Introduction
O método descrito pretende analisar concentrações de corticosterona em fezes equina, a fim de fornecer uma avaliação não-invasiva da actividade supra-renal. Medir a atividade do hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) é uma abordagem aceite para estudar a resposta a situações potencialmente aversivas em ambas as espécies em cativeiro e domésticos. A técnica de referência e o método mais amplamente utilizado é o uso de um plasma sanguíneo no entanto, métodos alternativos, tais como a análise fecal foram desenvolvidas de modo a ultrapassar a tensão induzida por amostragem de sangue em si e permitem que a capacidade de monitorar as espécies que vão livre.
Durante uma situação de aversivo, homeostase fisiológica é interrompido. O hipotálamo no cérebro libera hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que atua na glândula pituitária e estimula a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). ACTH entra na corrente sanguínea e estimula o córtex adrenal a secretar speciede s glicocorticóides específicos (CG). Os glicocorticóides estão intimamente ligados a eventos estressantes ao invés de ser consistentemente produzidos em todos os estados de energia elevada, portanto, eles são muitas vezes medidos em preferência sobre outros de estresse ligado hormônios 2. Os glucocorticóides são responsáveis por diversos efeitos adaptativos em cavalos. A energia é rapidamente mobilizados a partir de locais de armazenagem no corpo sob a forma de ácidos gordos e de glucose, o consumo de oxigénio é aumentada, a função sensorial é reforçada 3 e o fluxo sanguíneo é reduzido em áreas não necessárias para o movimento 4. Além de atuar como um mecanismo de enfrentamento, o aumento induzido stress na glicocorticóides também pode ajudar a preparar o animal para a próxima estressor 5.
Avaliando os níveis de hormona no plasma e na saliva envolve a medição da hormona em circulação real no entanto, a medição dos metabolitos nas fezes medidas do produto final metabólico da hormona. esteróides circulantes são catabolized na lIver antes da excreção para a bílis onde sofrem mais alterações facilitados pelas atividades enzimáticas da flora bacteriana intestinal dentro da faixa 6. Portanto, imunoensaios dirigidos a glucocorticóides no sangue pode não ser adequado para análise de metabolitos fecais 7 glucocorticóides.
Como recolha de fezes pode ser levada a cabo sem perturbar o cavalo, a análise de fezes para corticosterona, tem sido amplamente utilizado para monitorizar a actividade HPA num número de circunstâncias. Corticosterona elevada nas fezes de cavalos tem sido relatada em resposta a situações potencialmente aversivas, nomeadamente durante o tratamento veterinário pós-operatório 8 e em habitação restritiva 9. Amostragem fecal reflete um nível de glicocorticóides agrupada ao longo do tempo, em vez de o ponto de amostragem de tempo oferecido pelo plasma e saliva tornando-o adequado para o acompanhamento a longo prazo, crónica ou padrões sazonais 10. Devido à não-invasivanatureza do método, as amostras podem ser colhidas repetidamente para um indivíduo sem a necessidade de captura ou de contenção 11. No entanto, as espécies de tempo específico trânsito intestinal deve ser levado em conta no planejamento de um protocolo de amostragem. Em cavalos, tempo de trânsito intestinal é de cerca de 18 h, por conseguinte, 12, resposta adrenal e metabolitos subsequentes de corticosterona pode ser detectado nas fezes um dia após a activação inicial do eixo HPA.
Ao utilizar técnicas de imunoensaio não-invasivos uma validação cuidadosa para a espécie a ser investigada é essencial 13. Além disso, as diferenças de sexo na excreção de metabolitos da hormona foram relatados provavelmente devido a diferenças na taxa metabólica e o tipo de metabólito excretado corticosterona em várias espécies, incluindo ratos, 14 e 15 galinhas. Foi, portanto, importante como parte deste método que o ensaio foi validado para uso em cavalos domésticos masculinos e femininos, como está detalhado no the protocolo. Essa diferença no metabolismo hormonal entre os sexos tem consequências para a qualidade dos dados, no entanto, raramente é abordada e incluído como parte da validação do ensaio.
Este método não-invasivo permite a avaliação de longo prazo da atividade adrenal em cavalos domésticos. Os detalhes do protocolo tanto a validação do ensaio e da técnica de ensaio em si.
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Protocol
declaração de ética: os procedimentos que envolvem temas de amostragem de campo e animais foram aprovados pela Escola de Animal, Rural e Ciência Ambiental (ARES) na Nottingham Trent University.
1. Recolha de amostras fecais
NOTA: Devem ser usadas luvas ao manusear amostras fecais e metanol. Se existe uma forte suspeita de que um animal pode estar sofrendo de uma doença zoonótica, roupas de proteção, como também deve ser usado um jaleco.
- Recolha das amostras fecais, o mais rapidamente possível (dentro de minutos a algumas horas) após a defecação e colocá-los dentro de um saco de amostra. De três a cinco subamostras de qualquer amostra defecated com um peso total de aproximadamente 10 g. Rotular o saco com o tempo e a data da colheita, identificação individual e congelar a amostra a -20 ° C até à análise.
- Para minimizar o erro, congelar as amostras a -20 ° C até o estudo estar completa, em seguida, reunir as amostras para análise em conjunto como um único lote. </ Li>
2. Fecal Hormone Extração
- Deixar as amostras fecais para descongelar à temperatura ambiente.
- Certifique-se de que as amostras são homogeneizadas por mistura manualmente cada amostra em seu próprio saco de amostra.
- Para cada amostra, pesar 0.50 (± 0,003 g) de material fecal numa microbalança de um barco de pesagem, em seguida, transferir as fezes para um frasco de vidro de 8 mL. Use um novo pesar barco para cada amostra e limpar a pinça com 30% de metanol entre cada amostra.
- Combinar a 0,5 g de material fecal, com 5 ml de 90% de metanol: água, e agitar O / N num agitador orbital, à temperatura ambiente.
- Na manhã seguinte, vortex a amostra e, em seguida, centrifuga-se durante 20 min a 600 g.
- Decantar a fracção de metanol num tubo de vidro de 16 x 125 mm2 e colocar num suporte num banho de água regulado para uma temperatura de 37 ° C. Evaporar a seco usando ar em uma câmara de exaustão. Lavar o frasco de extração e coloque o sedimento fecal restante em um saco de resíduos clínicos para a eliminação.
- Re-suspender os extractos fecais em 100%, 1 ml de metanol e transferir para um tubo de polipropileno de 12 x 75 mm2. Imediatamente PAC e armazenar a -20 ° C até análise.
3. Análise Hormona
- Realizar a análise com uma enzima ligada-imunoensaio (EIA), utilizando soro policlonal corticosterona CJM006.
NOTA:. Um segundo EIA foi testado (Cortisol R4866 anti-soro, mas este não conseguiu alcançar a etapa de validação bioquímica (ver secção 4.1) O anti-soro policlonal corticosterona CJM006 e Cortisol R4866 anti-soro e do respectivo HRP de são fornecidos por CJ Munro, da Universidade da Califórnia, Davis, CA. - Diluir o anti-soro a 1: 15000 em tampão de revestimento (NaHCO3 0,05 M, pH 9,6) utilizando uma pipeta repetitivo e uma ponta de pipeta 50 ul, carregar uma placa de microtitulação de 96 poços com 50 ul / poço. Cobrir a placa com um vedante de placa e incubar O / N a 4 ° C. Deixar dois poços não revestidos para representar as cavidades de ligação não específica (NSB).
- Imediatamente antes da utilização lavar as placas de microtítulo cinco vezes utilizando um lavador de placas de microtitulação automático (solução de lavagem; 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20).
- Carregar as placas com 50 ul por poço, durante a NSB de e poços [tampão EIA (0,1 M NaPO4, NaCl 0,149, 0,1% de albumina de soro de bovino, pH 7,0) somente] "zero", padrões (corticosterona, 3,9 - 1.000 pg / bem) ou amostras de extracto fecal (apropriadamente diluído em 1:20 tampão EIA, ver secção 4.1). Normas e zeros deve ser executado em triplicado e quadriplicado, respectivamente. Diluídas amostras de extracto fecais e NSB de deve ser executado em duplicado.
- Siga este imediatamente com a adição de 50 ul / cavidade do rótulo ᵻ rábano conjugado com peroxidase diluído em tampão EIA para 1: 70000.
- Incubar as placas de microtitulação no escuro durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Lavam-se as placas de microtitulação com uma solução de lavagem 5 vezes e incuba-se as placas à TA no escuro com 100 ul / WELl de substrato RT [0,4 mM de 2,2'-azino-di- sal (ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico) de diamónio, 1,6 mM de H 2 O 2, citrato 0,05 M, pH 4,0]. Prepara-se o substrato imediatamente antes do uso.
- Usar um espectrofotômetro no comprimento de onda de 405 nm e ler as placas de microtítulo. A incubação das placas é considerada completa quando a densidade óptica dos poços de zero atinge 0,8 a 1,0.
- Para assegurar a reprodutibilidade, utilizar controlos [normas EIA ou uma amostra biológica diluída em tampão EIA para se ligar a cerca de 30% (padrão EIA), 50% (uma amostra biológica, por exemplo, piscina de cavalo doméstico extracto fecal) e 70% (padrão EIA) ] para demonstrar uma intra- e inter-ensaio coeficientes de variação de <10% e <15%, respectivamente.
4. Enzyme Linked-imunoensaio: Validação para as espécies Estudo e Sexo
- Biochemical Validation (Paralelismo)
- Usando tampão EIA, execute uma diluição em série em pool fecal adicionalct, de preferência proveniente de amostras suspeitas de alta e baixa concentração de hormônio de vários indivíduos (intervalo: puro, 1: 2 a 1: 8192) e executado no EIA como descrito na seção 3.
NOTA: Um paralelismo é considerada alcançada quando as diluições em série de extractos fecais produzir uma curva de deslocamento paralelo com os resultados da curva de regressão linear e padrão demonstram R2> 0,90, uma inclinação> 0,50 e p <0,05. O extracto fecal diluídos em série que liga-se a cerca de 50% na curva padrão deve ser considerada a diluição ideal para executar todos os extractos fecais (por exemplo, 1:20). Não há nenhuma interferência considerado no ensaio, quando os resultados de regressão linear demonstram R2> 0,90 e p <0,05.
- Usando tampão EIA, execute uma diluição em série em pool fecal adicionalct, de preferência proveniente de amostras suspeitas de alta e baixa concentração de hormônio de vários indivíduos (intervalo: puro, 1: 2 a 1: 8192) e executado no EIA como descrito na seção 3.
- Biochemical Validation (Interferência)
- Pico de 200 ul de padrões diluídos em série (zero, 3,9 a 1000 ng / poço de corticosterona) com 200 ul do extracto fecal apropriadamente diluído reunidas [diluído a 50% de ligação determinadas por ParalleliSM (01:20)] e executado no EIA como na secção 3. A seguir trama análise EIA a concentração observada menos o fundo (concentração da amostra zero) em função da concentração esperada.
NOTA: Se a adição de extrato fecal reunidas diluída com padrões não altera significativamente os resultados da regressão quantidade esperada e lineares produz R 2> 0,90, uma encosta perto de 1,0 e p <0,05. Nenhuma interferência com o EIA foi alcançado.
- Pico de 200 ul de padrões diluídos em série (zero, 3,9 a 1000 ng / poço de corticosterona) com 200 ul do extracto fecal apropriadamente diluído reunidas [diluído a 50% de ligação determinadas por ParalleliSM (01:20)] e executado no EIA como na secção 3. A seguir trama análise EIA a concentração observada menos o fundo (concentração da amostra zero) em função da concentração esperada.
- Validação Biológica:
NOTA: A demonstração de que o EIA escolhido tem a capacidade de medir as mudanças biologicamente relevantes da hormona de interesse [por exemplo, o aumento da concentração de glicocorticóides na sequência de um farmacológico (ACTH é muitas vezes um procedimento licenciado) ou desafio biológico (por exemplo, psicológica e / ou ambiental; mais provável que seja um acontecimento desregulada oportunista)].- Selecione, extrair e analisar amostras fecais para as concentrações de metabólitos de glicocorticóidesusando o processo descrito nas secções 1-3 antes e depois de um evento desafiador.
NOTA: Um evento desafiador será espécies específicas. Um método de exemplo é fornecido abaixo para o cavalo doméstico. Exemplos completos de eventos desafiadores para os cavalos têm sido publicados anteriormente, incluindo o uso de gestão 9 e maneio procedimentos 16. Um aumento significativo nas concentrações de metabolitos de glucocorticóides após o evento desafiador devem ser observadas e confirmadas por meio de análise estatística. Esta deve incorporar, onde apropriado, o efeito de medidas repetidas, data da amostra e individuais. validação biológico é então considerado alcançado.
- Selecione, extrair e analisar amostras fecais para as concentrações de metabólitos de glicocorticóidesusando o processo descrito nas secções 1-3 antes e depois de um evento desafiador.
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Representative Results
cavalos domésticos (n = 16, 8 éguas, 8 capões), com uma idade média de 15 anos (± 3) foram agrupados de acordo com o sexo e submetido a quatro projetos de habitação com níveis crescentes de isolamento social (n = 4 cavalo / tratamento). Habitação 1 envolveu cavalos que vivem em um ambiente de rebanho, simulando intimamente seu habitat natural. Habitação 2 envolvidos cavalos que vivem em pares em um celeiro interior. Habitação 3 cavalos envolvidos alojado sozinho em estábulos, mas com contato visual para outros cavalos e habitação 4 envolvidos isolamento total dos cavalos.
A exposição a cada tratamento foi em blocos ao acaso por um período de cinco dias. Em seguida, os cavalos foram acabou em piquetes de capim em seus grupos experimentais por dois dias antes da exposição ao tratamento seguinte habitação. Amostras de fezes foram coletadas uma vez por dia nos dias 1, 2 e 3 gasto dentro de cada tratamento habitação de n = 8 cavalos (n = 2 cavalos dentro de cada tratamento). Amostras de fezes foram coletadas mais rapidamente possível e dentro de 1 hora após a defecação. Todas as amostras foram coletadas após 1.200 horas no primeiro dia cheio de significado stabling que a primeira amostra no primeiro dia foi recolhido pelo menos 20 horas depois que o cavalo foi introduzido para o tratamento da habitação. As amostras de um dia, dois e três (total de 24 amostras por projeto de habitação) foram avaliados para níveis de corticosterona fecal reflexivas do passado 18 horas devido a taxa de passagem da digesta 12. Os mesmos cavalos individuais foram usadas para a análise fecal ao longo do estudo. Para maiores detalhes sobre este desafio biológica, incluindo os parâmetros de medição adicionais por favor consulte o trabalho de 9 exemplos alternativos publicados de eventos desafiadores para cavalos domésticos também podem ser encontradas na literatura 16.
Esta seção fornece exemplos de resultados de uma validação bioquímica (paralelismo), tanto para corticosterone e cortisol em fezes de cavalos domésticos masculinos e femininos. Esta seção também fornece dados representativos obtidos da extração fecal e análise de EIA. Os resultados foram obtidos como parte de um estudo maior que investigou o impacto do isolamento social provocado pelo projeto de habitação, sobre o comportamento dos equídeos e fisiologia 9.
Os resultados da validação bioquímica revelou que o EIA corticosterona era apropriado para medir a atividade adrenal vinculativo [Figura 1A amostra masculina% = 25,349 + 0,729 (ligação% standard), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p inferior a 0,001); Figura 1B amostra feminina% de ligação = 29,989 + 0,7198 (% padrão de ligação), R2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, p inferior a 0,001], mas a ligação não é o cortisol EIA [Figura 1C amostra masculina% = 79,089 + 0,0629 (% padrão de ligação), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1.485, p = 0,262); amostra feminina Figura 1D% De ligação = 81,652 + 0,0772 (% padrão de ligação), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2.422, p = 0,164]. Como o EIA corticosterona demonstrado o paralelismo ao contrário do EIA cortisol e teste de interferência na corticosterona EIA não revelou nenhuma evidência de interferência na matriz, como a adição de extrato fecal diluído com os padrões de corticosterona não alterou o valor esperado (masculino: Observado = 1.302 + 1.017 (esperado) , R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p <0,001; feminino: Observado = 0,3169 + 1,0931 (esperado), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p <0,001;).
Os resultados do EIA revelou que não havia nenhuma diferença significativa nos níveis de corticosterona entre cavalos machos (M = 37,7, DP = 14,1) e cavalos fêmeas (M = 33,8, DP = 12,7; t (70) = 1,23, p = 0,22) . O nível de corticosterona fecal aumentou à medida que o nível de isolamento aumentadas. Isoladas cavalos (projeto de habitação 4) tinham significativamente altaer níveis de corticosterona fecal em comparação com todos os outros projetos habitacionais (Wilks Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, p = 0,01, eta parcial multivariada quadrado = 0,42; p ≤0.02). O nível de corticosterona fecal foi maior para todos os cavalos em todos os três dias da amostra durante a habitação mais isolado quando comparado aos outros tratamentos de habitação. As concentrações de corticosterona fecal média para cada desenho do alojamento para cada dia são apresentados na Tabela 1.
Figura 1. Biochemical Validation (Paralelismo) de um corticosterona e cortisol Enzyme Linked-imunoensaio para homens e mulheres Horses. Esta figura detalha a ligação de piscinas diluídas em série de masculino e cavalo doméstico extratos fecais do sexo feminino contra o aumento das concentrações curva padrão de corticosterona e cortisol na cento uma AIA. Os resultados demonstram que ocorticosterona (A, do sexo masculino; B, do sexo feminino) e não o cortisol EIA (C, do sexo masculino; D, feminino). rendeu um sucesso curva de deslocamento paralelo com a curva de corticosterona padrão EIA Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| MÉDIA (± SD) corticosterona fecais (ng / g) em cada tratamento HABITAÇÃO | ||||
| TRATAMENTO DE HABITAÇÃO | Dia 1 | Dia 2 | dia 3 | NO GERAL |
| 1 | 31,73 ± 10,2 | 32,18 ± 8,0 | 29,22 ± 5,9 | 31,05 ± 7,8 |
| 2 | 32,75 ± 10,0 | 33,66 ± 12,9 | 34.67 ± 9.3 | 33,69 ± 10,3 |
| 3 | 35,06 ± 14,6 | 35,14 ± 15,9 | 33,13 ± 12,5 | 34,44 ± 13,6 |
| </ Td> | * | |||
| 4 | 38.16 ± 17.8 | 42,00 ± 16,7 | 41,52 ± 17,6 | 40,56 ± 16,5 |
Tabela 1. A média (± SD) Fecal corticosterona (ng / g) para cada tratamento Habitação para Days Um, Dois e Três e Meio Fecal corticosterona (ng / g) para todos os três dias (geral) em cada tratamento Habitação. Esta tabela mostra os valores médios para corticosterona fecal (ng / g) ± desvio padrão para cada um dos tratamentos de habitação durante o dia um, dois e três. As amostras foram coletadas pelo menos 20 horas após a cavalos entraram na habitação. Ele também mostra corticosterona fecal média (ng / g) ± desvio padrão para todos os três dias (geral) em cada tratamento habitação. O concentrat corticosterona fecalion foi significativamente maior (*) durante o projeto isolado habitação. A menor concentração de corticosterona fecal para todos os dias foi encontrado no grupo de tratamento alojados (tratamento 1). Adaptado de Yarnell et al. (2015), com a permissão do Journal of Physiology and Behaviour.
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Discussion
análise de corticosterona fecal fornece um meio de avaliar os padrões de longo prazo da atividade adrenal em cavalos. A natureza não-invasiva do método supera os efeitos de confusão de outros métodos de amostragem utilizados para avaliar a atividade adrenal incluindo saliva e no plasma análise 9. Além disso, a técnica tem uma vantagem não-invasivo claro se estudando cavalos livres que vão.
Há vários pontos-chave para discussão em relação a este método e seu uso adequado. Um passo crítico no protocolo é a validação do ensaio para a espécie em questão e escolha anticorpo apropriado. Se o anticorpo reage de forma cruzada usado com metabolitos de glucocorticóides estruturalmente semelhantes, mas funcionalmente diferentes isto pode confundir os resultados 17. Assim, ensaios para medir metabolitos hormonais requerem uma validação fisiológico ou biológico cuidado, detalhes dos quais não existem na literatura 18,19 e dentro do protocolo described.
A condição da amostra fecal precisa ser considerado incluindo frescura da amostra e exposição ambiental que ambos foram mostrados para afetar os níveis de metabólitos hormonais 20. Chuva excessiva ou exposição a luz do sol são conhecidos por causar aumentos ou diminuições das concentrações dos metabólitos, devido à metabolização bacteriana 21. Os pesquisadores que desejam coletar amostras de diferentes graus de frescura deve investigar os efeitos do tempo sobre a integridade da amostra, além de impacto ambiental. Isto pode ser feito antes do estudo através da criação de uma pequena experiência e periodicamente amostragem fezes de indivíduos masculinos e femininos, com diferentes graus de frescura e exposição a variáveis climáticas.
Na maioria dos cenários de investigação, amostras de indivíduos conhecidos vai ser útil ou necessário 10. Em cavalos domésticos isto pode ser conseguido por monitorização de um grupo para a defecação ou utilizando marcadores de alimentos ingeridos a IDentify fezes de indivíduos em grupos maiores 12. Em espécies que vão livre este pode ser demorado como o acompanhamento individual será necessário.
Ao seleccionar o método de análise de glicocorticóides, deve ser considerado que os resultados do ensaio de corticosterona fecal representam uma amostra reunida ao longo do tempo, em vez de um ponto de medida em tempo; Portanto, haverá menos flutuação dos dados. Se o pesquisador está interessado em efeitos a longo prazo de uma situação, a técnica de criação ou prática de gestão, em seguida, a análise fecal oferece uma técnica adequada. Se for necessária a avaliação de padrões curto prazo da concentração de hormona, em seguida, o plasma ou análise salivar seria o método preferido.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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