Introduction
Forstå proteinstruktur på et atomært nivå er nøkkelen til å avdekke molekylære grunnlaget for biologiske trasé og sykdommer. Røntgen-krystallografi protein er den mest brukte / anvendelig metode for å bestemme makromolekylære strukturer. Hovedutfordringen med denne metoden er å skaffe tilstrekkelige mengder av brettet skikkelig, ren protein. Dette blir et problem spesielt når du arbeider med utskilling av pattedyr proteiner, som gjennomgår bestemte post-translasjonelle modifikasjoner.
-Bakterielt uttrykte proteiner er den primære kilde til krystalliserte proteiner avsatt i Protein Data Bank 1. Bakterielle ekspresjonssystemer er i stor grad foretrukket fordi de er rask, billig og typisk produsere høye utbytter av protein. Imidlertid ekstracellulære domener av pattedyrproteiner uttrykt i bakterier, blir ofte ikke riktig foldet, i hvilket tilfelle refolding og omfattende rensetrinn er nødvendig for å oppnå homogent folded protein. I tillegg er mange pattedyrproteiner krever post-translasjonell glykosylering for å oppnå riktig folding 2. Selv om uttrykket og glykosylering i gjær eller insektceller kan overvinne folding problem, post-translasjonelle modifikasjoner, inkludert glykosylering, avviker betydelig fra de av pattedyrceller 3, noe som gir proteiner med feil eller ikke-homogene modifikasjoner.
Pattedyrceller uttrykke all den nødvendige molekylære maskineri for å sikre riktige posttranslasjonell modifikasjoner og folding; imidlertid disse ekspresjonssystemer vanligvis ikke foretrekkes av de fleste laboratorier, på grunn av begrensede avlinger og høye kostnader av reagenser og forbruksvarer. Polyethyleneimine (PEI), er en standard transfeksjon reagens relativt billig, men pålegger betydelig cytotoksisitet og lav transfeksjonseffektivitet, noe som resulterer i økte kostnader i celle media, DNA, og dyrking av utstyr. Mange alternativer til PEI er uoverkommelig dyrt. Vi henvenderdisse problemene ved å beskrive en kombinasjon av forbedrede cellekultur verktøy og kjemisk modifiserte PEI for rask og relativt billig fremgangsmåte for ekspresjon av utskilte pattedyrproteiner, etterfulgt av ett-trinns rensing. Denne robust metode gir tilstrekkelige utbytter av funksjonelle og biokjemiske studier 4, og i noen tilfeller resulterer i protein mottakelig for krystallisering uten ytterligere rensing.
Denne protokollen beskriver flere teknikker for å maksimere uttrykk og gi for utskilling av pattedyr proteiner i humane embryonale nyre (HEK) 293F celler dyrket i suspensjon. Transfeksjonseffektiviteten (og kostnader), proteinproduksjon og rensing er alle sterkt forbedret ved å følge denne protokoll. PEI modifisert ved tilsetning av karbamater gjennom en enkelt-trinns ringåpning reaksjon (PEI-TMC-25, syntese og egenskaper er beskrevet i detalj i ref 5) forbedrer transfeksjonseffektiviteten, reduserer cytotoksisitet fra kationiskemembran avbrudd og følgelig reduserer eksperiment kostnader. Videre er celleviabilitet og protein ekspresjon sterkt forbedret ved tilsetning av kultur kosttilskudd for å levere glukose og vitaminer. Viktigere for fremstilling av glykosylerte proteiner, behandling med kifunensine, et ikke-giftig kjemisk inhibitor av mannosidase I, produserer proteiner med definert, umodne glykaner, som kan fjernes ved endoglykosidase EndoHf for å gi proteiner med et enkelt N-acetylglukosamin i stedet for en full-lengde N-bundet glycan 6. Endelig tillater sekresjon av proteiner i et serum-fritt, kjemisk definert medium hurtig og lettvint rensing for strukturelle og biokjemiske studier. Ettrinns nikkel-nitriltrieddiksyre (Ni-NTA) harpiks rensing fjerner det meste av forurensende art i supernatanten og i noen tilfeller kan gi protein av tilstrekkelig renhet for krystallisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produksjon av milli Mengder av plasmid DNA for Storskala Transient Transfeksjon
- Klone proteinet av interesse inn i et høyt kopiantall pattedyrekspresjonsvektor ved hjelp av restriksjonssete kloning, eller annen egnet teknikk.
- For optimalt resultat, bruk pHLsec 7 vektor, som har en innebygd C-terminal 6His-tag, en sterk promoter Kozak sekvens og en optimalisert sekresjonssignal.
- Transform plasmidet på kompetente celler.
- Tilsett 20 pl av kompetente E. coli-celler på 1 ug av plasmid-DNA og inkuberes på is i 30 min.
- Varmesjokk celler ved 42 ° C i 35 sekunder, deretter inkuberes på is i 2 min.
- Tilsett 300 ul av mikrobiell vekst-medium (SOC) og inkuber ved 37 ° C i 45 minutter, risting ved 220 rpm.
- Plate celler på agar plate med passende antibiotikavalg.
- Bruk 100 ug / ml karbenicillin hvis plasmidet er i pHLsec vektoren.
- Kultur kolonier i 250 ml Luria-buljong (LB) medier supplert med 100 ug / ml antibiotikum (karbenicillin) O / N ved 37 ° C risting ved 220 rpm.
- Rense DNA fra kultur bruker Hi-Speed Plasmid Maxi Kit henhold til produsentens protokoll.
- DNA elueres i buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), i stedet for buffer TE.
- Delmengde renset plasmid på beløpet som trengs for transfeksjon og oppbevares ved -20 ° C.
2. Storskala Kultur og Transient Transfeksjon av 293F Cells
- Supplement 1 L 293F media med 10 ml glutamin og 5 ml Pen / Strep (begge 100x). Oppbevar ved 4 ° C. 5 ml Pen / Strep er en tilstrekkelig styrke i serumfrie betingelser og den reduserte antibiotiske konsentrasjon forbedrer cellelevedyktigheten ved transfeksjon, som forbedrer proteinutbytter.
- Kultur 293F celler i 300 ml media i en L polykarbonat baffled Erlendmeyerkolber med ventilert lokks ved 37 ° C med 8% CO2, under rysting i en standard vevskulturinkubator.
- Fortynn cellene til 5 x 10 5 / ml tetthet én dag før transfeksjon.
- På dagen for transfeksjon, supplement dyrkningsmedium ved tilsetning av 10% volum av 2% w / v Cell Boost i 293F media.
- Måle glukosekonsentrasjonen ved hjelp av en glukosemåler i henhold til produsentens instruksjoner og bruke kosttilskudd som nødvendig for å oppnå en glukosekonsentrasjon på 500 mg / dL.
- Legg kifunensine (1 mikrogram / ml endelig konsentrasjon) på dette trinnet for å kontrollere protein glykosylering.
- Beregn volumet av DNA som kreves for en ug plasmid per 1 x 10 6 celler. Under sterile betingelser, fortynnes DNA i 5 ml serumfritt medium.
- Beregn volumet av transfeksjon reagens som kreves for en ug plasmid per 2 ul transfeksjon reagens. Under sterile betingelser, fortynnet transfeksjon reagens (PEI-TMC-25) i 5 ml serumfritt medium.
- Legg tiltransfeksjon reagens til DNA-oppløsningen i trinn på 1 ml, bland forsiktig. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur for reagens-DNA-komplekser for å danne. Deretter legger løsningen på cellene i en drop-klok måte.
- Tillat transfekterte celler til å uttrykke proteinet i 72-96 timer. Supplement med ~ 10% volum Cell Boost Media daglig, eller som er nødvendig for å holde blodsukkerresultat 400-600 mg / dl.
3. Rensing
- Dekanter kultur i en sentrifuge kolbe, sentrifuger i 20 min ved 1300 x g for å pelletere cellene, og deretter samle supernatanten. Hvis det er nødvendig, å spinne en andre gang, og / eller bruke 0,22 um filter for å klargjøre supernatant.
- Tilsett 10 volum% Ni-NTA 10x bindingsbuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
- Tilbered en tyngdekraft-kolonne ved å tilsette 2 ml Ni-NTA slurry i en kolonne og ekvilibrering med 10 kolonnevolumer (CV) av 1 x bindingsbuffer. Hvis det er mulig, gjøre alle trinnene kolonne i et 4 ° C rom. AlternativEly, kjøle protein og alle bufferne på is før kolonne trinnet, og holder protein og samlet gjennomstrømning på is.
Merk: Ni-NTA slurry er 50% harpiks volum- og fremstilling er angitt bindingskapasitet er 50 mg / ml. Ni-NTA perler kan lades for flere bruksområder - Strømnings supernatanten over harpiksen og samle gjennomstrømning. Gjenta dette trinnet.
- Vask med 10 CV vaskebuffer (300 mM NaCl, 50 mM K HPO 2 4, 20 mM imidazol pH 8).
- Elueres proteinet i 5 CV elueringsbuffer (300 mM NaCl, 50 mM K HPO 2 4, 250 mM imidazol pH 8).
- Hvis deglykosylering kreves:
- For et sluttvolum på 0,5 ml, konsentrerer eluatet til 0,43 ml ved hjelp av en sentrifugering konsentratoren. Hvis bunnfall form, pellet eventuelt avfall ved sentrifugering ved 16 000 xg og 4 ° C.
- Tilsett 50 ul av 500 mM Na-Citrat pH 5,5.
- Tilsett 20 ul EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Inkuber ved RT i 2 timer.
Ikkee: Enzymet virker optimalt ved 37 ° C, noe som kan føre til det konsentrerte protein til å aggregere. Utvid RT inkubasjon, hvis deglykosylering, vurdert av SDS-PAGE eller immunoblotting, er ufullstendig. Enzymet har ikke aktivitet ved 4 ° C. - Slik fjerner EndoHf: Vask Amylose Resin 3x i fosfatbufret saltvann (PBS) eller endelig lagring buffer. Inkuber protein med resin i 1 time ved 4 ° C. Spin 5 min ved 1000 x g for å pelletere perler og samle supernatanten.
- Konsentrer protein ved hjelp av egnet molekylvekt cutoff sentrifugefilter og bufferutveksling inn i lagringsbuffer (150 mM NaCl og 20 mM HEPES pH 7,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heri følger resultatene av dette ekspresjonssystem anvendes på en utskilte 13 kDa immunoglobin (Ig) domene fra det humane proteinet utløser-reseptoren uttrykt på myeloide celler (2 hTREM2, rester 19-132). TREM2 er et type I transmembranprotein som inneholder et enkelt ekstracellulært Ig domene som har to disulfidbindinger og to N-bundne glykosyleringsseter. I motsetning til mange andre Ig domene proteiner 8, TREM2 var ikke mottagelig for refoldingen fra bakterielle inklusjonslegemer 9. Påfølgende mutageneseteknikker bekreftet N-koblede glykaner er nødvendig for riktig uttrykk og folding. For å lette strukturelle og funksjonelle studier, ble TREM2 innført i pHLsec vektor med en C-terminal-6His merkelappen 7 ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker. Transient ekspresjon i HEK293F celler behandlet med kifunensine gitt protein som ble renset ved hjelp av Ni-NTA-kromatografi (figur 1B, spor 2), og prøven ble deretter deglykosylert å produsere natisvis foldet, homogent protein (figur 1B, spor 3). 293F ekspresjon av TREM2 produsert 5-10 mg / L (5-10μg / million transfekterte celler). Etter buffer utveksling inn i lagringsbuffer, ble dette proteinet krystallisert (figur 1C). Til tross for den endelige renhet på ca. 80%, disse krystallene pålitelig reprodusert, diffraktert, og ble vist ved sølv-flekk til bare å inneholde TREM2 protein (figur 1D). Denne observasjonen tyder på den biokjemiske homogenitet av protein (dvs. bretting og post-translasjonelle modifikasjoner) kan i noen tilfeller være mer kritisk enn total renhet for krystallisering suksess.
I tillegg til krystallisering, tilbyr dette systemet et robust verktøy for strukturelle og funksjonelle studier. Det er utnyttet for å fremstille opprinnelig glykosylert protein og oppnå> 95% renhet ved størrelse-eksklusjonskromatografi (figur 1E, F). Denne ytterligere rensetrinn, som viser løsning;n oppførselen til protein, er også en ideell måte å overvåke proteinkvalitet. Det rensede protein bør eluere ved et volum svarende til dens molekylvekt, og bør være de mest tallrike arter i prøven. Unormalt store mengder aggregert protein kan indikere ustabil protein og gi ledetråder for å optimalisere proteinproduksjon og rensing. Videre er dette siste renset protein overlegen for bruk i kvantitative biofysiske eksperimenter slik som sirkulær dikroisme-spektroskopi, termisk stabilitet, og som undersøker protein-ligand interaksjoner. Til slutt, å styre graden av glykosylering gir et robust verktøy for å studere glykan-avhengige funksjoner.
Figur 1. Pattedyr Expression System: (A) Scheme for pattedyr uttrykk av proteiner med kontrollert eller innfødt glykosylering i HEK 293F celler. ( B) SDS-PAGE av renset NiNTA-hTREM2 uttrykt under kifunensine vist før (kolonne 2) og etter (kolonne 3) deglykosylering med EndoHf. (C) Krystaller fremstilt fra NiNTA-renset og deglykosylert protein. (D) Silver stain for krystallisering inngang (kolonne 1) og høstet krystaller (søyle 2 og 3) avdekker krystaller kun inneholder TREM2. (E) Ytterligere rensing av TREM2 ble oppnådd ved bruk av størrelses-eksklusjonskromatografi av NiNTA-renset TREM2 fremstilt i 293F-celler uten Kifunensine. Stjernene (*) angir elueringsvolum av molekylvektstandarder. Proteiner eluert i TBS ved bruk av en analytisk S200 kolonne (GE). (F) SDS-PAGE-analyse av størrelse-utelukkelses-renset TREM2: inndata protein (kolonne 2) og foldet topp (felt 3). Legg merke til hvor full, heterogene glykaner kjøre på en høyere tilsynelatende molekylvekt med en bred smøre ved SDS-PAGE.nk "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK 293F-celler gir robust produksjon av proteiner som trenger post-translasjonelle modifikasjoner. Dette systemet tillater rask og skalerbar uttrykk for opprinnelig foldede proteiner inneholder disulfider, glykosylering og fosforylering som ellers ville være fraværende ved hjelp av flere rutinemessige uttrykk verktøy. I tillegg kan dette systemet bli anvendt for ekspresjon og rensing av multiproteinkomplekser bare ved ko-transfeksjon av flere plasmider. Foruten TREM2, har dette systemet vært mye brukt for funksjonelle studier med andre proteiner av interesse i laboratoriet 10,11. Pattedyrceller har også endotoksin-fritt protein ekspresjon for optimal in vivo-eksperimenter, eller for fremstilling av nativt foldede antigener for å generere conformation avhengige antistoff.
Optimale celleviabilitet og transfeksjon betingelser som er mest avgjørende for effektiv proteinproduksjon. For bedre celle levedyktighet, er lav-passasje cellekulturer styrketmed cellekultur kosttilskudd og antibiotikumet konsentrasjonen i vekstmediet reduseres. Den modifiserte PEI-TMC-25 har egnet tran effektivitet med de fleste proteiner; Men det finnes andre alternativer tilgjengelig på moderat pris som tilbyr økt transfeksjonseffektivitet og redusert cytotoksisitet. 5 skudd (Oz Bioscience) øker utbytter sammenlignet med PEI eller andre reagenser, til en betydelig redusert kostnad i forhold til dyrere transfeksjon reagenser, som for eksempel 293fectin. Reagenset type og DNA: reagens-forhold kan optimaliseres for individuelle uttrykk og behovene til den ønskede eksperimentet.
Fremgangsmåten som er beskrevet her har en rekke fordeler fremfor andre fremgangsmåter for protein produksjon. Pattedyrceller har opprinnelig anstand bretting og post-translasjonelle modifikasjoner utilgjengelig for bakterier og gjær. Den reduserte tiden for plasmidkonstruksjon og forberedelse, langs bruk av media, pH-verdien av disse kan modifiseres direkte, gjør det overlegent baculoviross basert produksjon i insektsceller; og til slutt, har det serumfrie media lettvinte skalering (høyere celletetthet) og rensing ikke oppnåelig for adherente 293T celler. Sjefen begrensning av dette systemet er bare tiden og skalere den enkelte forsker er i stand til å forplikte seg til protein uttrykk.
Inkludert nedenfor er feilsøking alternativer for de vanligste problemene som oppstår.
Feilsøking
Hvis det er lite protein uttrykk, unngå aging 293F celler lengre enn 2-3 måneder. Forlengede aging resulterer i redusert celle helse gjenspeiles i tregere dobling ganger og betydelig redusert protein uttrykk. Cellevekst bør overvåkes daglig og kulturer ikke lenger dobling daglig skal kastes. Celleviabilitet kan forbedres ved hjelp av kulturtilskudd mens aging celler. Overvåke glukose for å sikre en kulturkonsentrasjon på 400 til 600 mg / dl Celletettheten bør ikke overstige 2 millioner / ml, ogcelleviabilitet bør være ≥98% ved trypanblått-eksklusjon. Fortynne tette celler til 0,5 millioner / ml og la den doble O / N før transfeksjon. Optimal transfeksjon ved bruk av forskjellige forhold mellom transfeksjon reagens: DNA (i området fra 1 ug DNA: 1,5-6 pl reagens):. Dette kan gjøres ved å bruke 2 ml kulturer i en 6-brønns plate og utgangs målt ved immunblotting. Gjør 12 timers tidspunkter kan indikere om proteinet blir uttrykt og hurtig degradert; sjekk cellelysatet hvis protein ikke er observert i supernatantfraksjonen. Misfoldede proteiner, som ikke klarer å bli utskilt, vil likevel fremgå av cellelysatet ved immunoblotting.
Hvis Ni-NTA oppbevaring er lav, dvs. fortsatt protein i gjennomstrømning etter kolonne binding, bruke fersk harpiks. Øker pH-verdien i prøven til 8.5 vil resultere i sterkere binding til harpiks, selv om dette vil også øke ikke-spesifikk binding. Konsentrering av prøven og batch binding til harpiks O / N ved 4 ° C blifore Ni-NTA rensing kan resultere i ~ 5x økning av gjenvunnet protein. Dersom 6His-koden er utilgjengelige på grunn av tertiærstrukturen til proteinet, kloning prøve det på den andre endestasjon. Alternativt kan bruke Kobolt harpiks, som har en høyere affinitet for His-restene.
Dersom proteinaggregater og / eller bunnfall i løpet av rensingen, øker oppløseligheten ved tilsetning av 10% glycerol til Ni-NTA vaske og elueringsbuffere. Kjør nikkel affinitetskolonnene ved RT i stedet for 4 ° C. Bruk differensial scanning fluorimetri 12 for å screene for pH og salt / tilsetninger som øker stabiliteten av proteinet i løsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
