Introduction
방법 설명 목적은 부신 활성의 비 침습적 평가를 제공하기 위해서 말 대변 코르티 코스 농도를 분석한다. 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축 활동을 측정하는 것은 포로 및 국내 종 모두에서 잠재적으로 혐오 상황에 대한 반응을 연구하는 허용 방법입니다. 참조 기술과 가장 널리 사용되는 방법은 그러나, 배설물 분석과 같은 다른 방법이없는 범위 종을 감시하는 기능을 채혈 자체에 의해 유도 된 응력을 극복 할 수 있도록하기 위해 개발 된 혈장 (1)의 사용이다.
혐오 상황시, 생리적 항상성이 파괴된다. 앞쪽에 뇌하수체에 작용하여 부 신피질 자극 호르몬 (ACTH)의 방출을 자극 방출 호르몬 (CRH)를 corticotrophin 뇌 릴리스의 시상 하부. ACTH는 혈류를 입력하고 종을 분비하는 부신 피질을 자극s의 특정 글루코 코르티코이드 (GC). 글루코 코르티코이드는 밀접하지 않고 지속적으로 그러므로 그들은 종종 다른 스트레스 링크 호르몬이 이상 환경에서 측정 된 모든 에너지를 높게 한 상태에서 생산되고보다 스트레스가 이벤트에 연결되어 있습니다. 글루코 코르티코이드는 말을 여러 적응 효과에 대한 책임이 있습니다. 에너지가 급속 지방산 및 글루코스의 형태로 본문에 저장 사이트로부터 동원되는 산소 섭취량은 감각 기능 3을 향상 혈류가 이동 4 불필요 영역 감소, 증가된다. 뿐만 아니라 대응 메커니즘으로 작용하는 글루코 코르티코이드에 의한 응력 상승은 다음 스트레스 5 동물을 제조하는 데 도움이된다.
호르몬 혈장 수준과 침을 평가하는 것은 배설물 대책 호르몬의 대사 최종 제품 대사를 측정하지만 실제 순환 호르몬을 측정하는 것을 포함한다. 순환 스테로이드는 리터에 이화된다그들은 장 트랙 6에서 세균성 식물의 효소 활성에 의해 촉진 추가 변경을 거쳐 담즙에 배설하기 전에 이베. 따라서, 혈중 글루코 코르티코이드 지향 면역은 배설물 글루코 코르티코이드의 대사 산물 (7)의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다.
찌끼 모음 말 아무런 방해하여 수행 될 수있는 바와 같이, 코르티 대한 대변의 분석은 다수의 환경에서 HPA 활동을 모니터링하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 말의 배설물에 상승 코르티 코스 테론은 수술 후 의학적 치료 8시 제한적 하우징 (9)을 포함하여 잠재적 인 혐오 상황에 대한 응답으로보고되었다. 대변 샘플링은 시간이 지남에 풀링 된 글루코 코르티코이드 수준보다는 장기, 만성 또는 계절 패턴 (10)을 모니터링하기위한 적절하고 혈장과 타액에서 제공하는 시간 샘플링에있는 점을 반영한다. 때문에 비 침습적으로방법의 본질은, 샘플 캡처하거나 구속 11 없이도 개인 반복적으로 수집 될 수있다. 샘플링 프로토콜을 계획 할 때, 종 특정 장내 통과 시간이 고려되어야한다. 말에서 소화관 통과 시간 따라서, 부신 반응과 후속 코르티 대사는 HPA 축의 활성화 후 초기 언젠가 대변 검출 할 수 약 18 내지 12 시간이다.
비 침습적 면역 기술을 활용하면 조사중인 종에 대한주의 깊은 검증이 13 필수적이다. 또한, 호르몬 대사 산물의 배설에 성별 차이로 인해 신진 대사 속도와 마우스 (14), 닭 (15) 등 다양한 종으로 배설 코르티 코스 테론의 대사 산물의 종류의 차이에 아마보고되었다. 일에 자세히 설명되어 있습니다로는 분석이 남성과 여성의 국내 말 모두에 사용하기 위해 검증 된이 방법의 일환으로, 따라서 중요전자 프로토콜입니다. 남녀 간의 호르몬 대사의 차이는 해결하지 않고 분석 검증의 일부로 포함 거의되어 아직 데이터 품질에 대한 처벌을 받게됩니다.
이 비 침습적 방법은 국내 말에 부신 활동의 장기 평가를 할 수 있습니다. 프로토콜 세부 분석의 검증 및 분석 기술 자체를 모두.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
윤리 문 : 현장 샘플링과 동물 과목을 포함하는 절차는 노팅엄 트렌트 대학의 동물, 농촌 및 환경 과학 (ARES)의 학교에 의해 승인되었습니다.
대변 샘플 1. 컬렉션
참고 : 분변 샘플 및 메탄올을 취급 할 때는 장갑을 착용한다. 동물은 또한 착용해야 실험실 코트와 같은 인수 공통 질병, 보호 복을 앓고 될 수 있다는 강한 의심이있는 경우.
- 배변 다음 (몇 시간에 분 이내) 가능한 한 빨리 배설물 샘플을 수집하고 샘플 가방에 배치합니다. 약 10 g의 총 중량과 어떤 똥 샘플의 3 ~ 5 부 표본을 가져 가라. 시간과 수집, 개별 ID의 날짜와 가방 레이블 및 분석 때까지 -20 ° C에서 샘플을 동결.
- 모든 샘플을 동결 오차를 최소화 -20 ° C까지의 연구이다 완료 후 일괄 적으로 분석을 위해 함께 샘플을 수집합니다. </ 리>
2. 대변 호르몬 추출
- 실온에서 해동하는 배설물 샘플을 남겨주세요.
- 샘플을 수동으로 자신의 샘플 가방에 각각의 샘플을 혼합하여 균질화되어 있는지 확인합니다.
- 각 샘플은 무게 보트에서 마이크로 저울에 0.50 분변 물질 (g 0.003 ±)을 무게를 들어 다음 8 ㎖의 유리 병에 대변을 전송합니다. 각 샘플에 대한 새로운 무게 보트를 사용하여 각 샘플 사이에 30 % 메탄올로 핀셋을 청소하십시오.
- 5 90 % 메탄올 용액으로 분뇨 0.5 g의 결합 물, 및 RT에서 오비탈 진탕 기에서 O / N을 흔들어.
- 다음 날 아침, 샘플 와동 후 600g에서 20 분 동안 원심 분리.
- 37 ℃의 온도로 설정된 수욕 랙에 16 × 125mm이 유리관 제자리 메탄올 분획을 경사 분리한다. 흄 찬 공기를 사용하여 건조시켜 증발. 추출 병을 씻어 폐기에 대한 임상 폐기물 가방에 남아있는 대변 펠렛을 배치합니다.
- 100 %에서 1 ml의 메탄올을 대변 추출물을 다시 중단하고 12 X 75mm 2 폴리 프로필렌 튜브에 전송할 수 있습니다. 즉시 분석 할 때까지 -20 ° C에서 모자 및 저장.
3. 호르몬 분석
- 클론 코르티 코스 테론의 CJM006 항혈청을 사용하여 효소 연결된 면역 측정법 (EIA)와 분석을 수행합니다.
참고 :. 두 번째 EIA는 (코르티솔 R4866 항혈청을 테스트했지만,이 (4.1 절 참조) 폴리 클로 날 코르티 코스 테론 CJM006 항혈청과 코르티솔 R4866 항혈청과 각각의 HRP의이 CJ 먼로, 캘리포니아 대학에서 제공하는 생화학 적 검증 단계를 달성하는 데 실패, 데이비스, 캘리포니아 - 1의 항혈청 희석 : 코팅 버퍼 (0.05 M을 NaHCO3, pH를 9.6)에서 15,000 반복적 인 피펫과 50 μL 피펫 팁을 사용하여 / 잘 50 μL와 96 웰 마이크로 타이 플레이트를로드합니다. 접시 실러와 함께 접시를 덮고 4 ° C에서 O / N을 품어. (N을 비 - 특이 적 결합을 나타내는 웰을 코팅되지 않은 두 개의 웰을 남겨SB).
- 사용 직전 자동화 된 마이크로 타이 터 플레이트 세척기 (0.15 M의 NaCl, 0.05 % 트윈 20 세정액)를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 다섯 번 세척 하였다.
- 1,000 페이지 / - NSB의 잘 당 50 μL와 '제로'우물 [EIA 버퍼 (0.1 M 나포 4, 0.149 M의 NaCl, 0.1 % 소 혈청 알부민, pH를 7.0) 만, 표준 (코르티 코스 테론, 3.9으로 판을로드 잘) 또는 적절하게 1시 20분 EIA 버퍼에 희석 배설물 추출물 샘플 (,) 섹션 4.1을 참조하십시오. 표준과 0은 각각 세중 및 4 번씩 실행해야합니다. 희석 배설물 추출물 샘플과 NSB의 중복에서 실행해야합니다.
- 70,000 : 50 ㎕를 첨가 / 웰의 1 EIA 버퍼에 희석 라벨 고추 냉이 퍼 옥시 다제 공액 ᵻ 즉시이 작업을 수행합니다.
- 실온에서 2 시간 동안 어둠 속에서 마이크로 타이 플레이트를 품어.
- 100 μL와 함께 어둠 속에서 실온에서 접시를 세척 용액으로 5 회 마이크로 타이 플레이트를 세척하고 품어 / 아RT 기판 [0.4mm의 2,2'- 아지노 디 - (3-ethylbenzthiazoline 술폰산) 디 암모늄 염, 1.6 mM의 H 2 O 2, 0.05 M 시트 레이트, pH가 4.0]의 L. 사용하기 직전에 기판을 준비합니다.
- 미크로 역가 플레이트를 읽는 405 nm의 파장에서 spectrophometer를 사용한다. 제로 웰의 광학 밀도가 0.8 이상 1.0에 도달 할 때 배양 플레이트는 완료된 것으로 간주된다.
- 반복성을 보장하기 위해, 약 30 % (EIA 표준), 50 % (생물학적 샘플 예를 들어, 국내 말 배설물 추출물의 수영장) 70 % (EIA 표준)를 결합하는 EIA 버퍼에 희석 제어 [EIA 표준 또는 생물학적 샘플을 사용 ]는 각각 <10 %의 변화와 <15 %의 인트라 간 분석 계수를 설명합니다.
4. 효소 연결된 면역 : 연구 종과 섹스에 대한 검증
- 생물 유효성 검사 (병렬)
- EIA 버퍼를 사용하여 풀 배설물 여분의 직렬 희석을 수행코네티컷, 이상적으로 여러 사람들로부터 의심 높고 낮은 호르몬 농도 샘플에서 가져온 (범위 : 깔끔한, 1 : 8192 : 2 1)과 3 장에 설명 된대로 EIA에서 실행됩니다.
주 : 분변 추출물의 계열 희석 표준 곡선의 선형 회귀 결과 변위 곡선 평행 수득 때 병렬성이 달성 된 것으로 간주된다 R2> 0.90, 기울기> 0.50 및 p <0.05를 보여준다. 표준 곡선에 약 50 %를 결합하는 일련 묽은 배설물 추출물은 모든 배설물 추출물을 실행하는 데 이상적인 희석을 고려하여야한다 (예를 들면 1:20). 선형 회귀 결과 R2> 0.90 및 p <0.05을 설명 할 때 분석에서 고려 간섭이 없다.
- EIA 버퍼를 사용하여 풀 배설물 여분의 직렬 희석을 수행코네티컷, 이상적으로 여러 사람들로부터 의심 높고 낮은 호르몬 농도 샘플에서 가져온 (범위 : 깔끔한, 1 : 8192 : 2 1)과 3 장에 설명 된대로 EIA에서 실행됩니다.
- 생물 유효성 검사 (간섭)
- 50 %로 희석 적절하게 풀 희석 된 배설물 추출물 [200 μL가 paralleli에 의해 결정 바인딩과 (3.9 1000 NG / 잘 코르티 코스 테론 제로) 직렬 희석 기준의 200 μl를 스파이크SM (1:20)] 및 EIA 분석 플롯 다음 섹션 3과 EIA에서 실행 관측 된 농도 - 예상 농도 대 배경 (제로 샘플의 농도).
주 : 표준 희석 풀링 분변 추출물의 첨가가 유의 양 예상 선형 회귀 결과를 변경하지 않으면 R이> 0.90, 1.0 및 p <0.05에 가까운 기울기를 산출한다. 환경 영향 평가와 간섭을 달성 없습니다.
- 50 %로 희석 적절하게 풀 희석 된 배설물 추출물 [200 μL가 paralleli에 의해 결정 바인딩과 (3.9 1000 NG / 잘 코르티 코스 테론 제로) 직렬 희석 기준의 200 μl를 스파이크SM (1:20)] 및 EIA 분석 플롯 다음 섹션 3과 EIA에서 실행 관측 된 농도 - 예상 농도 대 배경 (제로 샘플의 농도).
- 생물 유효성 검사 :
참고 : 선택한 EIA 관심 호르몬의 생물학적으로 중요한 변화를 측정 할 수있는 능력이있는 데모 [예는, 약리학 다음 글루코 코르티코이드 농도의 상승 또는 생물학적 도전 (ACTH가 종종 허가 절차) (예를 들어, 심리적 및 / 또는 환경, 기회주의 관계가없는 이벤트가 될 가능성이 더 높습니다)].- 선택 추출물과 글루코 코르티코이드 대사 산물 농도에 대한 분변 샘플을 분석이전과 도전 이벤트 - 3 절에서 1 설명 된 프로세스를 사용하여.
주 : 도전 이벤트가 특정 종 수 있습니다. 예시적인 방법은 국내 말은 아래 제공된다. 말에 대한 도전 이벤트의 전체 예는 관리 9 축산 절차 (16)의 사용을 포함하여 이전에 발표되었다. 도전 이벤트 다음 글루코 코르티코이드의 대사 산물 농도의 유의 한 증가가 관찰 및 통계 분석을 사용하여 확인해야합니다. 이것은 반복 측정 샘플 날짜 및 개인의 영향을 적절 포함한다. 생물학적 검증은 달성 된 것으로 간주된다.
- 선택 추출물과 글루코 코르티코이드 대사 산물 농도에 대한 분변 샘플을 분석이전과 도전 이벤트 - 3 절에서 1 설명 된 프로세스를 사용하여.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
국내 말 (N = 16, 8 암말, 8 geldings) 십오년 (± 3)의 평균 연령은 성별과 사회적 고립 (N = 4 말 / 치료)의 증가 수준 4 개의 주택 디자인 대상에 따라 분류 하였다. 밀접하게 그들의 자연 서식지를 시뮬레이션, 무리 환경에서 생활 주택 1 관련된 말. 실내 헛간에 쌍에 살고있는 주택이 포함 된 말. 하우징 (3) 참여 말은 마구간에 있지만, 다른 말과 말의 하우징 (4) 관련 총 격리 시각적 접촉 홀로 보관.
각 치료에 노출 다섯 일간 무작위 블록 설계했다. 다음은이 말 다음 주택 처리에 노출하기 전에 이틀 동안 자신의 실험 그룹에 잔디 잔디밭으로 판명되었다. 분변 시료 일 1, 2 일마다 한번 수집하고, N = 3은 8 마리의 각 수용 처리 (내 보냈다각각의 치료에서 N = 2 말). 분변 시료 가능한 배변 후 1 시간 이내에 즉시 수집 하였다. 말은 주택 치료에 도입 된 후 첫날의 첫 번째 샘플은 적어도 20 시간을 수집 한 모든 샘플은 마구간 의미의 첫 번째 하루에 1,200 시간 후 수집 하였다. 하루 하나, 둘, 셋 (하우징 디자인 당 24 샘플의 총)에서 샘플 인해 소화물 (12)의 통과 속도에 지난 18 시간의 반사 배설물 코르티 코스 테론 수준에 대한 평가 하였다. 동일인 마리는 연구 전반 분변 분석에 사용 하였다. 추가로 측정 된 매개 변수 국내 말에 대한 도전 이벤트의 게시 된 작업 (9) 다른 예를 참조하십시오 등이 생물학적 문제의 자세한 내용에 대해서는 또한 문헌 16에서 찾을 수 있습니다.
이 섹션은 모두 고전에 대한 생화학 적 검증 (병렬)의 예 결과를 제공남성과 여성의 국내 말 배설물에 ticosterone과 코티솔. 이 섹션에서는 배설물 추출 및 EIA 분석에서 얻은 대표적인 데이터를 제공합니다. 결과 말 동작 생리학 9시 하우징 디자인으로 인한 사회 분리의 영향을 조사 큰 연구의 일부로서 얻었다.
생화학 검증의 결과는 코르티 코스 테론의 EIA는 R2 = 0.9545, F [도 1a 남성 샘플 %가 = 바인딩 25.349은 + 0.729 (표준 % 바인딩) 아드레날린 활성을 측정하기 위해 적절한한다고 밝혀졌다 (1, 7)보다 = 146.710, P 이하 0.001)도 1B 여성 샘플 % 바인딩 = 29.989가 + 0.7198 (표준 %가,) R2 = 0.95594, F (1 바인딩, 7) = 151.865, 0.001 이하]가 아닌 코티솔 EIA [그림 1C 남성 샘플 % 바인딩 P = 79.089 + 0.0629 R2 = 0.175, F, (표준 % 바인딩) (1, 7) = 1.485, p = 0.262),도 1d 여성 샘플% 바인딩 = 81.652 + 0.0772 (표준 % 바인딩), R2 = 0.257, F (1, 7) = 2.422, P = 0.164]. 코르티 코스 테론의 EIA는 코르티 코스 테론의 코티솔 EIA 및 간섭 시험과는 달리 병렬 처리를 보여으로 EIA는 예상 금액을 변경하지 않았다 코르티 코스 테론 표준에 묽은 대변 추출물의 첨가로 매트릭스 간섭의 증거를 보이지 않았다 (남성 : 관찰 = + 1.017 1.302 (예상) , R2 = 0.9972, F1, 7 = 1287.128, p <0.001, 여성 : 관찰 = (예상) 0.3169 + 1.0931, R2 = 0.9972, F1, 7 = 2432.65, p <0.001).
환경 영향 평가의 결과는 남성 말 (M = 37.7, SD = 14.1)과 여성의 말과 코르티 코스 테론 수준에서 유의 한 차이가 없었다 것으로 나타났다 (M = 33.8, SD = 12.7, t (70) = 1.23, P = 0.22) . 격리의 정도가 증가함에 분변 코르티 코스 테론의 수준은 증가 하였다. 격리 된 말 (주택 디자인 4)은 상당히 높은했다어 배설물 코르티 코스 테론의 수준은 다른 모든 주택 설계 (; P ≤0.02 윌크스 람다 = 0.58, F (3, 18) = 4.29, P = 0.01, 다변량 부분 ETA는 제곱 = 0.42)에 비해. 다른 하우징 치료에 비해 배설물 코르티 코스 테론의 수준은 가장 절연 하우징 중 세 샘플 일 모든 말 높았다. 매일 각각의 하우징 디자인에 대한 평균 배설물 코르티 코스 테론의 농도는 표 1에 제시되어있다.
남성과 여성의 말에 대한 코르티 코스 테론 (corticosterone)과 코르티솔 효소 연결된 면역 그림 1. 생물 유효성 검사 (병렬)가.이 그림에 코르티 코스 테론과 코르티솔 표준 곡선 농도 증가에 대한 남성과 여성의 국내 말 배설물 추출물의 시리얼 희석 풀의 결합 비율의 자세한 사항 EIA. 결과는 입증코르티 코스 테론 (A, 남성, B, 여성)가 아닌 코티솔 EIA (C, 남성, D, 여성). 코르티 코스 테론의 EIA 표준 곡선 성공적으로 변위 곡선과 평행을 산출 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 각 주택의 치료에 MEAN (± SD) 변실금 코르티 코스 테론 (NG / g) | ||||
| 주택의 치료 | 1 일 | 2 일 | 3 일 | 사무용 겉옷 |
| 1 | 31.73 ± 10.2 | 32.18 ± 8.0 | 29.22 ± 5.9 | 31.05 ± 7.8 |
| 이 | 32.75 ± 10.0 | 33.66 ± 12.9 | 34.67 ± 9.3 | 33.69 ± 10.3 |
| 삼 | 35.06 ± 14.6 | 35.14 ± 15.9 | 33.13 ± 12.5 | 34.44 ± 13.6 |
| </ TD> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42.00 ± 16.7 | 41.52 ± 17.6 | 40.56 ± 16.5 |
표 1. 평균 각 주택 치료의 모든 세 가지 일을 위해 일 하나, 둘, 셋, 평균 대변 코르티 코스 테론 (corticosterone) (NG / g)에 대한 각각의 주택 치료 (전체).이 테이블 쇼 대변 코르티 코스 테론 (corticosterone) (NG / g) (SD ±) 분변 코르티 코스 테론 (NG / g)에 대한 평균 값은 일 1, 2, 세 동안 하우징 치료제 각각에 대한 표준 편차를 ±. 말 하우징 들어간 후 샘플을 적어도 20 시간을 수집 하였다. 또한 평균 배설물 코르티 코스 테론 (NG / g)을 각 주택 치료의 모든 삼일 (전체)에 대한 표준 편차를 ± 보여줍니다. 대변 코르티 코스 테론의 정광이온이 분리 된 주택 디자인 중 (*) 유의하게 높았다. 모든 일 동안 배설물 코르티 코스 테론의 낮은 농도는 그룹 수납 처리 (처리 1)에서 발견되었다. Yarnell 등에서 적응. (2015), 생리학과 행동 저널의 허가.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
분변 코르티 분석 말 부신 활성의 장기 패턴을 평가하는 수단을 제공한다. 상기 방법의 비 침습적 자연 타액 플라즈마 분석 9 포함한 부신 활성을 평가하기 위해 사용되는 다른 샘플링 방법의 교란 효과를 극복한다. 또한이 기술은 무료에 이르기까지 말을 공부하는 경우 명확한 비 침습적 인 장점이 있습니다.
이 방법의 적절한 사용에 관한 논의하기 위해 몇 가지 주요 포인트가 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 질문에 적절한 항체 선택의 종에 대한 분석의 검증이다. 사용 된 항체는 구조적으로 유사하지만 기능적으로 다른 글루코 코르티코이드의 대사 물질과 교차 반응하는 경우,이 결과 17 혼동 할 수있다. 따라서, 분석 호르몬 대사가 조심 생리 학적 또는 생물학적 검증을 필요로 측정하기 위해, 세부 사항은 문헌 18, 19 및 프로토콜 DESCR 내에 존재ibed.
분변 시료의 조건은 모두 대사 호르몬 수준 (20)에 영향을 도시 한 시료, 환경 노출 신선도 포함한 것으로 간주되어야한다. 과도한 비 또는 햇빛 노출로 인해 세균의 대사 (21)에 증가를 유발하는 것으로 알려진 또는 대사 산물 농도가 감소된다. 신선도의 다양한 정도의 샘플을 수집하고자하는 연구자들은 환경에 미치는 영향뿐만 아니라 샘플의 무결성에 시간의 영향을 조사해야합니다. 이는 기후 변수 신선도 노출 다양한 각도 작은 실험 설정 주기적 암수 개체로부터 배설물을 샘플링함으로써 이전 연구에 수행 될 수있다.
대부분의 연구 시나리오에서 알려진 개인의 샘플은 도움이 10 필요합니다. 국내 말에서이 ID에 섭취 식품 마커 defaecation위한 그룹을 모니터링하거나 사용함으로써 달성 될 수있다큰 그룹 12 개인에서 대변을 entify. 무료에 이르기까지 종 이것은 개별 추적이 필요하므로 소요 시간을 증명할 수 있습니다.
글루코 코르티코이드 분석의 방법을 선택할 때, 대변 코르티 분석의 결과는 다소의 시간 측정치의 지점보다 시간 동안 풀링 된 샘플을 나타내는 것으로이를 고려되어야한다; 따라서, 데이터의 작은 변동이있을 것이다. 연구자는 상황의 장기간 효과에 관심이 있다면, 축산 기술 또는 관리 방법은 다음 배설물 분석은 적절한 방법을 제공한다. 호르몬 농도 단기 패턴 평가가 필요한 경우, 플라즈마 또는 타액 분석 바람직한 방법이 될 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
