Introduction
Fremgangsmåten som er beskrevet har som mål å analysere kortikosteron konsentrasjoner i equine avføring for å tilveiebringe en ikke-invasiv evaluering av adrenal aktivitet. Måling hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen aktivitet er en akseptert metode for å studere responsen på potensielt aversive situasjoner både i fangenskap og innenlandske arter. Referanse teknikk, og den mest brukte metode er bruk av en blodplasma har imidlertid alternative metoder som fekal analyse blitt utviklet for å overvinne den spenning som induseres av blodprøver i seg selv og tillater muligheten til å overvåke frie strekker arter.
I løpet av en motvilje situasjon, er fysiologisk homeostase forstyrret. Hypothalamus i hjernen utgivelser Corticotrophin hormon (CRH) som virker på fremre hypofysen og stimulerer frigjøring av adrenokortikotropt hormon (ACTH). ACTH kommer inn i blodet og stimulerer binyrebarken til å skille ut speciefinnes spesifikke glukokortikoider (GC). Glukokortikoider er nært knyttet til stressende hendelser snarere enn å være konsekvent produsert i alle energi økt statene derfor er de ofte målt i preferanse over andre stress knyttet hormoner 2. Glukokortikoider er ansvarlig for flere adaptive effekter i hester. Energi blir raskt mobiliseres fra lagringssteder i kroppen i form av fettsyrer og glukose, er oksygenopptak økes, sensorisk funksjon forsterkes 3 og blodstrømmen reduseres til områder som ikke er nødvendige for bevegelse fire. I tillegg til å fungere som en mestring mekanisme, kan stress-indusert økning i Glukokortikoider også hjelpe til å forberede dyret for den neste stressor 5.
Vurdering av hormonnivået i plasma og spytt omfatter måling av den faktiske sirkulerende hormon imidlertid måling av metabolitter i faeces måler den metabolske sluttproduktet av hormonet. Sirkulasjons steroider er catabolized i lIver før utskillelse i å gallen der de gjennomgår ytterligere endringer tilrettelagt av enzymatiske aktiviteter bakteriefloraen i tarm spor 6. Derfor kan immunoanalyser rettet mot blod glukokortikoider, ikke være egnet for analyse av fecal glukokortikoid metabolitter 7.
Som fecal samling kan utføres uten forstyrrelse til hesten, analyse av avføring for kortikosteron, har blitt brukt i stor utstrekning for å overvåke HPA-aktivitet i en rekke forhold. Forhøyet corticosterone i avføringen til hestene har blitt rapportert i respons til potensielt aversive situasjoner, inkludert ved postoperativ veterinærbehandling 8 og i restriktiv bolig 9. Fekal sampling reflekterer en samle glukokortikoid nivå over tid i stedet for det tidspunkt samplings som tilbys ved hjelp av plasma og spytt slik at det er passende for overvåkning av langvarig, kronisk eller sesongmønster 10. På grunn av den ikke-invasivnatur av fremgangsmåten, kan prøvene bli samlet gjentatte ganger for en person uten behov for å fange eller tilbakeholdenhet 11. Imidlertid må artsspesifikk gut transitt-tiden tas i betraktning ved planlegging av en prøvetakings protokoll. Hos hester, er gut transittiden rundt 18 timer 12 og derfor kan adrenal respons og etterfølgende kortikosteron metabolitter påvises i avføringen en dag etter første aktivering av HPA-akse.
Når utnytte ikke-invasive immunologiske teknikker en forsiktig validering for arten som undersøkes er avgjørende 13. I tillegg har kjønnsforskjeller i hormone metabolitt utskillelse blitt rapportert sannsynligvis på grunn av forskjeller i metabolic rate og type corticosterone metabolitt utskilles i ulike arter, inkludert mus 14 og kyllinger 15. Det var derfor viktig som en del av denne metoden at analysen ble validert for bruk i både mannlige og kvinnelige norske hester som er detaljert i the-protokollen. Denne forskjellen i hormon metabolisme mellom kjønnene har konsekvenser for datakvalitet, men det er sjelden adressert og inngår som en del av analysen validering.
Denne ikke-invasiv metode tillater langsiktig vurdering av adrenal aktivitet i innenlandske hester. Protokollinformasjon både validering av analysen og undersøkelsesteknikken selv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: prosedyrer som involverer feltet prøvetaking og dyr fag har blitt godkjent av School of Animal, Rural and Environmental Science (ARES) ved Nottingham Trent University.
1. Samling på fekal Samples
MERK: Hansker skal brukes ved håndtering av fekale prøver og metanol. Hvis det er en sterk mistanke om at et dyr kan lide av en zoonotisk sykdom, beskyttende klær som en labfrakk bør også brukes.
- Samle de fekale prøvene så snart som mulig (innen minutter til noen få timer) etter defekasjon og plassere dem i en prøvepose. Ta tre til fem delprøver av alle defecated prøve med en totalvekt på omtrent 10 g. Merk posen med tid og dato for innsamling, individuell ID, og fryse prøven ved -20 ° C inntil analyse.
- For å minimere feil, fryse alle prøvene ved -20 ° C før undersøkelsen er fullført deretter samle prøvene sammen for analyse som et enkelt parti. </ Li>
2. Fecal Hormone Utvinning
- La de fekale prøver å tine ved RT.
- Sikre at prøvene ble homogenisert ved manuelt å blande hver prøve i en egen pose prøven.
- For hver prøve veie 0.50 (± 0,003 g) av fecal materiale på en mikro i en veie båt deretter overføre avføringen til en 8 ml hetteglass. Bruk en ny veie båt for hver prøve og rengjør pinsett med 30% metanol mellom hver prøve.
- Kombiner 0,5 g av fekalt materiale med 5 ml 90% metanol: vann og det hele rystes O / N på en orbital rister ved RT.
- Den følgende morgen, vortex prøven og deretter sentrifuger i 20 minutter ved 600 g.
- Dekanter metanolfraksjonen inn i et 16 x 125 mm 2 glassrør og plass i et stativ i et vannbad innstilt på en temperatur på 37 ° C. Fordamp til tørrhet ved bruk av luft i et avtrekksskap. Skyll utvinning hetteglasset og legg de rester fecal pellets i en klinisk avfall bag for avhending.
- Re-suspendere fecal ekstrakter i 100%, 1 ml metanol og overføre til en 12 x 75 mm 2 polypropylen rør. Umiddelbart cap og oppbevares ved -20 ° C inntil analyse.
3. Hormone Analysis
- Utføre analysen med et enzym linket-immunoassay (EIA) ved hjelp av polyklonale corticosterone CJM006 antiserum.
MERK:. En annen EIA ble testet (Kortisol R4866 antiserum, men denne klarte ikke å oppnå den biokjemiske valideringstrinnet (se kapittel 4.1) polyklonale corticosterone CJM006 antiserum og Kortisol R4866 antiserum og de respektive HRP-er levert av CJ Munro, University of California, Davis, CA. - Fortynn antiserum ved 1: 15000 i beleggbuffer (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) ved bruk av en repeterende pipette, og en 50 ul pipettespiss, laste en 96-brønns mikrotiterplate med 50 ul / brønn. Dekk platen med en plate forsegler og inkuber O / N ved 4 ° C. La to brønner ubestrøket å representere de ikke-spesifikke bindings brønner (NSB).
- Umiddelbart før bruk vaske mikrotiterplater fem ganger ved anvendelse av en automatisert mikrotiterplate skive (vaskeoppløsning, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
- Laster platene med 50 ul per brønn for NSB og "null" brønner [EIA-buffer (0,1 M NAPO 4, 0,149 M NaCl, 0,1% bovint serumalbumin, pH 7,0) bare], standarder (kortikosteron, 3,9 - 1000 pg / godt) eller fekale avtrekksprøver (riktig utvannet 01:20 EIA buffer, se avsnitt 4.1). Standarder og nuller skal kjøres i triplikat og fire eksemplarer, respektivt. Utvannet fekal ekstrakt prøver og NSB skal kjøres i duplikat.
- Følge denne straks ved tilsetning av 50 ul / brønn av etiketten pepperrot-peroksidase-konjugat ᵻ fortynnet i EIA-buffer til 1: 70000.
- Inkuber mikrotiterplater i mørke i 2 timer ved RT.
- Vask mikrotiterplater med vaskeoppløsning 5 ganger og inkuberes platene ved romtemperatur i mørke med 100 ul / WELl RT substrat [0,4 mM 2,2'-azino-di- (3-etylbenztiazolin-sulfonsyre) diammoniumsalt, 1,6 mM H 2 O 2, 0,05 M sitrat, pH 4,0]. Klargjør underlaget umiddelbart før bruk.
- Bruke en spectrophometer ved en bølgelengde på 405 nm for å lese mikrotiterplater. Inkubasjon av platene anses som fullført når den optiske tetthet av null brønnene strekker 0,8 til 1,0.
- For å sikre repeterbarhet, bruke kontroller [EIA standarder eller en biologisk prøve fortynnet i EIA buffer til å binde på ca 30% (EIA standard), 50% (en biologisk prøve f.eks pool av innenlandske hest fecal ekstrakt) og 70% (EIA-standard) ] for å demonstrere en intra- og inter-assay variasjonskoeffisienter på <10% og <15% hhv.
4. Enzyme Linked-immunoassay: Validering for studier Arter og Sex
- Biokjemisk Validation (Parallellitet)
- Ved hjelp av EIA buffer, utføre en seriell fortynning på sammenslått fekal ekstract, ideelt sett hentet fra mistenkte høye og lave hormonkonsentrasjonsprøver fra flere personer (range: ryddig, 1: 2 til 1: 8192) og kjøre på EIA som beskrevet i kapittel 3.
MERK: En parallellitet skal anses oppnås når de serielle fortynninger av fekale ekstrakter ga en forskyvning kurve parallell til standard kurve og lineær regresjon resultater viser R2> 0,90, en skråning> 0,50 og p <0,05. Serie utvannet avføring ekstrakt som binder rundt 50% på standardkurven bør vurderes den ideelle fortynning å kjøre alle fecal ekstrakter (f.eks 1:20). Det er ingen forstyrrelser vurderes på analyse når de lineære regresjonsresultatene demonstrere R2> 0,90 og p <0,05.
- Ved hjelp av EIA buffer, utføre en seriell fortynning på sammenslått fekal ekstract, ideelt sett hentet fra mistenkte høye og lave hormonkonsentrasjonsprøver fra flere personer (range: ryddig, 1: 2 til 1: 8192) og kjøre på EIA som beskrevet i kapittel 3.
- Biokjemisk Validation (interferens)
- Spike 200 ul seriefortynnede standarder (null, 3,9 til 1000 ng / brønn kortikosteron) med 200 ul av den passende fortynnet sammenslåtte ekstrakt fekal [fortynnet i 50% binding bestemt ved parallelism (1:20)] og kjøre på EIA som i punkt 3. Etter EIA analyse tomten den observerte konsentrasjonen minus bakgrunnen (konsentrasjon av nullprøve) versus forventet konsentrasjon.
MERK: Hvis tilsetting av fortynnet samles fecal ekstrakt til standarder, ikke signifikant påvirker det beløpet som forventes og lineær regresjon resultatene gir R2> 0,90, en skråning nær 1,0 og p <0,05. Ingen interferens med EIA er oppnådd.
- Spike 200 ul seriefortynnede standarder (null, 3,9 til 1000 ng / brønn kortikosteron) med 200 ul av den passende fortynnet sammenslåtte ekstrakt fekal [fortynnet i 50% binding bestemt ved parallelism (1:20)] og kjøre på EIA som i punkt 3. Etter EIA analyse tomten den observerte konsentrasjonen minus bakgrunnen (konsentrasjon av nullprøve) versus forventet konsentrasjon.
- Biologisk Validering:
MERK: En demonstrasjon at den valgte EIA har evnen til å måle biologisk relevante endringer i hormon av interesse [f.eks (er ACTH ofte en lisensiert prosedyre) økningen i glukokortikoid Konsentrasjoner etter en farmakologisk eller biologisk utfordring (for eksempel psykisk og / eller miljøvern, mer sannsynlig å være en opportunistisk uregulert hendelse)].- Velg, trekke ut og analysere avføringsprøver for glukokortikoid metabolittkonsentrasjonerved hjelp av prosessen beskrevet i punkt 1-3 før og etter en utfordrende arrangement.
MERK: En utfordrende arrangementet vil være artsspesifikke. Et eksempel metode Nedenfor følger for det innenlandske hest. Full eksempler på utfordrende arrangementer for hester har blitt publisert tidligere, inkludert bruk av styrings 9 og dyrehold prosedyrer 16. En betydelig økning i glukokortikoid metabolittkonsentrasjoner følge utfordrende arrangement må følges og bekreftes ved hjelp av statistisk analyse. Dette må inkludere eventuelt effekten av gjentatte tiltak, eksempel dato og individuelle. Biologisk validering Deretter vurderes oppnådd.
- Velg, trekke ut og analysere avføringsprøver for glukokortikoid metabolittkonsentrasjonerved hjelp av prosessen beskrevet i punkt 1-3 før og etter en utfordrende arrangement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innenlandske hester (n = 16, 8 hopper, 8 vallaker) med en gjennomsnittsalder på 15 år (± 3) ble gruppert etter kjønn og utsatt for fire boligdesign med økende nivåer av sosial isolasjon (n = 4 hest / behandling). Boliger en involvert hester som lever i en flokk miljø, tett simulere deres naturlige habitat. Bolig to involverte hester som lever i par i en innendørs låven. Boliger 3 involverte hester plassert alene i stallen, men med visuell kontakt til andre hester og boliger fire involverte total isolasjon av hestene.
Eksponering for hver behandling var i en randomisert blokk design for en periode på fem dager. Etter dette hestene ble slått ut i gress beitet i sine eksperimentelle grupper i to dager før eksponering til neste bolig behandling. Fecale prøver ble samlet inn en gang per dag på dagene 1, 2 og 3 som er brukt innenfor hvert hus behandling fra n = 8 hester (n = 2 hester innenfor hver behandling). Fecale prøver ble samlet inn så raskt som mulig og innen en time etter defekasjon. Alle prøver ble samlet etter 1200 timer på den første hele dagen av oppstalling betyr at den første prøven på dag én ble samlet minst 20 timer etter at hesten ble introdusert til huset behandling. Prøver fra dag én, to og tre (totalt 24 prøver per bolig utforming) ble vurdert for fekal kortikosteron nivåer reflekterende av det siste 18 timer på grunn av frekvensen av passasjen av digesta 12. De samme individuelle hestene ble anvendt for fekal analyse gjennom hele studien. For fullstendig informasjon om denne biologiske utfordringer, inkludert flere målte parametere henvises til de publiserte arbeid 9 Alternative eksempler på utfordrende arrangementer for norske hester kan også bli funnet i litteraturen 16.
Denne delen inneholder eksempler på resultater av en biokjemisk validering (parallellitet) for både corticosterone og kortisol i mannlige og kvinnelige innenlandske hest avføring. Denne delen inneholder også representative data innhentet fra avføring utvinning og EIA analyse. Resultater ble oppnådd som en del av en større studie som undersøkte effekten av sosial isolasjon som følge av bolig design, på hest atferd og fysiologi 9.
Resultatene av den biokjemiske valideringen viste at kortikosteron EIA var passende for å måle adrenal aktivitet [Figur 1A mannlige prøve% binding = 25,349 + 0,729 (standard% binding), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p mindre enn 0,001), Figur 1B kvinnelige prøve% binding = 29,989 + 0,7198 (standard% binding), R2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, p mindre enn 0,001], men ikke kortisol EIA [Figur 1C mannlige prøve% binding = 79,089 + 0,0629 (standard% binding), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1,485, p = 0,262); figur 1D kvinnelige prøve% Binding = 81,652 + 0,0772 (standard% binding), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2,422, p = 0,164]. Som corticosterone EIA demonstrerte parallellitet i motsetning til kortisol EIA og forstyrrelser test på corticosterone EIA viste ingen tegn til matriksinterferens, som tilsetning av fortynnet fekal ekstrakt til kortikosteron standarder endret ikke det beløpet som forventes (hann: Observert = 1,302 + 1,017 (Forventet) R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p <0,001; kvinnelig: Observert = 0,3169 + 1,0931 (forventet), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p <0,001;).
Resultatene av EIA viste at det var ingen signifikant forskjell i kortikosteron-nivåer mellom hann hester (M = 37.7, SD = 14,1) og hunn hester (M = 33.8, SD = 12,7; t (70) = 1,23, p = 0,22) . Nivået av fecal corticosteron øket etter hvert som nivået av isolasjon økt. Isolerte hester (bolig utforming 4) hadde betydelig høyer nivåer av fekal corticosterone i forhold til alle andre boligdesign (Wilks Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, p = 0,01, squared multivariate delvis eta = 0,42; p ≤0.02). Nivået av fecal kortikosteron var høyere for alle hester på alle tre prøve dager under de isolerte huset i forhold til de andre bolig behandlinger. Konsentrasjonene av midlere fekal kortikosteron for hver utformet hus for hver dag er angitt i tabell 1.
Figur 1. Biokjemisk Validation (Parallellitet) av en Corticosterone og Kortisol Enzyme Linked-immunanalysen for mannlige og kvinnelige Horses. Dette tallet beskriver prosent binding av serie utvannet bassenger av mannlige og kvinnelige innenlandske hest fekal ekstrakter mot økende kortikosteron og kortisol standard kurve konsentrasjoner på en EIA. Resultatene viser at dencorticosterone (A, mannlig, B, kvinne) og ikke kortisol EIA (C, mann; D, hunn). ga en vellykket forskyvning kurve parallelt med corticosterone EIA standardkurven Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| MEAN (± SD) fekal corticosterone (ng / g) i hver HOUSING BEHANDLING | ||||
| HUS BEHANDLING | Dag 1 | dag 2 | dag 3 | SAMLET |
| 1 | 31,73 ± 10,2 | 32,18 ± 8,0 | 29.22 ± 5,9 | 31,05 ± 7,8 |
| 2 | 32.75 ± 10,0 | 33.66 ± 12,9 | 34,67 ± 9,3 | 33,69 ± 10,3 |
| 3 | 35,06 ± 14,6 | 35,14 ± 15,9 | 33.13 ± 12,5 | 34,44 ± 13,6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17,8 | 42,00 ± 16,7 | 41.52 ± 17,6 | 40.56 ± 16,5 |
Tabell 1. Gjennomsnittlig (± SD) Fecal Corticosterone (ng / g) for hver bolig Behandling for Days ett, to og tre og Mean Fecal Corticosterone (ng / g) for alle tre dager (Overall) i hver Housing Treatment. Denne tabellen viser gjennomsnittsverdiene for fekal kortikosteron (ng / g) ± standardavvik for hver av bolig- behandlingene i løpet av en dag, to og tre. Prøver ble samlet i minst 20 timer etter hester angitt i huset. Det viser også bety fekal kortikosteron (ng / g) ± standardavvik for alle tre dager (totalt utbytte) i hvert hus behandling. Fekal corticosterone Konsentraterion var signifikant høyere (*) i løpet av det isolerte huset design. Den laveste konsentrasjon av fekal kortikosteron for alle dager ble funnet i den gruppe som ligger behandling (behandling 1). Tilpasset fra Yarnell et al. (2015), med tillatelse fra Journal of Physiology og Behaviour.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fecal corticosterone analysen gir et middel for å vurdere langsiktige mønstre av adrenal aktivitet i hester. Den ikke-invasiv metode overvinner konfunderende effekter av andre prøvetakingsmetoder som brukes for å vurdere adrenal aktivitet, inkludert spytt og plasma analyse ni. I tillegg teknikken har en klar ikke-invasiv fordel om å studere gratis spenner hester.
Det er flere viktige punkter å diskutere om denne metoden og dens passende bruk. Et kritisk punkt i protokollen er validering av analysen for de aktuelle artene og hensiktsmessig antistoff valg. Dersom antistoff brukt kryssreagerer med metabolitter av liknende struktur, men funksjonelt forskjellige glukokortikoider dette kan forvirre resultater 17. Derfor analyser for å måle hormon metabolitter kreve en forsiktig fysiologisk eller biologisk validering, detaljer som finnes i litteraturen, 18,19 og innenfor protokollen descrIbed.
Tilstanden til avføringsprøve må vurderes inkludert friskhet av prøven og miljømessig eksponering som har begge vist seg å påvirke hormon metabolitter 20. Overdreven regn eller sol eksponering er kjent for å forårsake økning eller reduksjon i metabolittkonsentrasjoner grunn av bakteriell metabolization 21. Forskere som ønsker å samle inn prøver av varierende grad av friskhet må undersøke effekten av tid på prøven integritet, i tillegg til miljøpåvirkning. Dette kan gjøres i forkant av studien ved å sette opp et lite eksperiment og periodevis prøvetaking faeces fra mannlige og kvinnelige individer, med varierende grad av friskhet og eksponering for klimatiske variabler.
I de fleste forsknings scenarier, vil prøver fra kjente personer være nyttig eller nødvendig 10. I hjemlige hester dette kan oppnås ved å overvåke en gruppe for avføring eller ved hjelp av inntatt mat markører til identify avføring fra enkeltpersoner i større grupper 12. I gratis spenner arter kan dette vise seg å være tidkrevende som individuell sporing vil være nødvendig.
Når du velger metoden for glukokortikoid analyse må det tas i betraktning at resultatene av fekal corticosterone analysen representerer en samleprøve over tid snarere enn et tidspunkt tiltaket; Derfor vil det være mindre svingninger i dataene. Dersom forskeren er interessert i langsiktige effektene av en situasjon, oppdrett teknikk eller ledelse praksis så fekal analyse tilbyr en passende teknikk. Ved vurdering av kortvarige mønstre i hormonkonsentrasjon er nødvendig da plasma eller spytt-analyse ville være den foretrukne fremgangsmåten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
