Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Summary

Мы описываем два взаимодополняющих метода с использованием индикатора клеточного цикла флуоресценции убиквитинирования (FUCCI) и анализа изображений или проточной цитометрии для идентификации и изоляции клеток во внутренних остановленных G1 и внешних пролиферирующих областях 3D-сфероидов.

Abstract

Трехмерные (3D) сфероиды опухолей используются в исследованиях рака в качестве более точной модели микроокружения опухоли in vivo, по сравнению с традиционной двумерной (2D) культурой клеток. Сфероидальная модель способна имитировать эффекты межклеточного взаимодействия, гипоксии и недостатка питательных веществ, а также проникновения лекарств. Одной из характеристик этой модели является развитие некротического ядра, окруженного кольцом из G1-арестованных клеток, с пролиферирующими клетками на внешних слоях сфероида. Интерес в области рака представляет то, как различные области сфероида реагируют на медикаментозную терапию, а также на генетические манипуляции или манипуляции с окружающей средой. В данной работе мы описываем использование системы индикатора флуоресцентного убиквитинирования клеточного цикла (FUCCI) в сочетании с цитометрией и анализом изображений с использованием коммерческого программного обеспечения для характеристики статуса клеточного цикла клеток по отношению к их положению внутри сфероидов меланомы. Эти методы могут быть использованы для отслеживания изменений в состоянии клеточного цикла, экспрессии генов/белков или жизнеспособности клеток в различных субрегионах опухолевых сфероидов с течением времени и при различных условиях.

Introduction

Многоклеточные 3D сфероидов были известны как модели опухоли на протяжении десятилетий, однако это только недавно, что они пришли в более общем использовании в качестве модели в пробирке для многих солидных раков. Они все чаще используются в высокой пропускной экранов обнаружения наркотиков в качестве промежуточного между сложный, дорогостоящий и трудоемкий в моделях естественных условиях и простой, низкая стоимость 2D модели монослоя ^1-6. Исследования, проведенные в 2D культуре часто не в состоянии быть воспроизведены в естественных условиях. Сфероид модели многих видов рака способны имитировать характеристики роста, ле....

Protocol

1. Fucci Трансдукция и клеточной культуры

1. Fucci трансдукции
   1. Создать клеточные линии, стабильно экспрессирующие Fucci строит mKO2-hCdt1 (30-120) и MAG-hGem (1-100) ^15, используя лентивирус сотрудничество трансдукции, как описано ранее ^7.
      Примечание: Система Fucci теперь коммерчески доступны.
   2. Создание суб-клонов с яркой флуоресценции по одной сортировки клеток. Порядок отдельные клетки положительные как для AG и Ко (желтый) с помощью флуоресцентной сортировки клеток с возбуждением в 96-луночный планшет, как описано выше ^7,16.
2. Меланома культуры клеток
   1. Культура C8161 челове....

Results

Есть несколько способов получения сфероидов опухоли, этот протокол использует неадгезированных метод роста, когда клетки культивируют на агаре или агарозном ^3,7,9. На рисунке 1 показан пример C8161 меланомы сфероида после 3 дней на агар. C8161 сфероидов формировать регулярные размера сфероидов с диаметром 500 - 600 мкм (средний = 565, SD = 19, N = 3) через 3 дня. Другие клеточные линии меланомы, которые образуют сфероидов включают в себя: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (сферические, обр.......

Discussion

Полу-автоматизированный анализ изображений определили сфероида внутренний G1 арестован регион и пролиферирующих внешние слои. Этот метод может быть использован на живых сфероидов с помощью оптического сечение, или в фиксированных участках сфероида, чтобы определить изменения в не только клеточного цикла, но экспрессия маркеров (через иммунофлюоресценции), гибели клеток, или клеточной морфологии в этих различных регионах. Сотовый подвижность в различных регионах сфероидных также может быть количественно - если жить конфо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
агароза с низкой температурой плавления	Life Technologies	16520-050	Для секционирования
благородного агара	Sigma	A5431	Для изготовления сфероидов
агарозы для сфероидов	Fisher Scientific	BP1356-100	Для изготовления сфероидов
0,05% трипсина/ЭДТА	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% формалина	Sigma	HT5014-1CS	ВНИМАНИЕ: Вреден, коррозичен. Использовать средства индивидуальной защиты, делать   не выделять выхлопные газы (открыть в вытяжном шкафу).
живой/мертвый рядом с IR	Life Technologies	L10119
вибратом	Technical Products International, Inc
чашка для выращивания	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Форма для разрезания сфероидов
гемоцитометр	Sigma	Z359629
96-луночный планшет для культуры тканей	Invitro	FAL353072
коллагеназа	Sigma	C5138
конфокальный микроскоп	Leica	TCS SP5
Проточный цитометр-анализатор	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Вакуумная смазка	Sigma	Z273554
Монтажный носитель	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (коммерческие конструкции)	Life Technologies	P36238	Транзиентная трансфекция только
Клеточный фильтр 70 μ m	In Vitro	FAL352350
Тубы с круглым дном 5 мл (стерильные)	Пробирки In Vitro	FAL352003
с круглым дном 5 мл (нестерильные)Пробирки	In Vitro	FAL352008