Introduction
הבנת מבנה חלבון ברמה אטומית היא מפתח לחשיפת הבסיס המולקולרי של מחלות ומסלולים ביולוגיים. קריסטלוגרפיה חלבון X-ray היא השיטה הנפוצה ביותר / ישימה לקביעת מבני macromolecular. האתגר העיקרי של שיטה זו הוא קבלת כמות מספקת של חלבון מקופל כראוי, טהור. זה הופך להיות בעיה במיוחד בעבודה עם חלבונים מופרשים יונקים, שעוברים לאחר translational שינויים ספציפיים.
חלבוני bacterially-הביעו הם המקור העיקרי של חלבונים התגבשו הופקדו בחלבון נתוני בנק 1. מערכות ביטוי חיידקים במידה רבה הם העדיפו כי הם מהירים, זולים ובדרך כלל לייצר תשואות גבוהות של חלבון. עם זאת, תחומים תאיים של חלבוני יונקים לידי ביטוי בחיידקים לעתים קרובות אינם מקופלים כראוי, שבו נדרשים צעדי מקרה refolding וטיהור נרחבת לקבלת הומוגנית FOחלבון lded. בנוסף, רבים חלבונים יונקים דורשים glycosylation לאחר translational להשיג קיפול נכון 2. למרות שהביטוי וglycosylation בתאי שמרים או חרק יכולים להתגבר על הבעיה מתקפלת, לאחר translational שינויים, כוללים glycosylation, שונים באופן משמעותי מאלה של תאי יונקים 3, מניב חלבונים עם שינויים לא נכונים או שאינם הומוגנית.
תאים יונקים להביע כל המכונות מולקולריות הנדרשות על מנת להבטיח שלאחר translational שינויים נכונים ומתקפל; עם זאת, מערכות ביטוי אלה אינן העדיפו בדרך כלל על ידי רוב המעבדות, בשל תשואות מוגבלות ועלויות גבוהות של חומרים כימיים וחומרים מתכלה. Polyethyleneimine (PEI), מגיב transfection סטנדרטי הוא זול יחסית, אך מטיל רעיל רבות ויעילות transfection נמוכה, וכתוצאה מכך העלויות מוגברות בתקשורת סלולארי, ה- DNA, וculturing ציוד. חלופות רבות לPEI הן יקרות. אנו פוניםנושאים אלה על ידי המתאר שילוב של כלים תרבית תאים השתפרו וששונה כימי PEI לשיטה מהירה וזולה יחסית לביטוי של חלבונים מופרשים יונקים, ואחריו טיהור בשלב יחיד. שיטה חזקה זה נותנת תשואות מספיקות ללימודים תפקודיים וביוכימיים 4, ובמקרים מסוימים, גורמת לחלבון ניתנים לגיבוש ללא טיהור נוספת.
פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות למקסם ביטוי ולהניב לחלבונים מופרשים יונקים באדם כליה עוברית (HEK) 293F תאים שגודלו בהשעיה. כל יעילות transfection (ועלות), ייצור חלבון וטיהור משופרת מאוד על ידי הבא בפרוטוקול זה. PEI שונה על ידי התוספת של carbamates באמצעות תגובת טבעת פתיחת שלב יחיד (PEI-TMC-25, סינתזה ותכונות מתוארות בפירוט בנ"צ 5) משפרים באופן משמעותי את יעילות transfection, מפחית את רעילה מקטיוניהפרעה קרום ולכן מקטינה את עלויות ניסוי. יתר על כן, כדאיות תא וביטוי חלבון הם השתפרו מאוד עם התוספת של תוספי התרבות לספק גלוקוז וויטמינים. חשוב לציין לייצור חלבונים מסוכרים, טיפול בkifunensine, מעכב כימי רעיל של Mannosidase אני, מייצר חלבונים עם, glycans בוגר מוגדר, אשר ניתן להסירו על ידי EndoHf endoglycosidase להניב חלבונים עם N-acetylglucosamine אחת במקום של באורך מלא N צמוד סוכרים 6. לבסוף, את ההפרשה של חלבונים לתוך מדיום סרום ללא, הגדרה כימית מאפשרת טיהור מהירה וקלילה ללימודים מבניים ביוכימיים. טיהור שרף חומצת ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נת"ע) בשלב יחיד מסירה את רוב זיהום מינים בsupernatant ו, במקרים מסוימים, יכול להניב חלבון של טוהר מספיק לגיבוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקה של כמויות מיליגרם של פלסמיד דנ"א לtransfection חולף בקנה מידה גדולה
- לשכפל את החלבון של עניין לתוך וקטור גבוה עותק מספר יונקים ביטוי באמצעות שיבוט אתר הגבלה, או טכניקה מתאימה אחרת.
- לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש pHLsec 7 וקטור, שבה יש מובנה 6His תג C-מסוף, רצף חזק אמרגן קוזאק ואות הפרשה מותאמת.
- להפוך את הפלסמיד על תאים המוסמכים.
- הוסף 20 μl של תאי חיידק המוסמכים על 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ודגירה על קרח למשך 30 דקות.
- תאי הלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 35 שניות, ואז לדגור על קרח למשך 2 דקות.
- להוסיף 300 μl של מדיום חיידקי צמיחה (SOC) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, רועד ב 220 סל"ד.
- תאי צלחת על צלחת אגר עם מבחר אנטיביוטי מתאים.
- השתמש 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin אם פלסמיד הוא בוקטור pHLsec.
- מושבות תרבות ב 250 מיליליטר של מרק לוריא (LB) מדיה בתוספת 100 מיקרוגרם O / מיליליטר אנטיביוטיקה (carbenicillin) / N על 37 מעלות צלזיוס, רועדות ב 220 סל"ד.
- לטהר DNA מתרבות באמצעות ערכת Hi-Speed פלסמיד מקסי פי הפרוטוקול של היצרן.
- Elute DNA במאגר EB (10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5), במקום מאגר TE.
- Aliquot פלסמיד המטוהר בסכום הדרוש לtransfection ולאחסן ב -20 ° C.
2. בקנה מידה גדול תרבות והחלוף Transfection של תאים 293F
- תוסף מדיה 1 L 293F עם 10 מיליליטר של גלוטמין ו 5 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס (שני 100x). חנות ב 4 מעלות צלזיוס. 5 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס הוא כוח מספיק בתנאי סרום ללא וריכוז האנטיביוטיקה המופחת משפר כדאיות תא במהלך transfection, אשר משפר את תשואות חלבון.
- תאי 293F תרבות בתקשורת 300 מיליליטר בפוליקרבונט 1 ליטר מבולבל צלוחיות Erlenmeyer עם כובע פרקים במעלות צלזיוס 37 עם 8% CO 2, תוך רעד בתרבית רקמת חממה סטנדרטית.
- לדלל תאים עד 5 x 10 5 / מיליליטר צפיפות יום אחד לפני transfection.
- ביום transfection, בינוני תרבות תוספת על ידי הוספת 10% בנפח של 2% w / v Boost הסלולרי בתקשורת 293F.
- למדוד ריכוז סוכר באמצעות מד סוכר לפי הוראות היצרן ותוספי שימוש לפי צורך כדי להשיג ריכוז הגלוקוז של 500 מ"ג / ד"ל.
- להוסיף kifunensine (1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) בשלב זה כדי לשלוט glycosylation חלבון.
- נפח לחשב של DNA הנדרש לפלסמיד 1 מיקרוגרם לכל 1 x 10 6 תאים. בתנאים סטריליים, לדלל DNA במדיום סרום ללא 5 מיליליטר.
- חישוב נפח של מגיב transfection נדרש לפלסמיד 1 מיקרוגרם לכל 2 μl מגיב transfection. בתנאים סטריליים, לדלל מגיב transfection (PEI-TMC-25) במדיום סרום ללא 5 מיליליטר.
- לְהוֹסִיףמגיב transfection לפתרון ה- DNA במרווחים של 1 מיליליטר, ערבוב בעדינות. דגירה של 30 דקות ב RT עבור מתחמים מגיב-דנ"א ליצירת. לאחר מכן להוסיף את הפתרון על גבי התאים בצורה טיפה חכמה.
- אפשר תאי transfected לבטא חלבון ל72-96 שעות. מוסף עם ~ מדיה 10% שפר נפח תא יומי, או לפי צורך כדי לשמור על רמת סוכר בקריאה 400-600 מ"ג / ד"ל.
3. טיהור
- למזוג לתוך בקבוק תרבות צנטריפוגות, צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 1300 XG כדי גלולה תאים ולאחר מכן לאסוף את supernatant. אם יש צורך, לסובב פעם שנייה ו / או להשתמש במסנן 0.22 מיקרומטר להבהיר supernatant.
- הוסף חוצץ 10% 10x נפח Ni-נת"ע מחייב (1.5 M NaCl, 0.5 ח"כ 2 4 HPO, 0.1 מ 'טריס pH 8.5, 50 מ"מ imidazole).
- הכן עמודה הכבידה על ידי הוספת 2 מיליליטר של תרחיף Ni-נת"ע בטור וequilibrating עם 10 כרכי עמודה (CV) של חיץ מחייב 1x. במידת האפשר, לעשות את כל צעדי הטור בחדר 4 ° C. Alternativאיליי, חלבון צינה וכל המאגרים על קרח לפני צעד טור, ולשמור על חלבון ונאסף זרימה דרך על קרח.
הערה: תרחיף Ni-נת"ע הוא שרף 50% בנפח והקיבולת מחייבת המוצהרת של הייצור היא 50 מ"ג / מיליליטר. חרוזים Ni-נת"ע ניתן מחדש מחויבים עבור שימושים מרובים - לזרום supernatant על השרף ולאסוף זרימה דרך. חזור על שלב זה.
- לשטוף עם 10 קורות חיים של חיץ לשטוף (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ K 2 4 HPO, pH imidazole 20 מ"מ 8).
- Elute החלבון ב5 קורות חיים של חיץ elution (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ K 2 4 HPO, 250 pH imidazole 8 מ"מ).
- אם נדרש deglycosylation:
- עבור נפח סופי של 0.5 מיליליטר, להתרכז eluate ל0.43 מיליליטר באמצעות concentrator צנטריפוגה. אם משקעים צורה, גלולה כל פסולת על ידי צנטריפוגה ב16,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 50 μl של pH 500 מ"מ Na-ציטראט 5.5.
- הוסף 20 μl של EndoHf (1 x 10 6 U / ml). לדגור על RT עבור שעה 2.
לֹאדואר: האנזים עובד בצורה אופטימלית על 37 מעלות צלזיוס, אשר עלול לגרום לחלבון המרוכז כדי לצבור. להאריך את הדגירה RT, אם deglycosylation, שהוערך על ידי SDS-PAGE או immunoblotting, אינו שלם. האנזים אין פעילות ב 4 מעלות צלזיוס. - כדי להסיר EndoHf: לשטוף amylose שרף 3x בופר פוספט (PBS) או חיץ אחסון סופי. דגירה חלבון עם שרף עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. ספין 5 דקות XG ב 1000 לגלולת חרוזים ולאסוף את supernatant.
- להתרכז חלבון באמצעות מסנן צנטריפוגה המתאים מולקולרי הפסקת משקל וחיץ תמורה למאגר אחסון (150 מ"מ NaCl ו -20 מ"מ HEPES pH 7.5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במסמך זה המפורט להלן התוצאות של מערכת ביטוי זה חל על תחום אימונוגלובין kDa 13 מופרש (איג) מקולט החלבון מפעילה האדם הביע על תאי מיאלואידית 2 (hTREM2, שאריות 19-132). TREM2 הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג המכיל תחום איג תאי יחיד שיש לו שתי אגרות חוב דיסולפיד ושני אתרי glycosylation N צמודים. בניגוד לרבי חלבוני תחום איג אחרים 8, TREM2 לא היה נוח למקפלים מגופי הכללת חיידקים 9. glycans אישר mutagenesis לאחר N הצמוד נדרש לביטוי וקיפול נכונים. כדי להקל על מחקרים מבניים ותפקודיים, TREM2 הוכנס וקטור pHLsec עם 6His תג C-מסוף 7 תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטית. ביטוי חולף בתאים שטופלו בHEK293F kifunensine הניב חלבון שמטוהר על ידי כרומטוגרפיה Ni-נת"ע (איור 1, מסלול 2) והמדגם אז deglycosylated לייצר נתיvely מקופל, חלבון הומוגני (איור 1, מסלול 3). ביטוי 293F של TREM2 מיוצר 5-10 מ"ג / ליטר (5-10μg / מיליון תאים transfected). לאחר חיץ החלפה למאגר האחסון, חלבון זה התגבש (איור 1 ג). למרות טוהר הסופי של כ -80%, גבישים אלה באופן מהימן לשכפל, מתפזרים, והוצגו על ידי כסף-כתם למכילים חלבון TREM2 (1D איור) בלבד. תצפית זו מרמזת הומוגניות ביוכימיים של החלבונים (כלומר, מתקפל ולאחר translational שינויים) יכולים, במקרים מסוימים, להיות קריטיים יותר מטוהר הכולל להצלחת גיבוש.
בנוסף לגיבוש, מערכת זו מציעה כלי חזק ללימודים מבניים ופונקציונליים. הוא ניצל לייצר חלבון glycosylated מקורי ולהשיג> טוהר 95% על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה (איור 1E, F). צעד זה נוסף לטיהור, אשר מציג את solution התנהגות של החלבון, גם דרך אידיאלית כדי לפקח על איכות חלבון. החלבון המטוהר צריך elute בהיקף המתאים למשקל המולקולרי שלו וצריך להיות המין הנפוץ ביותר במדגם. באופן חריג כמויות גדולות של חלבון מצטבר עשויות להצביע על חלבון יציב ולספק רמזים כדי לייעל את ייצור חלבון וטיהור. יתר על כן, חלבון מטוהר סופי זה הוא מעולה לשימוש בניסויים ביו-פיסיקליים כמותיים כגון ספקטרוסקופיה המעגלית dichroism, יציבות תרמית, ואינטראקציות חלבון-ליגנד חוקרים. לבסוף, השליטה היקף glycosylation מספקת כלי חזק ללמוד פונקציות סוכרים-תלויים.
מערכת ביטוי באיור 1. יונקים: (א) תכנית לביטוי של חלבונים יונקים עם glycosylation מבוקרת או ילידים בתאי HEK 293F. ( B) SDS-PAGE של hTREM2 מטוהר-NiNTA הביע תחת kifunensine מוצג לפני (מסלול 2) ואחרי () deglycosylation מסלול 3 עם EndoHf. גבישים (C) המופקים מחלבון NiNTA-מטוהר וdeglycosylated. כתם (ד) כסף של קלט התגבשות (מסלול 1) וגבישים שנקטפו (נתיבים 2 ו -3) מגלים גבישים מכילים רק TREM2. (ה) לטיהור נוספת של TREM2 הושגה באמצעות כרומטוגרפיה גודל הדרה של TREM2 מטוהר-NiNTA מיוצר בתאים 293F ללא Kifunensine. כוכביות (*) מצביעות כרכי elution של סטנדרטים משקל מולקולריים. חלבוני eluted בכפות באמצעות טור אנליטיים S200 (GE). חלבון קלט (מסלול 2) ושיא מקופל (מסלול 3): ניתוח SDS-PAGE של TREM2-מטוהר הדרת הגודל (F). שים לב איך מלא, glycans הטרוגנית לרוץ במשקל מולקולרי גבוהה יותר לכאורה עם כתם רחב על ידי SDS-עמוד.nk "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי HEK 293F מציעים ייצור חזק של חלבונים הדורשים שלאחר translational שינויים. מערכת זו מאפשרת ביטוי מהיר וניתן להרחבה של חלבונים מקופלים באופן מקורי המכילים disulfides, glycosylation, וזרחון שאחרת היה היעדר שימוש בכלים ביטוי שיגרתי יותר. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש לביטוי והטיהור של חלבון מתחמים רב פשוט על ידי שיתוף transfection של פלסמידים מרובים. חוץ מזה TREM2, מערכת זו נעשתה שימוש נרחב ללימודים פונקציונליים עם חלבונים אחרים בעלי עניין במעבדה 10,11. תאי יונקים מציעים גם אופטימלי ביטוי חלבון-רעלן פנימי ללא לin vivo ניסויים או לייצור של אנטיגנים מקופלים באופן מקורי ליצירת נוגדני קונפורמציה תלויה.
תנאי כדאיות תא וtransfection אופטימליים הם החיוניים ביותר לייצור חלבון יעיל. לכדאיויות תא טובות יותר, תרביות תאים נמוך מעבר הם שיפרועם תוספי תרבית תאים וריכוז האנטיביוטיקה בתקשורת הצמיחה מופחתת. יש PEI-TMC-25 שונה יעילות חיתוך רוחב מתאימה עם רוב החלבונים; עם זאת, ישנן אפשרויות זמינות אחרות במחיר מתון המציעות יעילות transfection מוגברת ורעילים מופחתים. Hype 5 (עוז Bioscience) מגביר תשואות לעומת PEI או חומרים כימיים אחרים, במחיר מופחת במידה ניכרת בהשוואה לחומרים כימיים transfection יקרים יותר, כגון 293fectin. הסוג מגיב ו- DNA: יחסים מגיב יכולים להיות מותאמים לביטויים אישיים ואת הצרכים של הניסוי הרצוי.
יש השיטה המתוארת כאן יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות של ייצור חלבון. תאי יונקים מציעים מתקפלים מלווה מקומי ולאחר translational שינויים זמינים לחיידקים ושמרים. הזמן המופחת לבניית פלסמיד והכנה, לאורך השימוש באמצעי התקשורת, את ה- pH שלו יכול להיות שונה באופן ישיר, להפוך אותו עדיף על baculovirייצור המבוסס בתאי חרקים; ולבסוף, הסרום ללא מדיה מציעה קנה מידה קלילה (צפיפות תאים גבוהה יותר) וטיהור לא ברת השגה לתאי 293T חסיד. המגבלה העיקרית של מערכת זו היא רק הזמן ואת קנה המידה של החוקר הבודד מסוגל להתחייב לביטוי חלבון.
כלול להלן אפשרויות לפתרון בעיות לבעיות הנפוצות ביותר נתקלו.
פתרון תקלות
אם יש ביטוי חלבון נמוך, להימנע passaging 293F תאים יותר מ 2-3 חודשים. תוצאות passaging ממושכות בבריאות תא ירידה באו לידי ביטוי בזמני הכפלה איטיים ומופחתים ביטוי חלבון באופן משמעותי. צמיחת תאים צריכה להיות במעקב יומי וצריכה להיות מושלכות תרבויות כבר לא הכפלה יומית. כדאיות תא יכולות להשתפר על ידי שימוש בתוספי תרבות תוך passaging תאים. צג גלוקוז כדי להבטיח ריכוז תרבות של 400-600 מ"ג / ד"ל צפיפות תאים לא יעלה על 2 מ'/ מיליליטר וכדאיות תא צריכים להיות ≥98% על ידי הרחקת trypan הכחולה. לדלל תאים צפופים 0.5 מיליון / מיליליטר ולאפשר להכפיל O / N לפני transfection. לייעל transfection באמצעות יחסים שונים של מגיב transfection: DNA (בטווח של ה- DNA 1 מיקרוגרם: 1.5-6 מגיב μl). ניתן לעשות זאת באמצעות 2 מיליליטר תרבויות בצלחת 6 היטב והתפוקה נמדדת על ידי immunoblotting. עושה 12 נקודות זמן hr יכול לציין אם החלבון מתבטא ומושפל במהירות; לבדוק את lysate התא אם חלבון לא נצפה בשבריר supernatant. חלבוני Misfolded, שמצליחין להיות מופרשים, עדיין יהיו נראות לעין בlysate התא על ידי immunoblotting.
אם החזקת Ni-נת"ע היא נמוכה, כלומר, החלבון נשאר בזרימה דרך אחרי הטור מחייב, להשתמש שרף טרי. הגדלת ה- pH של מדגם 8.5 תגרום חזקים מחייב את השרף, אם כי זה יהיה גם להגדיל הלא ספציפי מחייב. ריכוז המדגם ותצוו מחייב O שרף / N ב 4 ° C להיותקדמי טיהור Ni-נת"ע עלולה לגרום לעליית 5x ~ בחלבון התאושש. אם 6His התג אינו נגיש בשל מבנה שלישוני של החלבון, נסה את זה על שיבוט הסופית האחרות. לחלופין, להשתמש בשרף קובלט, שבו יש זיקה גבוהה יותר לשאריות שלו.
אם המצרפים ו / או החלבון משקע במהלך טיהור, להגדיל מסיסות ידי הוספת גליצרול 10% לNi-נת"ע לשטוף ומאגרי elution. הפעל את עמודות זיקת ניקל ב RT במקום 4 מעלות צלזיוס. השתמש fluorimetry סריקת ההפרש 12 למסך לpH ומלח / תוספים המגבירים את יציבות של החלבון בתמיסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
