Abstract
Immunofenotipizzazione di sangue periferico da flusso determina citometria a cambiamenti dello stato di frequenza e l'attivazione dei leucociti periferici durante la malattia e il trattamento. Essa ha il potenziale per prevedere l'efficacia terapeutica e di identificare nuovi target terapeutici. Tutta la colorazione del sangue utilizza il sangue non manipolata, che riduce al minimo gli artefatti che possono verificarsi durante la preparazione del campione. Tuttavia, tutta la colorazione sangue deve essere fatto sul sangue raccolto di recente per garantire l'integrità del campione. Inoltre, è meglio preparare un cocktail di anticorpi nello stesso giorno per evitare la potenziale instabilità del tandem-coloranti e prevenire l'interazione tra reagenti coloranti viola brillanti. Pertanto, tutta macchie di sangue richiede un'attenta standardizzazione per il controllo di variabilità intra ed inter-sperimentale.
Qui riportiamo dispiegamento di un gestore di liquido automatizzato dotato di (2D) lettore di codice a barre bidimensionale in un processo standard di rendere gli anticorpicocktail Y per citometria a flusso. Anticorpi sono stati trasferiti in provette 2D codice a barre disposte in un formato a 96 pozzetti e il loro contenuto compilato in un database. Il gestore liquido potrebbe quindi individuare le fiale di anticorpi fonte facendo riferimento a nomi di anticorpi all'interno del database. Il nostro metodo eliminato coordinamento noioso per il posizionamento di tubi di anticorpi di origine. Ha fornito versatilità che consente all'utente di cambiare facilmente qualsiasi numero di dati nel processo di erogazione di anticorpi come anticorpo specifico da usare, il volume e la destinazione modificando il database senza riscrivere scripting nel metodo software per ciascun test.
Un proof of concept esperimento ha raggiunto una precisione eccezionale saggio inter e intra, dimostrano la preparazione replica di un 11-colore, il flusso 17-anticorpo citometria a test. Queste metodologie sono aumentate throughput complessivo di citometria a flusso saggi e facilitato la preparazione quotidiana delle complesse cocktail di anticorpi necessari per il feno dettagliatacaratterizzazione typic di sangue periferico non coagulato appena raccolti.
Introduction
Immunofenotipizzazione di sangue periferico umano determina cambiamenti quantitativi e qualitativi in sottoinsiemi di cellule immunitarie 1. Esso permette di comprendere meglio i meccanismi di azione e di resistenza, la scoperta di biomarcatori predittivi aiuti, e facilita lo sviluppo di immunoterapie combinazione. Pertanto, la convalida e la standardizzazione di immunofenotipizzazione è una zona di notevole interesse per i ricercatori accademici, laboratori clinici, e le industrie.
Anche se immunofenotipizzazione di sangue periferico con metodi citometria di flusso è attualmente utilizzato per la gestione clinica delle neoplasie ematologiche 2,3 e virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 4,5, immunofenotipizzazione affidabile di sangue periferico per le richieste di immunoterapia considerazioni specifiche per la convalida e la standardizzazione perché richiede una più ampia copertura su sottoinsiemi di cellule del sistema immunitario e l'attivazione / recettori inibitori 1,6-8. succeimmunofenotipizzazione ssful richiede un'attenta standardizzazione per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variabilità legate alla configurazione dello strumento e la procedura di colorazione delle cellule 9,10. Mentre la standardizzazione delle impostazioni dello strumento per la citometria di flusso è ben definito per affrontare il primo problema 9,11,12, non è ancora chiaro come ridurre al minimo la variabilità legate alla colorazione delle cellule senza limitare la copertura di sottoinsiemi di cellule immunitarie e il loro stato di attivazione.
Poiché il numero di antigeni da rilevare aumenta, così fa anche la possibilità di errore e variabilità causa ottimale erogazione di reagente e la contaminazione incrociata. Metodi per l'analisi phenoptypic di sangue intero anticoagulato sono stati stabiliti alla fine del 1980 per l'uso in test di laboratorio clinico. Questi stessi metodi servono le esigenze del laboratorio di ricerca per la preparazione del campione. Soprattutto, i cocktail di anticorpi utilizzati nel laboratorio clinico sono tipicamente meno complesse e avaOTTIMIZZARE LE OPPORTUNITÀ pre-titolato e pre-miscelato dal produttore. È necessario solo un unico trasferimento del cocktail di anticorpi pre-miscelato. Nell'impostazione di ricerca, cocktail di anticorpi di 10-16 anticorpi sono tipici. Ogni cocktail deve essere convalidato per la stabilità dal laboratorio o preparato fresco prima di ogni test. Preparazione più cocktail di anticorpi per un campione potrebbe comportare la dispensazione di 50-80 singoli anticorpi, un compito che è sia noioso e soggetto a errori.
Automazione di preparazione di cocktail ha diversi vantaggi rispetto preparazione di cocktail manuale come il minor numero di errori, una maggiore precisione di pipettaggio, e forse anche diminuito gli sprechi di reagente. Qui, si segnala il successo di un gestore di liquido automatizzato dotato di un (2D) lettore di codice a barre bidimensionale nel processo di cella-colorazione immunofenotipizzazione per ridurre al minimo la variabilità legate alla preparazione del campione.
Protocol
Raccolta e utilizzo del sangue periferico in questo protocollo è stato approvato dalla Provvidenza Salute & Servizi Institutional Review Board. Tutti i soggetti umani, purché il loro consenso informato scritto.
Nota: Seguire le precauzioni universali. Tutti sangue umano devono essere trattati come se infettive e maneggiato secondo livello di biosicurezza 2 pratiche.
Nota: immunofenotipizzazione con sangue intero periferico avviene tramite l'incubazione anticoagulante sangue intero con anticorpi monoclonali fluorescenti-tag per rilevare antigeni di superficie delle cellule, seguita da lisi ipotonica per rimuovere le cellule rosse del sangue. Le cellule vengono lavate e il campione è analizzato da un citometro di flusso. Il metodo qui descritto si concentra sulla preparazione di cocktail anticorpi mediante conduttore liquido automatizzato dotato di un lettore di codici a barre 2D. In primo luogo, il "cocktail di Base" che identifica i sottoinsiemi di cellule immunitarie e la "Attivazione Cocktail" che monitora iantigeni nducible sono preparati separatamente (Tabella 1). Poi entrambi i cocktail si mescolano per creare un "Master Antibody Cocktail". Vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro.
1. campione
- Raccogliere sangue periferico mediante prelievo venoso in un tubo di raccolta del sangue anticoagulante eparina sodica, capovolgere delicatamente più volte per assicurare la corretta miscelazione, e quindi tenere a temperatura ambiente. Rifiuta esemplare se coagulato o emolizzati 13.
2. Preparazione Labware
- Etichetta 2D tubi di codici a barre con etichette leggibili (nome anticorpi, Vender, numero di catalogo, e numero di lotto).
- Trasferire tutto il contenuto di fiale di anticorpi dalla Vender (elencati nella tabella 1) per corrispondenti tubi di codici a barre 2D.
Nota: prendere estrema cautela per non introdurre bolle come bolle falsamente innescare rilevamento del livello del liquido (LLS) che si traduce in trasferimento ottimale di reagente.
Nota: Assicurarsi che ogni VI anticorpiAl ha anticorpi sufficienti per la corsa. - Leggere il codice a barre 2D per ciascun tubo dal lettore di codici a barre 2D.
- Fare un foglio di calcolo che contiene i nomi di anticorpi (AB) e codici a barre legge (BC) utilizzando un software di foglio di calcolo e salvarlo in un file di valori separati da virgole (CSV) come "AB_BC.csv" (Tabella 2).
Nota: Assicurarsi di formattare le celle come "testo" "Numero", non al fine di mantenere il primo "0" per i numeri di codici a barre se del caso (ad esempio, 0.163.562,544 mila). Aggiungere "x, 0000000000" alla fine secondo fine dei dati. - piastre di metallo Vite LLS al telaio del ponte in curva liquido automatizzato per consentire LLS.
3. Programmazione per l'Automated Liquid Handler
Nota: Due metodi saranno programmate nel software per il gestore liquido automatizzato: a) un metodo per realizzare "cocktail Base" e "attivazione cocktail" in 3.1), e b) un metodo per realizzare "Master AntiboCocktail dy "combinando il" Cocktail Base "e" Attivazione Cocktail "a 3.2) (Figura 1).
- Creare un metodo per la realizzazione del "cocktail Base" e "attivazione cocktail" (Figura 2).
- Utilizzando il software foglio di calcolo, fare un foglio di calcolo che contiene informazioni per i nomi di anticorpi (AB_NAME), posizione del tubo di destinazione (BEN-BASE o ben-ACT), e il volume (VOL) a microlitri per "Cocktail Base" con punte P50 (BASE_CT_P50: Tabella 3) o punte P200 (BASE_CT_P200: Tabella 4) e "Attivazione cocktail" con punte P50 (ACT_CT_P50: Tabella 5) o suggerimenti P200 (ACT_CT_P200: Tabella 6). salvarli come file CSV. Per "well-BASE" e la posizione "BEN-ACT", fare riferimento ai numeri in figura 3.
Nota: VOL = titolo x (# di colorazione + 2) ul. I titoli di cui alla tabella 1 sono molto specifici. Operatore dovrebbe determinare una tettaer per ogni anticorpo come descritto da altri 14. - Fare clic su un'icona per avviare il software per il gestore di liquido automatizzato sul computer per creare un metodo per rendere "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail".
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.3-3.1.7 definiranno il materiale da laboratorio: la cremagliera del tubo con tubi di codici a barre 2D (Figura 4). Le misurazioni sono forniti come riferimento. Gli investigatori devono stabilire e regolare per ogni strumento. - Nella barra degli strumenti sotto "Progetto", selezionare "Labware Type Editor". Pulsante destro del mouse su un oggetto per un piatto ben piatta 96, selezionare "Copia" e digitare "Matrix_OneML_TubeRack" in una finestra pop-up.
- Fare doppio clic sull'oggetto "Matrix_OneML_TubeRack" per aprire la finestra di dialogo. Evidenziare "Informazioni di base", impostare 12.775 cm (X) e 8.546 cm (Y) per "Span" e 4.625 cm per "Altezza". (Figura 4A).
- Avanti, evidenziare "movimInformazioni ent ". Impostare Gripper Offset 0 (X), 0 (Y), e 0.3 (Z), pinza spremere -0.1cm, Gripper unsqueeze 2,6 cm, Speed Limit 75%, e quindi controllare" Utilizzare il sensore pinza "(Figura 4B).
- Poi, evidenziare "Well_1". Imposta come segue: "Bene Offset"; 1,5 cm (X) e 1,13 cm (Y), "Bene Count"; 12 (X) e 8 (Y), "Bene spaziatura"; 0.9 (X) e 0,9 (Y), "Volume massimo"; 1.500 ml, Formato ", regolare", Colum 2 Offset ", 0, e" Volume predefinito "; 0 (Figura 4C).
- Infine, premere un pulsante "Modifica ..." a destra di "Well Configurazione" (Figura 4C). In una finestra pop-up, impostato come segue: "Forma"; Tondo, "Upper Radius"; 0,37 cm, "Lower Radius"; 0,37 cm, e "Altezza"; 3.9 cm. Controllare "sezione inferiore" e impostare "Forma"; Cone, "Raggio"; 0,37 cm, e "Altezza"; 0,4 cm (Figura 4D).
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.8-3.1.11 definiranno il materiale da laboratorio: la cremagliera del tubo con tubi microcentrifuga. Le misurazioni sono forniti come riferimento. Gli investigatori devono stabilire e regolare per ogni strumento. - Nella barra degli strumenti sotto "Progetto", selezionare "Labware Type Editor". Pulsante destro del mouse su un oggetto per un rack a 24 posizioni, selezionare "Copia" e tipo "SmallTuberack_microfugetubes".
- Fare doppio clic sull'oggetto "SmallTuberack_microfugetubes" per aprire la finestra di dialogo. Evidenziare "Informazioni di base", impostare 12,75 cm (X) e 8,5 cm (Y) per "Span" e 3,95 cm per "Altezza".
- Avanti, evidenziare "Well_1". Imposta come segue: "Bene Offset"; 1.621 cm (X) e 1.181 cm (Y), "Bene Count"; 6 (X) e 4 (Y), "Bene spaziatura"; 1.9 (X) e 1.9 (Y), "Volume massimo"; 1.000 ml, Formato ", regolare", Colum 2 Offset ", 0, e" Volume predefinito "; 0.
- Infine, premereun "... Modifica" pulsante alla destra di "Bene Configurazione". In una finestra pop-up, impostato come segue: "Forma"; Tondo, "Upper Radius"; 0.3345 cm, "Lower Radius"; 0.274 cm, e "Altezza"; 3.6728 cm. Controllare "sezione inferiore" e impostare "Forma"; Emisfero, e "Raggio"; 0.1575 cm.
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.12-3.1.35 spiegheranno come programmare il "nuovo metodo" per rendere il "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail" (Figura 2). - Fare clic sull'icona "nuovo metodo" e aperto.
- Trascinare l'icona "IF" tra una e l'icona "Start" su "Fine" nel nuovo metodo (Figura 2). Fare clic ed evidenziare l'icona di "IF". Digitare quanto segue per la condizione:. CreateObject ( "World.EngineObject") simulando
Nota: Questo consentirà di evitare il software di eseguire il controllo degli errori e abilitare questo metodo funzioni. Senza questo passo, le software vi avviserà informazioni mancanti per set di dati come codice a barre legge sono disponibili solo dopo la fase "VisionMate: leggere codici a barre" descritta in 3.1.20). Dal momento che questo passo disabilita la fase di verifica del software, l'operatore deve confermare ci sono abbastanza suggerimenti e reattivo sul ponte per eseguire questo metodo. - Inserire l'icona "Strumento Configurazione" tra l'icona "Allora", e l'icona del primo "fine" sotto l'icona "IF" (Figura 2).
Nota: Per tutte le seguenti operazioni, le icone di trascinamento tra l'icona "Else" e l'icona secondo "Fine" sotto l'icona "IF" in modo che passi sono incapsulati nel "Else". - Trascinare l'icona "Strumento Configurazione" sotto l'icona "Else" nel metodo (Figura 2).
- Fare clic sull'icona "Impostazioni dello strumento" nel metodo per aprire la finestra. Configurare labwares trascinando le icone per P50 LLS filtrati consigli, suggerimenti P200 LLS filtrati, P1000 suggerimenti, "Matrix_OneML_TubeRack", due "SmallTuberack_microfugetubes", e serbatoio di corrispondente posizione ponte dalla lista delle icone.
- Aprire la finestra di dialogo per il "Matrix_OneML_TubeRack" e il nome di "AB_BOX". Aprire la finestra di dialogo per i "SmallTuberack_microfugetubes" e denominare uno come "BASE_CT" per cocktail di base e l'altro come "ACT_CT" per l'attivazione cocktail (Figura 5).
- Trascinare l'icona "Transfer" per il metodo (Figura 2) per aggiungere un passaggio per il trasferimento del buffer dal serbatoio in tubi microcentrifuga per "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail". volume di trasferimento = 25 microlitri x (# di macchiare +2) per "Cocktail Base" e = 25 microlitri x (# di macchiare +2) per "Cocktail di attivazione".
- Aggiungere passi per lo spostamento del "Matrix_OneML_TubeRack" sul lettore di codici a barre 2D. Trascinare l'icona "VisionMate Move" per il metodo (Fifigura 2) e specificare il passaggio dalla posizione ponte iniziale alla posizione di lettore codice a barre sul ponte.
- Trascinare un "VisionMate: leggere codici a barre" icona per il metodo (Figura 2). Aprire la finestra di dialogo, e scegliere "VisionMate" come il dispositivo e il nome il set di dati come "BC_Read".
- Trascinare un "Pausa utente" (Figura 2), selezionare "Pausa tutto il sistema e visualizzare il messaggio" e digitare un commento nel campo per ricordare agli utenti di confermare che tutti i codici a barre vengono letti prima di procedere alla fase successiva.
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.22-3.1.26 collegheranno tra luoghi e nomi e degli anticorpi utilizzando le informazioni del codice a barre. Ciò consentirà il gestore liquido automatizzato per trovare una posizione di anticorpo particolare basato sul nome anticorpi "AB". - Trascinare l'icona di "Reporting Step" per il metodo (Figura 2).
- Fare un file di testo utilizzando un programma di testo e salvarlocome "BC_Readout" nella cartella documento sul computer.
- Aprire la finestra di dialogo per "Reporting Step", scegliere "File di testo" per stile Report e selezionare il file "BC_Readout" attraverso la navigazione.
Nota: Il file risultante "BC_Readout" conterrà informazioni per tutti labwares sul ponte, ad eccezione punte come configurato in 3.1.16 comprese le informazioni per codici a barre legge per i tubi di codici a barre 2D e luoghi bene nel "Matrix_OneML_TubeRack". - Aggiungere un "Crea Data Set" passo per collegare il codice a barre e le informazioni bene. Trascinare l'icona "Crea Data Set" per il metodo (Figura 2), fare clic per aprire la finestra di dialogo, scegliere "Leggere da un file" e selezionare "AB_BC.csv" (Tabella 2 creata in 2.4), selezionare "virgole delimitato "e" Il file ha una riga di intestazione ".
Nota: Nella finestra di anteprima del file, nomi di anticorpi (AB) e codici a barre legge (BC) dovrebbe essere visto. - Nelle sla finestra di dialogo per ame "Crea Data Set" in 3.1.25, selezionare "VM1" per la posizione da laboratorio e "0" per la profondità dello stack, selezionare "Far corrispondere l'ID campione", e utilizzare il campo "BC" da abbinare con il Data impostare "BC_Read". Selezionare "AB" e "BC" per "insiemi di dati da Creato" (Figura 6).
- Trascinare l'icona "VisionMate Move" per il metodo (Figura 2) e specificare il passaggio dalla posizione di lettore codice a barre "VM1" ritorno alla posizione iniziale di ponte sul ponte.
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.28-3.1.33 definiranno fase di trasferimento per "Cocktail di base". - Trascinare l'icona di un "Elenco di lavoro" (figura 2) e sfogliare per selezionare il file della lista di lavoro "Base_CT_P50" (Tabella 3) creato al punto 3.1.1. Controllare "Loop intera lista di lavoro".
- Trascinare l'icona "Transfer" direttamente sotto l'icona "Elenco di lavoro" (Figura 2). </ Li>
- Fare clic sull'icona "Transfer" per aprire il campo specifica. Selezionare solo una delle sonde, P50 LLS punte filtrati, selezionare "scaricarli" quando il trasferimento è fatto, e controllare "Modifica punte tra i trasferimenti". Aggiungere fonte facendo clic su "Clicca qui per aggiungere una fonte", selezionare "Matrix_OneML_TubeRack" come da laboratorio, e selezionare posizione sul ponte per nome "AB_BOX".
- Nel campo specifica per "Transfer", "Zoom in" sullo schema di 96 pozzi cliccando col tasto destro e scegliere "AB" immediatamente dopo "Usa Data Set" e selezionare dove i suoi valori "sono uguali a" e "= AB_NAME" . Selezionare la tecnica del trasferimento di scelta.
Nota: l'uso di LLS è altamente consigliato per evitare di ottenere detriti precipitati nei pressi di fondo. - Nel campo specifica per "Transfer", selezionare la destinazione facendo clic su "Fare clic qui per aggiungere una destinazione", tasto destro del mouse per ingrandire e selezionare "SmallTuberack_microfugetubes "come materiale da laboratorio, volume come" = VOL ", e la posizione sul ponte per nome" BASE_CT ". Dopo lo zoom out, fare clic destro ancora una volta, selezionare" specificare la selezione come testo ", e verificare" Specifica gli obiettivi con l'espressione in basso: "e digitare" = WELL_BASE "come una variabile per una posizione di ponte di destinazione.
- Ripetere 3.1.29-3.1.32 allo stesso modo per "Cocktail Base" con punte P200, selezionando il file CSV "Base_CT_P200" (Tabella 4) e poi scegliere P200 LLS suggerimenti e tecnica appropriata pipetta filtrati per P200 LLS punte filtrati.
Nota: Le seguenti operazioni 3.1.34 e 3.1.35 definiranno fase di trasferimento per "Cocktail di attivazione". - Ripetere 3.1.29-3.1.32 allo stesso modo per "Cocktail Attivazione" con punte P50, selezionando il file CSV "ACT_CT_P50" (Tabella 5) e scegliendo "ACT_CT" come destinazione. Fare clic destro sulla destinazione e controllare "specificare la selezione come testo";. Controllare "Specifica gli obiettivi con l'espressione di seguito:" e digitare "= WELL_ACT" come una variabile per una posizione di destinazione.
- Ripetere 3.1.34 simile per "Cocktail Attivazione" con punte P200, selezionando il file CSV "ACT_CT_P200" (Tabella 6) e punte P200 LLS filtrati.
Nota: Il metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail" può essere chiuso dopo il salvataggio.
- Utilizzando il software foglio di calcolo, fare un foglio di calcolo che contiene informazioni per i nomi di anticorpi (AB_NAME), posizione del tubo di destinazione (BEN-BASE o ben-ACT), e il volume (VOL) a microlitri per "Cocktail Base" con punte P50 (BASE_CT_P50: Tabella 3) o punte P200 (BASE_CT_P200: Tabella 4) e "Attivazione cocktail" con punte P50 (ACT_CT_P50: Tabella 5) o suggerimenti P200 (ACT_CT_P200: Tabella 6). salvarli come file CSV. Per "well-BASE" e la posizione "BEN-ACT", fare riferimento ai numeri in figura 3.
- Creare un nuovo metodo per fare "Master Antibody Cocktail" combinando "Cocktail Base" e "Attivazione del cocktail" in 5 ml tubi in polistirolo a fondo tondo (Figura 7).
Nota: Le seguenti operazioni 3.2.1-3.2.6 definiranno il materiale da laboratorio: il rack tubo con 5 ml provette di polistirene a fondo rotondo. I numeri sono forniti per riferimento. Gli investigatori devono stabilire e regolare per lo strumento.- Nella barra degli strumenti sotto "Progetto", selezionare "Labware Type Editor". Destra-click su un oggetto per il rack a 24 posizioni, selezionare "Copia" e digitare "BiocisionCoolRack_XT" in una finestra pop-up.
- Fare doppio clic sull'oggetto "BiocisionCoolRack_XT" per aprire la finestra di dialogo.
- Evidenziare "Informazioni di base", impostare 12.78 cm (X) e 8.57 cm (Y) per "Span" e 7.93 cm per "Altezza".
- Evidenziare "Well_1". Imposta come segue: "Bene Offset"; 1,55 cm (X) e 1.33 cm (Y), "Bene Count"; 6 (X) e 4 (Y), "Bene spaziatura"; 1.95 (X) e 1.97 (Y), "Volume massimo"; 2.000 ml, Formato ", regolare", Colum 2 Offset ", 0, e" Volume predefinito "; 0.
- Aprire "Bene Configurazione" da modificare. Imposta come segue: "Forma"; Tondo, "Upper Radius"; 0.5375 cm, "Lower Radius"; 0,48 cm, e "Altezza"; 7.07 cm. Controllare "sezione inferiore" e impostare "Forma"; Emisfero, e "Raggio"; 0,45 cm.
Nota: I seguenti passaggi3.2.6-3.2.7 sarà definire fasi di trasferimento e di essere utilizzato nel passaggio 3.2.14. - Creare un file CSV "AB_MACT" (Tabella 7) per fare cocktail di anticorpi con le seguenti intestazioni: a) "SRC_BASE"; un nome da laboratorio per "Cocktail Base", b) "WELL_BASE"; e posizioni nel labware per "Cocktail Base", c) "VOL_BASE"; volume di trasferimento per "Cocktail Base" in microlitri, d) "SRC_ACT"; un nome da laboratorio per "Cocktail di attivazione", e) "WELL_ACT"; e posizioni nel labware per "Cocktail di attivazione", f) "VOL_ACT"; volume di trasferimento per "Cocktail di attivazione" in ml, g) "DEST_MACT"; informazioni sulla posizione di ponte per "Master Antibody Cocktail", e h) "WELL_MACT"; bene posizionare le informazioni nel rack tubo per "Master Antibody Cocktail".
- Compilare le informazioni sotto intestazioni create in 3.2.6) (Tabella 7) come segue: a) usare "BASE_CT"sotto SRC_BASE, b) informazioni elenco ben posizione per "WELL_BASE" come mostrato in figura 3A, c) lista volume totale di anticorpi (25 microlitri di tampone + somma di tutti i titoli anticorpali base per singola colorazione) sotto "VOL_BASE", d) utilizzare "ACT_CT" sotto SRC_ACT, e) elenco ben informazioni sulla posizione per "WELL_BASE" come mostrato in figura 3B, f) l'elenco volume totale di anticorpi (25 ml di tampone + somma di tutti i titoli anticorpali di attivazione per singola colorazione) sotto "VOL_ACT". Trasferimento 25 ml di tampone per T-Cell FM3. Fare riferimento alla Tabella 1 per le prove 1-3, g) uso "SPL_TUBES_1" (vedi 3.2.10) per "DEST_MACT", e h) elenco ben informazioni sulla posizione per "WELL_MACT" come mostrato in figura 8.
Nota: Le seguenti operazioni 3.2.8-3.2.15 potranno programmare il metodo per fare "Master Antibody Cocktail" - Aprire un nuovo metodo (Figura 7).
- Trascinare il "Instricona docu- Setup "per il nuovo metodo (Figura 7).
- Nel campo specificazione di "Strumento Configurazione", icone di trascinamento per le punte P1000, due "SmallTuberack_microfugetubes", e "BiocisionCoolRack_XT" sul diagramma di ponte. Aprire la finestra di dialogo per i due "SmallTuberack_microfugetubes" e nome come "BASE_CT" e "ACT_CT", rispettivamente, come specificato in 3.1.17. Aprire la finestra di dialogo per "BiocisionCoolRack_XT" e il nome di "SPL_TUBES_1" come specificato in 3.2.7 (figura 9).
- Aggiungere un nuovo "gruppo" trascinando un'icona "gruppo" per il metodo (Figura 7).
- Trascinare l'icona "Transfer Da file" direttamente sotto l'icona "gruppo" per trasferire "Cocktail di base" per fare "Master Antibody Cocktail" (Figura 7).
- Nel campo specifica per "Transfer da file", selezionare le punte P1000 in uso, seletti "scaricarli" quando il trasferimento è fatto, e controllare "Modifica punte tra i trasferimenti".
- Nel campo specifica per "Transfer da file", selezionare il file "AB_MACT" (Tabella 7) per la navigazione, selezionare "File ha una riga di intestazione". Selezionare "SRC_BASE" per la posizione fonte da laboratorio e "WELL_BASE" per informazioni bene nel labware origine, selezionare "DEST_MACT" per la labware destinazione e "WELL_MACT" per informazioni bene nel labware di destinazione, e selezionare "VOL_BASE" per informazioni sul volume (Figura 10). Ha scelto tecnica di trasferimento appropriata per le punte P1000.
Nota: LLS può non essere necessario per questo processo. - Aggiungere un altro "Trasferimento da file" trascinandolo direttamente sotto "Gruppo" per trasferire il "Attivazione Cocktail" che deve essere miscelato con il "Cocktail di base" per fare "Master Antibody Cocktail" (Figura 7 </ Strong>). Allo stesso modo impostare la fase di trasferimento come in 3.2.13 e 3.2.14. Le eccezioni sono le seguenti: a) Selezionare "SRC_ACT" per la posizione fonte da laboratorio, b) "WELL_ACT" per informazioni bene nel labware fonte, e c) "VOL_ACT" per informazioni sul volume.
4. Procedura operativa
- In primo luogo, fare doppio clic sull'icona del software per avviare il lettore di codice a barre 2D sul computer.
- Quindi, fare doppio clic sull'icona del software per lanciare il gestore liquido automatizzato sul computer.
- In "strumento", selezionare "Casa tutti gli assi" per siringhe principali del gestore liquido automatizzato. Assicurarsi che tutte le siringhe contengono bolle d'aria visibili.
Nota: "Home Tutti gli assi" darà anche lo strumento un punto di riferimento da cui partire per fare mosse successive. - Aprire il metodo per fare il "cocktail Base" e "attivazione cocktail" (Figura 2) nel software per unutomated gestore liquido.
- Porre i tubi microcentrifuga in "SmallTuberack_microfugetubes" per "BASE_CT" e "ACT_CT" in base al numero di "cocktail Base" e "attivazione Cocktail" da effettuare (Figura 3). Poi metterli sul ponte secondo il "Strumento Configurazione" (Figura 5).
- Posizionare il serbatoio con il tampone sul ponte secondo il "Strumento Configurazione".
- De-cap tubi di codici a barre 2D che contengono gli anticorpi con un tappo a vite decapper a 8 canali. Tenere i tappi in modo esatto su un vassoio berretto in possesso, al fine di evitare la contaminazione incrociata. Posizionare il "Matrix_OneML_TubeRack" sul ponte secondo il "Strumento Configurazione" (Figura 5).
- Luogo P50 LLS punte filtrati, P200 LLS suggerimenti filtrati, e suggerimenti P1000 sul ponte secondo il "Strumento Configurazione" (Figura 5).
- Avviare il metodo cliccando il tri verdeangolo a forma di icona di avvio. Come richiesto dalla finestra pop-up, fare in modo che tutti gli elementi sul ponte corrispondono al "Strumento Configurazione", come definito nel metodo. Non posizionare oggetti che non sono elencati nella sezione "Strumento Configurazione" sul ponte, in quanto ciò potrebbe schiacciare il pod e / o la pinza. Premere il tasto "OK" per procedere.
- Dopo il "Matrix_OneML_TubeRack" viene spostato sul lettore di codici a barre 2D e codici a barre vengono letti, un'altra finestra di popup vi chiederà se tutti i codici a barre vengono letti. Procedere premendo il tasto "OK" una volta confermata.
- Al termine del trasferimento da parte del gestore di liquido automatizzato, ricapitolare i tubi di codice a barre 2D utilizzando un tappo a vite decapper 8 canali, e rimetterli a 4 ° C.
- Vortex tutti i tubi microcentrifuga energicamente per 20 secondi, e restituirli in rack tubo.
Nota: Agitazione insufficiente può causare colorazione ottimale delle cellule. - Chiudere il metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail". Quindi aprire il metodo per fare "Master Antibody Cocktail".
- Impostare 5 ml provette di polistirene a fondo rotondo pre-etichettati sul "BiocisionCoolRack_XT" (Figura 8) e posizionarlo sul ponte. Le etichette devono indicare cosa "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail" si mescolano, così come l'ID del paziente appropriata.
- Posizionare rastrelliere tubo per "Cocktail Base", "Attivazione Cocktail", e suggerimenti P1000 sul ponte (figura 9). Avviare il metodo (Figura 7). Come richiesto dalla finestra pop-up, fare in modo che i prodotti sulla partita ponte di configurazione strumentale nel metodo (Figura 9). Premere il tasto "OK" per procedere.
- Quando il processo di cui sopra è fatto, aggiungere manualmente 50 ml di campioni di sangue in ogni 5 ml di tubo in polistirene a fondo rotondo che contiene il cocktail di anticorpi.
- tubi campione Vortex all'interno di una cappa di sicurezza biologica di Classe II e incubare 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Take cura di evitare striature sangue sui lati dei tubi, come questo si tradurrà in colorazione incoerente. Rimuovere con cautela eventuali striature di sangue da tamponi di cotone inumiditi con tampone di lavaggio del flusso.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lisi RBC manualmente e incubare 15 min a RT al buio.
- Aggiungere 2 ml di tampone di lavaggio flusso (0,1% di sodio azide, 1% BSA, 10 U / ml di eparina in 1x HBSS) e centrifugare per 5 min a 400 x g. Gettare il surnatante all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Ripetere questo processo di lavaggio. Risospendere cellule colorate in 0,5 ml di tampone di lavaggio flusso.
- Impostare un citofluorimetro che è equipaggiato con i laser di farina e filtri appropriati, nonché i modelli eseguiti con 5 ml tubi in polistirolo a fondo rotondo. Utilizzare metodi di calibrazione e compensazione della fluorescenza citometro standard per la raccolta dei dati 12,15. Raccogliere tutti i parametri elencati in "fluoroforo" nella tabella 1.
Nota: i materiali di controllo adeguate dovrebbero essere utilizzati in ogni seduta per assicurare il corretto assprestazioni ay. - Dopo i campioni in esecuzione, l'esportazione ha acquisito i dati come file FC.
- Analizzare i dati utilizzando il software appropriato. Identificare sottogruppi di cellule T utilizzando una strategia di gating delineata dal progetto di Immunologia Umana 1.
Representative Results
L'obiettivo di tutto immunofenotipizzazione di sangue è quello di ottenere quantitativa (la delineazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie) e informazioni qualitative (rilevazione dello stato di attivazione) sulle cellule immunitarie. Abbiamo leggermente modificato pannello immunofenotipizzazione cellule T della Progetto Immunologia Umana 1 per migliorare le prestazioni complessive del nostro metodo (Tabella 1). Il nostro pannello delle cellule T si propone di individuare ingenuo, memoria centrale (CM), memoria effettrici (EM), e le cellule T effettrici. Brevemente, si distinguono i doppietti basato su FCS-A e FCS-H. Poi ci porta sui linfociti basati su dispersione lato e livelli di CD45. cellule T vengono quindi identificati mediante espressione di CD3. Cellule T CD3 + sono differenziate in cellule T γδ e cellule T αβ. le cellule T αβ sono ulteriormente suddivise in cellule CD4 + e CD8 +. Cellule CD4 + e CD8 + sono poi analizzati per i loro sottoinsiemi basato su expression di CD45RA e CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + Naïve, CD45RA + CCR7 - effettrici e CD45RA - CCR7 - cellule T EM 1. Inoltre, abbiamo anche controllare la loro espressione di marcatori di attivazione quali CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D, e OX40 per ottenere informazioni qualitative.
Per dimostrare la precisione di questo metodo, abbiamo macchiato periferico campioni di sangue intero da 4 donatori sani 5 volte in un giorno. La figura 11 mostra il rapporto tra percentuale sottopopolazione di cellule T sui linfociti gated e il coefficiente per cento della varianza (% CV). Una ripartizione dettagliata delle sottopopolazioni di cellule T per cento sui linfociti gated e% CV per ogni sottogruppo è mostrato nella Tabella 8. I dati di test 2 e 3 non sono inclusi nella figura 11 e tabella 8 per semplicità. Meno del 25% CVtra RUN (precisione inter-saggio) è stato suggerito per i criteri di accettazione per saggi biomarker fenotipiche per l'uso della ricerca 10. Tutte le misurazioni sono incontrati questo criterio tranne cellule ICOS + γδ T (26,64-46,39%. Tabella 8) e le cellule ICOS + T CD8 (14,64-58,39%. Tabella 8). Questi valori sono mostrati a scopo dimostrativo. Non utilizziamo queste misurazioni perché ICOS svolge principalmente un ruolo importante nella attivazione delle cellule T CD4 16. La tendenza di una maggiore% CV nelle popolazioni che compongono una percentuale bassa per la popolazione totale è stato osservato da altri 7. Nel caso in cui gli investigatori sono interessati a monitorare rari-eventi, il numero di cellule esaminato deve essere aumentata al fine di superare una maggiore imprecisione 17. Insieme, i nostri dati mostrano la corretta distribuzione di automazione nella preparazione dei campioni di tutto immunofenotipizzazione sangue.
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Figura 1. Flusso di lavoro per immunofenotipizzazione con sangue intero periferico. Passo dopo passo il flusso di lavoro di analisi immunofenotipica è mostrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Panoramica del metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail". Passi nel metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail" nel software per il gestore di liquido automatizzato sono mostrati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Layout per il rack tubo con BACE_CT e ACT_CT. (A) mostra il layout per il rack tubo "BACE_CT". (B) mostra il layout per il rack tubo "ACT_CT". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Definizione mediche di laboratorio per la cremagliera del tubo con tubi di codici a barre 2D. Processo graduale di definizione della cremagliera del tubo con tubi di codici a barre 2D. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5. messa a punto dello strumento per il metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail". Essa mostra il layout di coperta per il metodo per fare "Cocktail Base" e "Attivazione Cocktail". Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Configurazione per "Crea set di dati". Essa mostra impostazioni dettagliate per "Crea set di dati". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figu re 7. Panoramica del metodo di fare "Master Antibody Cocktail". Passi nel metodo per fare "Master Antibody Cocktail" nel software per il gestore di liquido automatizzato viene mostrato. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Layout per il rack tubo con 5 ml provette di polistirene a fondo rotondo. Essa mostra il layout per il rack tubo "SPL_TUBES_1". FM3 significa fluorescenza meno 3 (brillante viola 421, ficoeritrina e allophycocyanin). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 9. messa a punto dello strumento per il metodo per fare "Master Antibody Cocktail". Essa mostra il layout di coperta per il metodo per fare "Master Antibody Cocktail". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10. Installazione di "Trasferimento da file". Essa mostra impostazioni dettagliate per "Transfer da file". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 11. Basso Vari capacità in semi-automatico intero immunofenotipizzazione sangue. Valori singoli CV di tutte le popolazioni di cellule analizzate da quattro donatori sani sono mostrati come blu cerchio aperto. curva di regressione è mostrata in linea blu. Red linee tratteggiate indicano il 95% bande fiducioso e linee punteggiate mostrano avidità 95% bande di previsione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 12. Un esempio di colorazione non ottimale. La colorazione è stata condotta con vortex adeguata o inadeguata di tubi microcentrifuga da "BACE_CT" e "ACT_CT". Ci sono due popolazioni gated B. La popolazione minore con debole colorazione CD45 rappresenta le cellule che non si ottiene colorazione ottimale.g12large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| GRUPPO | MARCATORE | fluoroforo | Clone | Titolo (ml / colorazione) | |
| BASE COCKTAIL | TCell | CD45 | FITC | 2D1 | 0.4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0.4 | ||
| CD4 | PerCP-Cy5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ Td> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| ATTIVAZIONE COCKTAIL-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ICOS) | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| ATTIVAZIONE COCKTAIL-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357 (GITR) | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| ATTIVAZIONE COCKTAIL-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ Td> |
| CD314 (NKG2D) | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabella 1. Un elenco di anticorpi per il pannello a celle T modificata.
| AB | AVANTI CRISTO |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278 (ICOS) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Tabella 2. I nomi di anticorpi con numeri di codici a barre 2D.
| GRUPPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCell | 1 | 7.2 | |
| TCell | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCell | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCell | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCell | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCell | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabella 3. Un file "BASE_CT_P50": i nomi di anticorpi e informazioni sul volume.
| GRUPPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCell 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCell | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabella 4. Un file "BASE_CT_P200": i nomi di anticorpi e informazioni sul volume.
| GRUPPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278 (ICOS) _PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Tabella 5. Un file "ACT_ CT_P50": i nomi di anticorpi e informazioni sul volume.
| GRUPPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Tabella 6. Un file "ACT_CT _P200": i nomi di anticorpi e informazioni sul volume.
| DONATORE# | SRC_ BASE | BASE COCKTAIL | BENE_ BASE | VOL_ BASE | SRC_ACT | Attivata ZIONE COCKTAIL | BENE_ ATTO | VOL_ACT | DEST_MACT | BENE_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 16 | ||
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Tabella 7. Un file "AB_MACT":. Fonte e informazioni di destinazione per "Master Antibody Cocktail"
| Popolazione # in Fig. 1 | io | ii | iii | iv | v | |
| nome popolazione | CD3 + | le cellule T ab | le cellule T gd | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % Dei linfociti </ Td> | Heathly donatore # 1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathly donatore # 2 | 69.40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathly donatore # 3 | 75.80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathly donatore # 4 | 77.20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| %CV | Heathly donatore # 1 | 1.42 | 1.58 | 3.70 | 2,50 | 1.56 |
| Heathly donatore # 2 | 2.48 | 2.39 | 5.74 | 2.82 | 2.41 | |
| Heathly donatore # 3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1.42 | 2.72 | |
| Heathly donatore # 4 | 0.81 | 0.94 | 5.45 | 1.20 | 1.44 | |
| Media | 1.47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| Deviazione standard | 0,72 | 0.61 | 1.13 | 0,79 | 0.63 |
Tabella 8. I dati grezzi per% dei linfociti e% CV per ogni sottogruppo tracciate nella Figura 4. Si noti che i dati relativi ai controlli di 2 e 3 non sono illustrati nella Figura 5 e Tabella 8 per semplificare la presentazione dei dati.
Discussion
Immunofenotipizzazione di sangue periferico è di fondamentale importanza per ottenere intuizioni risposte individuali a immunoterapia. La sfida consiste nel test di standardizzazione per controllare esperimento-to-esperimento variabilità 1,14. Una fonte di variabilità risiede nella manipolazione umana di campioni. Pertanto, è concepibile che l'automazione parziale o totale del campione di trasformazione faciliterà una drastica riduzione esperimento a esperimento variabilità 1,14. In questo protocollo, riportiamo il nostro sforzo di successo per ridurre al minimo la variabilità del test con l'introduzione di un gestore di liquido automatizzato dotato di lettore di codici a barre 2D per la colorazione del campione in tutto immunofenotipizzazione sangue.
Nel disegno, il nostro metodo è versatile e può monitorare altri sottoinsiemi immuni con l'aggiunta di ulteriori "Cocktails base" per definirli. Tali sottogruppi includono cellule T helper, le cellule T regolatorie, cellule B, le cellule NK, cellule dendritiche, monociti e (manoscritto inpreparazione) 18. Abbiamo adattato i pannelli di anticorpi raccomandati del consorzio con l'introduzione di ulteriori marcatori 1. popolazioni cellulari sono stati identificati utilizzando "Cocktail Base" coniugato con fluorocromi con emissione minimo nella brillante viola 421 (BV421), ficoeritrina (PE), e allophycocyanin (APC) rilevatori, come abbiamo voluto riservare questi canali per il rilevamento di antigeni inducibile. Questa funzione non solo garantisce la sensibilità più alta per monitorare lo stato di attivazione delle cellule del sistema immunitario, ma consente anche una sistemazione flessibile di nuovi marcatori di attivazione come questi tre fluorocromi sono più frequentemente coniugati con anticorpi contro marcatori inducibile. Pertanto, il nostro metodo non è adatto solo per la preparazione di cocktail per tutta la immunofenotipizzazione sangue, ma è utile anche per la colorazione altri campioni, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico e le cellule recuperate dai tessuti disaggregati (ad esempio, tumori).
intro di successoproduzione del nostro metodo richiede una particolare attenzione ai passi in preparazione labware e programmazione ed esecuzione del metodo. Preparazione dei tubi di codici a barre 2D comprende l'etichettatura con etichette leggibili e il trasferimento degli anticorpi ai tubi designati. Per evitare l'introduzione di errori, si consiglia di fare questo con due persone. Ogni volta che cambia i fogli di calcolo, gli investigatori dovrebbero verificare se il metodo funziona correttamente. La scelta di adeguati metodi di dispensazione durante la programmazione assicura il trasferimento del liquido di successo. LLS consente pipettaggio senza ottenere detriti precipitati dal fondo dei tubi di anticorpi, per il quale usiamo o P50 o suggerimenti conduttivi P200. LLS non può essere una buona opzione per le punte P1000 come LLS è più sensibile con punte P1000 e, a volte falsamente innescato da presenza di bolle. Heights di definizione da laboratorio devono essere regolati per ogni strumento potrebbe verificarsi come non ottimale trasferimento di liquidi, ad esempio, se non c'è abbastanza spazio tra il bordo di puntee il fondo dei tubi. Come mostrato in Figura 12, se il "cocktail Base" e / o "Attivazione cocktail" non sono in agitazione bene, può causare macchie subottimale.
Abbiamo pensato di usare i reagenti liofilizzati per la colorazione delle cellule come un approccio alternativo per ridurre la variabilità connessi con il reagente di erogazione 19. Tuttavia, coniugati polimerici di coloranti viola brillanti sono noti per interagire gli uni con gli altri segnali non specifici che causano. Come tale, l'aggiunta di più di due coniugati polimerici (ad esempio, BV421 e BV650 etc.) in reagenti liofilizzati possono provocare la segnalazione non specifico (ad esempio, l'aumento del segnale BV650 sfondo in BV421 + popolazione) 20. Inoltre, i reagenti liofilizzati mancano di flessibilità per l'inclusione nuova colorazione. Essi sono di solito più costosi e richiedono un ordine all'ingrosso. Per queste ragioni, abbiamo scelto di utilizzare il gestore liquido automatizzato dotato di tubi di codici a barre 2D. Anche se tfiocchi tempo per impostare e comporta un investimento iniziale per l'acquisto dello strumento, a lungo andare questi fattori saranno compensate da un aumento della produttività e la riproducibilità dei saggi. In effetti, alcuni gruppi precedentemente segnalato il successo dell'integrazione del gestore liquido automatizzato nel flusso di lavoro di immunofenotipizzazione o applicazioni simili 21,22. soluzioni automatizzate per l'analisi di citometria a flusso sono disponibili da fonti commerciali (FACS SPA III, Automated cocktail Preparazione Workstation, e FlowStainer) anche. Questo indica inoltre vi è un grande bisogno per la preparazione di cocktail automatizzata per immunofenotipizzazione.
Dopo aver imparato questa tecnica, prevediamo che lo sviluppo di completamente automatizzato immunofenotipizzazione sangue intero ridurrà ulteriormente la variabilità esperimento a esperimento e potrebbe fare tutta la immunofenotipizzazione sangue realizzabile anche in un ambiente 23 trial clinico multicentrico. Abbiamo già iniziato a utilizzare un lyse erah assistente per automatizzare le fasi di lisi e lavaggio. Prevediamo inoltre che la determinazione automatica del volume di anticorpo nei tubi di codici a barre 2D e l'inseguimento di erogazione del reagente migliorerà notevolmente l'inventario di anticorpi ed il controllo di qualità nostro metodo, rispettivamente.
Disclosures
YK, ILG, TLM, WLM, DPH, e KSB: Non sono in competizione interessi finanziari. ANT è un dipendente di Beckman Coulter, Inc. La pubblicazione di questo articolo il video è sponsorizzato da Beckman Coulter, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
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