415 | |
| Nair (제모 크림) | Church and Dwight Co. | ||
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μ m 필터 | 피셔 사이언티픽 | 08-771-1 | |
| 70 μ m 필터 | 피셔 사이언티픽 | 08-771-2 | |
| 100 μ m 필터 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| 프로피듐 요오드화물 (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
참고문헌
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
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재인쇄 및 허가
