Introduction
Метод, описанный предполагает анализ концентрации кортикостерона в лошадиного кала, чтобы обеспечить неинвазивный оценку надпочечниковой активности. Измерение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси деятельности является общепринятым подходом к изучению реакции на потенциально аверсивных ситуации в обоих неволе и домашних видов. Эталонный метод и наиболее широко используемым методом является использование плазмы крови 1 , однако, альтернативные методы , такие как фекальные анализа были разработаны для того , чтобы преодолеть стресс , вызванный самой забора крови и позволяет возможность отслеживать свободные диапазоне видов.
Во время аверсивного ситуации, физиологический гомеостаз нарушается. Гипоталамус в выпусках мозга кортиколиберин (CRH), который действует на передней доли гипофиза и стимулирует высвобождение адренокортикотропного гормона (АКТГ). АКТГ поступает в кровоток и стимулирует кору надпочечников секретируют звонкойспецифичный глюкокортикоиды (GC). Глюкокортикоиды тесно связаны с стрессовыми событиями , а не последовательно производится во всех энергетических состояниях повышенной , поэтому они часто измеряется предпочтение по сравнению с другими стресс - связанных гормонов 2. Глюкокортикоиды ответственны за несколько адаптивных эффектов у лошадей. Энергия быстро мобилизован из мест хранения в организме в виде жирных кислот и глюкозы, потребление кислорода увеличивается, сенсорная функция усиливается 3 и кровоток уменьшается на области , не необходимых для движения 4. А также действует как механизм преодоления трудностей, то стресс , вызванный рост глюкокортикоидов может также помочь подготовить животное к следующему стрессора 5.
Оценка уровней гормонов в плазме и слюне включает в себя измерение фактического циркулирующего гормона, однако, измерение метаболитов в мерах фекалии метаболический конечный продукт гормона. Циркулирующие стероиды катаболизировано в лIver , прежде чем экскреции с желчью , где они подвергаются дальнейшим изменениям , облегченные ферментативной активности бактериальной флоры в кишечном дорожки 6. Таким образом, иммунологические тесты, направленные к глюкокортикоидов в крови не могут быть пригодны для анализа фекальных глюкокортикоидных метаболитов 7.
Как сбора фекалий может осуществляться без каких-либо помех на лошади, анализ кала на кортикостерона, широко используется для мониторинга активности HPA в ряде обстоятельств. Повышенные кортикостерона в фекалиях лошадей было сообщено в ответ на потенциально аверсивных ситуациях , включая во время послеоперационного ветеринарии для лечения 8 и в ограничительной корпусе 9. Фекальные выборки отражает уровень объединял глюкокортикоиды с течением времени , а не момент времени выборки , предлагаемой плазме и слюне , что делает его подходящим для мониторинга на долгий срок, хронический или сезонный характер 10. В связи с неинвазивнымприроды метода, образцы могут быть собраны несколько раз для индивидуума без необходимости захвата или ограничения 11. Тем не менее, определенные разновидности кишки транзитное время должны быть приняты во внимание при планировании протокола отбора проб. У лошадей, время прохождения кишка составляет около 18 ч 12 поэтому, надпочечниковой ответ и последующие кортикостерона метаболиты могут быть обнаружены в кале через один день после первоначальной активации оси HPA.
При использовании неинвазивных методов иммунологического тщательное обоснование для данного вида расследуется имеет важное значение 13. Кроме того, половые различия в гормональном метаболит экскреции сообщалось , вероятно , из - за различий в скорости обмена веществ и типа кортикостерона метаболита выводится из организма у различных видов , включая мышей , 14 и 15 кур. Поэтому важно, как часть этого метода, что анализ был апробирован для использования в мужских и женских домашних лошадей, как подробно описано в гое протокола. Эта разница в гормональном обмене веществ между мужчинами и женщинами имеет последствия для качества данных пока она редко рассматриваются и включены как часть проверки анализа.
Этот неинвазивный метод позволяет долгосрочную оценку надпочечниковой активности в домашних лошадей. Подробности протокола и проверки достоверности анализа и сама методика анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: процедуры, связанные с поля выборки и животных предметы были одобрены школой животных, сельских и науки об окружающей среде (Ares) в Nottingham Trent University.
1. Сбор образцов фекалий
Примечание: перчатки следует носить при обработке фекальных образцов и метанола. Если есть сильное подозрение, что животное может страдать от зооноза, защитной одежды, такие как пальто лаборатории также должны носить.
- Сбор образцов фекалий как можно скорее (в течение минут до нескольких часов) после дефекации и поместить их в мешок образца. Возьмите три-пять подвыборок любого осветленного образца с общим весом около 10 г. Этикетка мешок с датой и временем сбора, индивидуальный ID, и заморозить образец при температуре от -20 ° C до проведения анализа.
- Чтобы свести к минимуму ошибки, заморозить все образцы при -20 ° C до завершения исследования затем собрать образцы вместе для анализа в качестве одной партии. </ Li>
2. Фекальные Гормон Extraction
- Оставьте фекальные образцы оттаивают при комнатной температуре.
- Убедитесь, что образцы гомогенизируют вручную смешивания каждого образца в отдельном пакете образца.
- Для каждого образца весят 0,50 (± 0,003 г) фекального материала на микровесов в лодке взвешивании затем передать фекалии в стеклянную пробирку емкостью 8 мл. Используйте новую взвешивать лодку для каждого образца и очистки пинцет с 30% метанола между каждой пробы.
- Смешивают 0,5 г фекалий с 5 мл 90% метанол: вода, и трясти O / N на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
- На следующее утро, вихревые образец и затем центрифугировать в течение 20 мин при 600 г.
- Декантируйте метанольной фракции в стеклянную трубку и место 16 х 125 мм 2 в стойке на водяной бане до температуры 37 ° С. Выпаривают досуха с использованием воздуха в вытяжном шкафу. Ополосните флакон для экстракции и поместите оставшиеся фекальные гранулы в мешок клинических отходов для утилизации.
- Повторное приостановить фекальных экстрактов в 100%, 1 мл метанола и переносят в полипропиленовую пробирку 12 х 75 мм 2. Сразу не колпачком и хранить при температуре -20 ° С до проведения анализа.
3. Анализ Гормон
- Проведение анализа с помощью фермента, связанного иммуноанализа (EIA) с использованием поликлональных кортикостерона CJM006 антисыворотки.
Примечание:. Второй EIA был протестирован (кортизол R4866 антисыворотки, но это не удалось достичь биохимического этапа проверки (см раздел 4.1) поликлональных кортикостерона CJM006 антисыворотки и кортизол R4866 антисыворотки и соответствующие СПВН снабжены CJ Munro, Калифорнийский университет, Davis, CA. - Развести антисыворотки в соотношении 1: 15000 в буфере для покрывания (0,05 М NaHCO3, рН 9,6) с использованием повторяющихся пипетку и наконечник пипетки 50 мкл, загрузите 96-луночного микротитрационного планшета с 50 мкл / лунку. Накройте тарелку с тарелкой герметиком и инкубировать O / N при температуре 4 ° С. Оставьте две скважины, не покрытом представлять неспецифического связывания скважин (NSB).
- Непосредственно перед использованием промыть микротитровальные планшеты пять раз с использованием автоматического планшет для микротитрования шайбу (мойка раствора; 0,15 М NaCl, 0,05% твин 20).
- Загрузите планшеты с 50 мкл на лунку для NSB - х и «нулевой» скважины [буфера EIA (0,1 М NaPO 4, 0,149 М NaCl, 0,1% бычий сывороточный альбумин, рН 7,0) только], стандарты (кортикостерона, 3,9 - 1000 пг / а) или образцы фекалий экстракта (надлежащим образом разбавленные в 1:20 EIA буфера, смотрите раздел 4.1). Стандарты и нули должны быть проложены в трех экземплярах и четырежды, соответственно. Разведенные образцы фекалий экстракта и NSB должны быть запущены в двух экземплярах.
- Следуйте за этим сразу же с добавлением 50 мкл / лунку этикетке хрена конъюгированной пероксидазой , разведенного в буфере EIA 1 ᵻ: 70000.
- Инкубируйте микротитрационных планшетах в темноте в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте микротитровальные планшеты с промывочным раствором 5 раз и инкубировать пластин при комнатной температуре в темноте со 100 мкл / вэйл РТ субстрата [0,4 мМ 2,2'-Азино-ди- (3-этилбензтиазолин кислоты сульфоновая) диаммонийфосфат соли, 1,6 мМ H 2 O 2, 0,05 М цитрата, рН 4,0]. Подготовьте субстрат непосредственно перед использованием.
- Используйте spectrophometer при длине волны 405 нм для считывания микротитрационных планшетов. Инкубация пластин считается завершенной, когда оптическая плотность нулевых скважин достигает от 0,8 до 1,0.
- Для обеспечения воспроизводимости, используйте элементы управления [Стандарты EIA или биологического образца , разведенного в буфере EIA для связывания приблизительно 30% (стандарт EIA), 50% (биологический образец , например, пул домашней лошади фекального экстракта) и 70% (стандарт EIA) ], чтобы продемонстрировать внутри- и между анализами коэффициенты вариации <10% и <15% соответственно.
4. Фермент Linked-иммунологический: Проверка по изучению видов и секс
- Биохимический Validation (параллелизм)
- Использование буфера EIA, выполнить серийное разведение на объединенных фекально экстракт, в идеале взяты из подозреваемых в высоких и низких концентраций образцов гормона из нескольких особей (диапазон: аккуратный, 1: 2 до 1: 8192) и запустить по ОВОС, как описано в разделе 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: параллелизм считается достигается, когда серийные разведения фекальных экстрактов дают кривую перемещения параллельно стандартной кривой и результаты линейной регрессии показывают, R2> 0,90, уклоне> 0,50 и р <0,05. Последовательный разбавленный фекально экстракт , который связывает около 50% от стандартной кривой следует считать идеальным разбавление для выполнения всех фекальных экстрактов (например, 1:20). Там нет никакого вмешательства рассматривается на анализе, когда линейные результаты регрессии показывают, R2> 0,90 и р <0,05.
- Использование буфера EIA, выполнить серийное разведение на объединенных фекально экстракт, в идеале взяты из подозреваемых в высоких и низких концентраций образцов гормона из нескольких особей (диапазон: аккуратный, 1: 2 до 1: 8192) и запустить по ОВОС, как описано в разделе 3.
- Биохимический Validation (Помехи)
- Шип 200 мкл серийно разведенными стандартов (от нуля, от 3,9 до 1000 нг / лунку кортикостерона) с 200 мкл соответствующим образом разбавленного объединенном фекального экстракта [разведенного в 50% связывания определяется Параллелисм (1:20)] и работать на EIA, как и в разделе 3. После анализа EIA участке наблюдаемая концентрация минус фон (концентрация нулевого образца) по сравнению с ожидаемой концентрацией.
Примечание: Если добавление разбавленного пула фекального экстракта стандартов не приводит к существенному изменению ожидаемой суммы и линейные результаты регрессии дает R 2> 0,90, наклон , близкий к 1,0 и р <0,05. Отсутствие взаимодействия с ОВОС не было достигнуто.
- Шип 200 мкл серийно разведенными стандартов (от нуля, от 3,9 до 1000 нг / лунку кортикостерона) с 200 мкл соответствующим образом разбавленного объединенном фекального экстракта [разведенного в 50% связывания определяется Параллелисм (1:20)] и работать на EIA, как и в разделе 3. После анализа EIA участке наблюдаемая концентрация минус фон (концентрация нулевого образца) по сравнению с ожидаемой концентрацией.
- Биологические проверки:
Примечание: Демонстрация того, что выбранная EIA имеет возможность измерения биологически значимых изменений гормона интереса [например, рост глюкокортикоидов концентраций следующих фармакологической (АКТГ часто является лицензированным процедура) или биологической проблемой (например, психологические и / или окружающей среды, более вероятно, будет уступающую нерегулируемого событие)].- Выберите, извлекать и анализировать образцы фекалий для глюкокортикоидов метаболита концентрациис помощью процесса, подробно описанную в разделах 1 - 3 до и после сложного события.
Примечание: Сложные события будут конкретные виды. Примерный способ приведен ниже для домашней лошади. Полные примеры сложных событий для лошадей были опубликованы ранее в том числе использование управления 9 и рыбоводства процедур 16. Значительный рост глюкокортикоидов метаболита концентрации после сложного события должны быть соблюдены и подтверждены с помощью статистического анализа. Это должно включать в соответствующих случаях, эффект повторных измерений, дата выборки и индивидуальных. Биологическая проверка затем считается достигнута.
- Выберите, извлекать и анализировать образцы фекалий для глюкокортикоидов метаболита концентрациис помощью процесса, подробно описанную в разделах 1 - 3 до и после сложного события.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Внутренние лошади (п = 16, 8 кобылы, 8 меринов) со средним возрастом 15 лет (± 3) были сгруппированы в зависимости от пола и подвергают четырех конструкций жилищного с увеличением уровня социальной изоляции (п = 4 лошади / лечение). Все для дома 1 участвуют лошади, живущие в среде стада, тесно имитируя их естественной среде обитания. Все для дома 2 участвуют лошади, живущие в парах в помещении сарая. Корпус 3 задействованные лошади размещались один в конюшне, но с визуального контакта с другими лошадьми и корпус 4 участвующих в полной изоляции лошадей.
Воздействие каждой обработки в рандомизированном дизайн блока в течение пяти дней. Вслед за этим были лошади оказались в траве загонах в своих экспериментальных группах в течение двух дней перед воздействием следующего лечения жилищного строительства. Фекальные образцы собирали один раз в день в дни 1, 2 и 3 проводится в каждой обработки корпуса от N = 8 лошадей (п = 2 лошади в пределах каждой обработки). Фекальные образцы собирали, как можно скорее и в течение 1 ч, после дефекации. Все образцы были собраны после 1200 часов на первый полный день стойлового означает, что первый образец в один день было собрано по крайней мере 20 часов после того, как лошадь была введена на лечение жилья. Образцы из дня один, два и три ( в общей сложности 24 проб в конструкции корпуса) были оценены для фекальных уровней кортикостерона , отражающих последние 18 часов из - за скорости прохождения ДИГЕСТА 12. Те же отдельные лошади были использованы для анализа кала на протяжении всего исследования. Для получения более подробной информации о данной биологической задачи, в том числе дополнительных измеряемых параметров обратитесь к опубликованной работе 9 примеров альтернативных захватывающих событий для домашних лошадей можно найти в литературе 16.
В этом разделе приведены примеры результатов биохимического проверки (параллелизм) для обоих корticosterone и кортизол у самцов и самок домашних фекалий лошадей. В этом разделе также представлены репрезентативные данные, полученные от фекального экстракции и анализа ОВОС. Результаты были получены в рамках более крупного исследования , которые исследовали влияние социальной изоляции , вызванной конструкции корпуса, при лошадиного поведения и физиологии 9.
Результаты биохимического проверки показали , что кортикостерона ОВОС было целесообразно измерять уровень надпочечниковой активности [Фиг.1А мужской образец% связывания = 25,349 + 0,729 (связывание стандарт%), R 2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, р меньше 0,001); Фигура 1В женский образец% связывания = 29,989 + 0,7198 (связывание стандарт%), R 2 = 0,95594, F (1, 7) = 151,865, р менее 0,001] , но не кортизол ИФА [фиг.1С мужской образец% связывания = 79,089 + 0,0629 (связывание стандарт%), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1,485, р = 0,262); Рисунок 1D женский образец% Связывания = 81,652 + 0,0772 (связывание стандарт%), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2,422, p = 0,164]. По мере того как кортикостерона EIA продемонстрировала параллелизм в отличие от кортизол EIA и испытания помех на кортикостерона ОВОС не было выявлено никаких признаков матрицы помех, так как добавление разведенной фекального экстракта стандартов кортикостерона не изменяет количество ожидаемого (мужчины: ФАКТ = 1,302 + 1,017 (ожидаемый) , R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, р <0,001; женщины: ФАКТ = 0,3169 + 1,0931 (ожидаемый), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, р <0,001;).
Результаты ОВОС показали , что не было никаких существенных различий в уровнях кортикостерона между мужчинами лошадей (М = 37,7, SD = 14,1) и самок лошадей (М = 33,8, SD = 12,7; т (70) = 1,23, р = 0,22) , Уровень фекального кортикостерона увеличился как уровень изоляции увеличился. Изолированные лошади (корпус дизайн 4) был значительно вышеэр уровни фекального кортикостерона по сравнению со всеми другими конструкциями жилья (Уилкса Lambda = 0,58, F (3, 18) = 4,29, р = 0,01, многомерный частичная ETA квадрат = 0,42; р ≤0.02). Уровень фекального кортикостерона был выше для всех лошадей на всех трех образцов дней в наиболее изолированном корпусе, когда по сравнению с другими способами лечения жилищного строительства. Концентрации среднего фекального кортикостерона для каждой конструкции корпуса для каждого дня, представлены в таблице 1.
Рисунок 1. Биохимический Validation (параллелизм) из Кортикостерон и кортизол Enzyme Linked-иммуноанализа для мужчин и женщин лошадей. Эта цифра детализирует процентное связывание последовательных разбавленных пулов мужского и женского домашней лошади фекальных экстрактов против повышения кортикостерона и кортизола в крови концентрации стандартной кривой на ОВОС. Результаты показывают, чтокортикостерона (A, мужчина, B, женщины) , а не кортизол EIA (C, мужчина; D, женщина). дала успешную кривую смещения параллельно с кортикостерона стандартной кривой EIA Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| MEAN (± SD) Фекальные кортикостерона (нг / г) В КАЖДОЙ ЖИЛИЩНОГО ЛЕЧЕНИЯ | ||||
| ЖИЛИЩНО ЛЕЧЕНИЕ | 1 день | День 2 | 3 -й день | В ОБЩЕМ И ЦЕЛОМ |
| 1 | 31,73 ± 10,2 | 32,18 ± 8,0 | 29,22 ± 5,9 | 31,05 ± 7,8 |
| 2 | 32,75 ± 10,0 | 33,66 ± 12,9 | 34,67 ± 9,3 | 33,69 ± 10,3 |
| 3 | 35,06 ± 14,6 | 35,14 ± 15,9 | 33,13 ± 12,5 | 34,44 ± 13,6 |
| </ TD> | * | |||
| 4 | 38,16 ± 17,8 | 42,00 ± 16.7 | 41,52 ± 17.6 | 40,56 ± 16,5 |
Таблица 1. Средние (± SD) Fecal кортикостерона (нг / г) для каждого жилищного лечения в течение нескольких дней один, два и три и среднего Fecal кортикостерона (нг / г) в течение всех трех дней ( в целом) в каждом обращении жилищного строительства. Эта таблица показывает средние значения для фекального кортикостерона (нг / г) ± стандартное отклонение для каждой из обработок на жилье в течение дня один, два и три. Образцы собирали по крайней мере 20 часов после того, как лошади вошли в корпус. Он также показывает среднее фекально кортикостерона (нг / г) ± стандартное отклонение для всех трех дней (в целом) в каждой обработке корпуса. Фекально кортикостерона Концентратион был значительно выше (*) в течение изолированной конструкции корпуса. Самая низкая концентрация фекального кортикостерона на все дни было обнаружено в группе размещена лечение (лечение 1). Взято из Yarnell и др. (2015), с разрешения журнала физиологии и поведения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фекальные анализ кортикостерона предоставляет средства оценки долгосрочных моделей надпочечниковой активности у лошадей. Неинвазивный характер метода преодолевает искажающие эффекты других методов отбора проб , используемых для оценки активности коры надпочечников , включая слюну и плазменного анализа 9. Кроме того, метод имеет четкую неинвазивный преимущество, если учиться бесплатно в пределах лошадей.
Есть несколько ключевых моментов, чтобы обсудить относительно этого метода и его надлежащего использования. Важным шагом в протоколе является проверка анализа для рассматриваемых видов и соответствующем выборе антител. Если антитело , используемое перекрестно реагирует с метаболиты структурно подобных , но функционально различных глюкокортикоидов это может запутать результаты 17. Поэтому анализы для измерения гормонов метаболитов требуют тщательного физиологического или биологического проверки, сведения о которых существуют в литературе 18,19 и в рамках Descr протоколаibed.
Условие фекального образца необходимо рассматривать в том числе и свежести образца и воздействием окружающей среды , которые , как было показано, влияют гормональные уровни 20 метаболита. Чрезмерный дождь или воздействие солнечного света , как известно, вызывает увеличение или уменьшение концентрации метаболитов из - за бактериальной метаболизму 21. Исследователи, которые хотят, чтобы собрать образцы различной степени свежести необходимо исследовать влияние времени на целостность образца, в дополнение к воздействия на окружающую среду. Это может быть сделано до начала исследования, установив небольшой эксперимент и периодически отбор проб фекалий из мужских и женских особей, с разной степенью свежести и воздействием климатических переменных.
В большинстве исследований сценариев, образцы из известных лиц будут полезны или необходимы 10. В домашних лошадей это может быть достигнуто путем мониторинга группы для дефекации или с помощью маркеров заглатывании пищевые к идентификаторуentify фекалии от отдельных лиц в более крупных групп 12. В свободных пределах видов это может оказаться много времени, как будет требоваться индивидуальное отслеживание.
При выборе метода анализа глюкокортикоидов следует учитывать, что результаты анализа фекальной кортикостерона представляют собой объединенную выборку в течение долгого времени, а не момент времени измерения; Поэтому, будет меньше колебания в данных. Если исследователь заинтересован в долгосрочных эффектов ситуации, методика животноводства или практики управления, то фекальные анализ предлагает соответствующую технику. Если требуется оценка краткосрочных моделей в концентрации гормонов, то плазма или анализ слюны будет предпочтительным методом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro - UC Davis | No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays | |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules - pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules - pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules - pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette - 1,000 µl | VWR | ||
| Pipette - 200 µl | VWR | ||
| Pipette - 20 µl | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T.
- Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H.
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
