Abstract
הכנת ממרחי כרומוזום היא תנאי הכרחי לביצוע המוצלח של הקרינה הכלאה באתר (דגים). הכנת ממרחי כרומוזום צמח באיכות גבוהה היא מאתגרת בשל קיר התא הנוקשה. אחת השיטות שאושרו להכנה של כרומוזומים מפעל הוא הכנת ירידה כביכול, הידוע גם בהפצה-טיפה או טכניקת אוויר ייבוש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנה המהיר של כרומוזום mitotic מתפשט מתאים לזיהוי הדגים של בדיקות DNA עותק יחידים וגבוהות. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת טיפת האוויר יבש מבוצעת בלחות היחסית של 50% -55%. פרוטוקול זה כולל מספר מופחת של שלבי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. יתרונות ברורים של גישה זו הם גם התפשטות, כרומוזומים metaphase ניזוק ורבים המשרתים כתנאי מושלמים לניתוח FISH מוצלח. שימוש בפרוטוקול זה השגנו כרום באיכות גבוההosome ממרחים ותוצאות FISH לשחזור לvulgare Hordeum, bulbosum ח ', ח' marinum, murinum ח ', ח' וpubiflorum cereale Secale.
Introduction
הקרינה הכלאה באתר (דגים) היא כלי יעיל למיפוי הפיזי של רצפי עותק יחידים וגבוהים ברמת כרומוזומליות. התנאי המוקדם הוא הכנת ממרחי כרומוזום באיכות גבוהה. אין פרוטוקול הכנת כרומוזום כללי שיהיה פחות מתאים לתאים של בעלי חיים וצמחים. הכנה של כרומוזומים צמח היא מאתגרת במיוחד בשל הקיר הנוקשה תא ועקביות ציטופלסמה שונות במינים שונים. אחת השיטות הטובות להכנה של כרומוזומים צמח הוא טכניקת ירידה כביכול הידוע גם בטכניקה מתפשט שחררה ו1,2 טכניקת אוויר ייבוש. שיטה זו הוצגה לראשונה בשנת 1958 על ידי Rothfels וSiminovitch במבחנה תאי יונקים גדלו 3. מאוחר יותר מרטין et al. 4 וקאטו et al. 5 מותאם שיטה זו לצמחים.
לאחרונה, 'SteamDrop שיטה בשם &# 39; פותח אשר משמש קיטור מים להכנה של כרומוזומים שאינם חופף 6. אמנם, ההשפעה החיובית של לחות גבוהה נצפתה קודם לכן 7, 'SteamDrop' מספק זרימת עבודה מבוקרת של הכנות כרומוזום באיכות גבוהה 6. טיפול הקיטור גורם מתיחה של כרומוזומים כנראה קשורים לכמה שינויים של חלבוני כרומוזומליות. איכות וכתוצאה מכך מתפשט metaphase היא גבוהה מאוד, אם כי התמך של מספר המספיק של metaphase המלא מתפשט לניסויי דגים שלאחר מכן דורשים מומחיות טכנית.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנת כרומוזומים דגני mitotic המתאימים לזיהוי הדגים של בדיקות יחידים וגבוה עותק 5,8. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת שחרור האוויר יבש שתוארה על ידי קאטו 9 מבוצעים בלחות היחסית של 50% -55% (איור 1). פרוטוקול זה כולל מספר מופחתצעדי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. שימוש בפרוטוקול זה השגנו מרווחי כרומוזום באיכות גבוהה ותוצאות דגים לvulgare Hordeum, bulbosum ח ', ח' marinum, murinum ח ', ח' וpubiflorum cereale Secale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת כרומוזום
- נביטת זרעים וקיבעון של טיפים שורש
- לנבוט זרעי שעורה 10-20 בשתי שכבות של נייר סינון לח בצלחת פטרי בתנאים חשוכים במשך 2 ימים ב22-24 מעלות צלזיוס. חותך את שורשים נמרצים עם האורך של 1-2 סנטימטר מהזרע באמצעות סכין גילוח.
- הכן מים קרים כקרח על ידי הצבת בקבוק זכוכית 500 מיליליטר המכיל מים ברז קר לקרח מים מרוסקים. לאוורר את המים קרים כקרח ולטבול טיפים שורש במשך 20 שעות כדי להגביר את התדירות של תאי metaphase.
- העבר את השורשים ממים 50 מיליליטר של אתנול: חומצה אצטית (3: 1) מקבע לתקן אותם על RT עבור 2 ימים. שורשי חנות באתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (3: 1) מקבע על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש עד שנה.
- טיפול כביסה ואנזים
- לשטוף את השורשים 10-20 במים ברז קר כקרח 30 מיליליטר במשך 5 דקות פעמיים באמצעות כוס זכוכית 50 מיליליטר. השתמש במיקרוסקופ דו עיני. העבר את שורשים אחד אחד לתוך30 מיליליטר 0.01 מאגר M ציטרט (0.01 חומצת לימון + M 0.01 M נתרן ציטרט, pH 4.8) באמצעות מלקחיים ולשטוף ידי טלטול כוס הזכוכית למשך 5 דקות פעמיים. מניחים על נייר שורשי מסנן כדי להסיר את הנוזל לחלוטין ובאמצעות סכין גילוח לחתוך את הרקמה שאינה meristematic לא רצויה.
- דגירה עד 20 טיפים שורש בתערובת אנזים 1 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ -50 דקות כדי לרכך את רקמות הצמח (טבלה 1) בזכוכית שעון. תערובת אנזים מכילה 0.7% R10 cellulase, cellulase 0.7%, pectolyase 1% וcytohelicase 1% בדילול מלא 0.01 M חיץ ציטרט. אחסן את תערובת האנזים ב -20 ° C ושימוש חוזר עד חמש פעמים.
- הסר את האנזים על ידי pipetting ולשטוף את הטיפים שורש על קרח עם 5 מיליליטר 0.01 M חיץ ציטראט פעמיים כדי להחליף את האנזים שיורית.
- שריית שורש
- טיפים שורש לשטוף עם 1 מיליליטר אתנול 96% פעמיים בזהירות באותו זכוכית השעון. החלף אתנול עם מקבע (75% חומצה אצטית: 25% אתנול) מוכן טרי. השתמש 10-15מקבע μl לקצה שורש.
- טיפים העברת שורש יחד עם מקבע לתוך צינור 2 מיליליטר וmeristems השורש להתפורר עם מחט לנתח או מלקחיים. הקש הצינור 20 פעמים מחדש להשעות תאים להשיג השעיה תא. אחסן את ההשעיה התא בC עד -20 ° עד חודשים.
- שחרור של ההשעיה התא
- מניחים 2-3 שכבות של רקמת נייר ספוג מים על פלטה חשמלית על 50 מעלות צלזיוס. לטבול את השקופיות מיקרוסקופיות במים ברז קר כקרח במקרר למשך 30 דקות. ומקום מחליק על גבי רקמת נייר הלחה.
- פיפטה 7-10 μl של השעיה תא ושחרר אותו ממרחק של 20 סנטימטרים לשקופית מקוררת מונחת על הצלחת החמה. פיפטה 10 μl של תערובת חומצה אצטית-אתנול באותו המקום כמו השעיה תא בשקופית ולשמור את השקופית על הצלחת החמה למשך 2 דקות נוספות. מניחים את השקף על הצלחת החמה ללא רקמות הרטובות ולתת לו להתייבש במשך 1 דקות.
- בקרת איכות וstoragדואר של שקופיות
- בדקו שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד לשליטה באיכות התפשטות כרומוזום. השתמש בשקופיות או באותו היום או בחנות על ידי טבילה ב -96% אתנול בצנצנת Coplin ב -20 ° C.
- טיפול מקדים של שקופיות לפני FISH; כל הצעדים נעשים בRT
- מגלשות מקום בצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 2x SSC (20x SSC מכיל 3 M NaCl ו -300 ציטראט Trisodium מ"מ) במשך 5 דקות. בעזרת מלקחיים, שקופיות העברה לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 45% חומצה אצטית עבור 3-10 דקות.
- העברת שקופיות לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 2x SSC במשך 10 דקות. העברת שקופיות לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של פורמלדהיד 4% (ב2x SSC) ושקופיות לטבול במשך 10 דקות לתקן כרומוזומים.
- הסר פורמלדהיד על ידי שטיפת השקופיות 3 פעמים במשך 4 דקות כל אחד, בצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר 2x SSC. מייבשים שקופיות בצנצנת Coplin למשך 2 דקות בסדרה של 70%, 90% ו 100% אתנול, בהתאמה ומגלשות יבשות באנכימַצָב.
2. פלורסנט באתרו הכלאה (דגים)
- עבור כל שקופית, להכין פתרון הכלאה של 20 μl בסך הכל משתמש 10 μl של פוראמיד deionized, 5 μl של חיץ הכלאת 4x (200 חיץ μl מכיל 80 μl 20x SSC, 8 μl 1 M טריס- HCl pH 8.0, 1.6 μl 0.5 M EDTA, 11.2 μl 10 מיקרוגרם / μl זרע סלמון וללא מים DNase 99.2 μl), 3 μl של החללית ו -2 μl מים ללא DNase.
- הוסף 20 μl של פתרון הכלאה לכל שקופית וכיסוי עם כיסוי להחליק 24 x 32 מ"מ ולעצור את הכיסוי להחליק עם מלט גומי. לפגל שקופיות עם בדיקות בו זמנית על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות על פלטה חשמלית.
- העברת שקופיות לחדר לח ודגירת שקופיות ב 37 מעלות CO / אור הימנעות N. הסר התלושים לכסות על ידי שטיפת השקופיות בצנצנת Coplin עם 2x SSC. מגלשות מקום בצנצנת Coplin המכילה 55-60 מעלות צלזיוס 2x SSC ודגירה של 20 דקות.
- מניחים את השקופיות ל2x SSC בצנצנת Coplin למשך 2 דקות על RT. מייבשים שקופיות בצנצנת Coplin למשך 2 דקות בסדרה של 70%, 90% ו 100% אתנול, בהתאמה.
- אוויר יבש השקופיות וcounterstain עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) בantifade הרכבה בינוני, להימנע מאור חזק.
3. מיקרוסקופי ניתוח ואחסון
- לנתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. הבחירה של מסנן תלוי בfluorochrome משמש לתיוג בדיקה. במידת צורך, שקופיות חנות ב 4 ° C בתנאים חשוכים עד שנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שקופיות מיקרוסקופיות עם ממרחי metaphase mitotic הוכנו על ידי השיטה מהירה האוויר יבש כרומוזום שחרור ההכנה שתוארה לעיל (Suppl. איור 1). ניתוח FISH בוצע באמצעות שני, רצפים חוזרים ועותק יחיד. תמונות התקבלו על ידי מיקרוסקופ epifluorescence עם סט של מסננים מאפשרים עירור של fluorophores המתאים ונתפסו על ידי מצלמה בצבע CCD רגישות גבוהה. לרכישת התמונה השתמשנו במחשב עם תוכנת רכישת תמונה. תוצאות של ניסויי הדגים על הכרומוזומים metaphase mitotic באמצעות 5S rDNA, [CTT] 10, ועותק יחיד בדיקות היו שונות ושל באיכות גבוהה עבור vulgare Hordeum (Figre 2A, B), ח 'bulbosum (איור 2 ג), ח' marinum, murinum ח ', ח' וpubiflorum cereale Secale (איור 2 ד). יתרונות ברורים של גישה זו הם גם התפשטות, נפגשו ניזוק ורב כרומוזומים aphase משרתים כתנאי מושלמים לניתוח FISH מוצלח. ניתן לאחסן את ההשעיה התא ב -20 ° C עד חודשים ולהכין את כרומוזום מתפשט ביום של ניסוי הדגים. טרי שקופיות מוכנות ניתן גם לאחסן ב -20 ° C ב 96% אתנול, למרות שציינו כי האיכות של אותות הכלאה על כרומוזומים כזה מצטמצמת לעומת מתפשט metaphase הטרי. השיטות יכולות לשמש להכנת ממרחי כרומוזום באיכות גבוהה בדגנים בצורה קלה, יעילה ושחזור וסביר להניח שניתן להשתמש בם במינים צמחים אחרים.
איור 1. תכנית המתארת את ההליך של שיטת הכנת כרומוזום צמח שחרור האוויר יבש.
es / ftp_upload / 53,470 / 53470fig2.jpg "/>
איור 2. דגים על מרווחי כרומוזום metaphase mitotic של vulgare Hordeum, ח ' cereale bulbosum וSecale שהוכן על ידי שיטת שחרור האוויר יבש. () ח vulgare עם העתק בדיקה אחת (FPct_40752) שכותרתו עם צבע ניאון אדום. (ב) ח vulgare עם הבדיקה 5S rDNA מסומנת על ידי צבע ניאון ירוק. (ג) bulbosum ח עם CTT-microsatellite מסומן על ידי צבע ניאון ירוק ו( D) cereale ס עם חוזר pSc119.2 מסומן על ידי צבע ניאון ירוק. כל הכרומוזומים היו counterstained עם DAPI (באדום). אותות FISH מוצגים בצהוב. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.
לוח זמנים 1. דגירה של טיפול אנזים למינים שונים.
Suppl. איור 1. שלב בניגוד והתערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות של ממרחי כרומוזום metaphase mitotic של שיטת הכנת כרומוזום צמח שחרור האוויר יבש על הדוגמא של vulgare Hordeum. () תמונת שלב בניגוד צולם בהגדלה 200X ו- (ב) תמונת ניגוד דיפרנציאלי התערבות נלקחה בהגדלה 630X. אנא לחץכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסוי הכנת כרומוזום בוצע באמצעות שורשים צעירים של דגנים השייכת למשפחת הדשא (Poaceae). כל המינים ניתחו 14 כרומוזומים mitotic הארוך יחסית metaphase (11-15 מיקרומטר) בסט הגנום דיפלואידי ושייכים למינים גדול הגנום (5.1-7.9 GBP).
אורך של שורשים מונבטים לא היה יותר מ 2 סנטימטר כדי להשיג מקסימום של רקמת meristematic. סנכרון של תאי החלוקה הושג על ידי טיפול קרח מים באורך של 20 שעות ששפרו את כמות metaphase mitotic מתפשטת 10.
שני צעדים חשובים להכנת תכשירי כרומוזום באיכות גבוהה: (I) לחות היחסית של 50% -55% ומשך (II) של טיפול האנזים. הנקודה הראשונה הושגה על ידי הצבת רקמות נייר רטובות על צלחת חמה בקרבה של שקופיות הזכוכית. לחות היחסית נמדדה עם מד לחות. לחות האופטימלית להכנת מפעלהכרומוזומים היו דומים ללחות שדווחה על ידי et al קירוב. 6. ההשפעה החיובית על איכות כרומוזום בלחות היחסית אופטימלית מתרחשת על ידי נפיחות של הידרוליזה ציטופלסמה וקיר תא.
משך טיפול אנזים הוא מין תלוי (טבלה 1). תקופת טיפול אנזים תלויה גם באורך של קיבעון שורש באתנול / חומצה אצטית והגודל של שורשי הזמן. השורשים כבר אוחסנו במקבעים (עד 1 שנה על 4 מעלות צלזיוס), ככל שנדרש כדי לעכל שורשים לכיתה הנכונה. חומר שורש מתעכל מספיק קשה רוך ויגדיל את הזמן הכולל של הכנה כתוצאה משרייה ארוכת טווח. יתר על כן, כרומוזומים metaphase יישארו מוטבעים לתוך הציטופלסמה שיכול לעכב שלאחר מכן חדירת בדיקה במהלך ניסוי הדגים. מצד השני חומר מתעכל על יכול להשפיע על המבנה של הכרומוזומים עצמם, ויעד נזק DNלניתוח FISH.
גורם נוסף לשיפור ההכנה הוא השימוש בירידה השנייה של מקבע (3: 1, חומצה אצטית / אתנול). ריכוז גבוה של חומצה אצטית בתערובת זו מגרה את מערכת העיכול של ציטופלסמה ומקדם כרומוזום מתפשט במין עם כרומוזומים גדולים. הפחתת ציטופלסמה יכולה להתבצע גם לאחר קיבוע של כרומוזומים בשקופיות. למטרה זו יכולה להיות מודגרות שקופיות מיקרוסקופ נושאות את מרווחי כרומוזום 45% בחומצה אצטית ב RT עבור 2-10 דקות בהתאם לרמת ציטופלסמה. בדיקת איכות של ממרחי כרומוזום בוצעה עם מיקרוסקופ שלב בניגוד ללא כל כתמים משלימים (למשל, 1% Aceto-כרמין). בדרך כלל ניתן להשיג יותר מ -25 שקופיות המכילות ממרחי כרומוזום באיכות גבוהה מ -20 שורשים באמצעות השיטה הנ"ל.
תוצאות של ניסויי הדגים על הכרומוזומים metaphase mitotic באמצעות 5S rDNA, [CTT] 10, ו -6 kב עותק יחיד בדיקה ארוכה (FPct_40752) היתה ברורה ושל איכות גבוהה לכל המינים שתוארו לעיל (איור 2). יתרונות ברורים של גישה זו הם גם התפשטות, כרומוזומים metaphase ניזוק ורבים המשרתים כתנאי מושלמים לניתוח FISH מוצלח. ניתן לאחסן את ההשעיה התא ב -20 ° C עד חודשים ולהכין את כרומוזום מתפשט ביום של ניסוי הדגים. טרי שקופיות מוכנות ניתן גם לאחסן ב -20 ° C ב 96% אתנול, למרות שציינו כי האיכות של אותות הכלאה על כרומוזומים כזה מצטמצמת לעומת מתפשט metaphase הטרי.
ממרחי כרומוזום שהוכנו על ידי טכניקת שחרור האוויר יבש המהיר היו מתאימים לדגים והיו לשכפל מספר פעמים. שילוב של שיטת הכנת כרומוזום זה עם דגים יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור את ארגון הגנום בצמחים, למשל, לkaryotyping 11, כרומוסמיפוי omal 12, במחקרים סינטטיים, ולשילוב של מפות פיזיות וגנטיות 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M.
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
