Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं वर्जीनिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।
नोट: चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का एक योजनाबद्ध अवलोकन से पता चलता है।
Oocytes की 1. तैयारी
- पूर्व प्रधानमंत्री एक्स डिम्बाणुजनकोशिका अलगाव के अग्रिम में गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin के 150 यू (PMSG) लगभग एक सप्ताह के साथ महिलाओं laevis। 29 जी सुई के साथ 1 सीसी बाँझ सिरिंज के साथ पृष्ठीय लसीका थैली में 1 मिलीलीटर 150 यू / एमएल PMSG इंजेक्षन।
- डिम्बाणुजनकोशिका इंजेक्शन और डिम्बाणुजनकोशिका-पशु टोपी परख के लिए समाधान तैयार करें।
- सीए तैयार ++ / एमजी ++ मुक्त or2 (OR2-): 82 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1.5 मिमी ना 2 4 HPO, 50 मिमी HEPES पीएच 7.2।
- OR2- प्लस 1 मिमी CaCl 2 और 1 मिमी 2 MgCl: or2 तैयार करें।
- 60% लेबोविट्ज़ L15, 0.4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 100 माइक्रोग्राम / एमएल Gentamycin, पीएच 7.8: ओसीएम तैयार करें।
- पूर्व1x एमबीएस छाँटना: 88 मिमी NaCl, 1 मिमी KCl, 0.7 मिमी CaCl 2, 1 मिमी MgSO 4, 5 मिमी HEPES (पीएच 7.8), 2.5 मिमी 3 NaHCO।
- 1x एमबीएस में 3% Ficoll तैयार करें।
- 1x गुटनिरपेक्ष आंदोलन को तैयार: 110 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1 मिमी सीए (सं 3) 2, 1 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी EDTA, 1 मिमी NaHCO 3, 2 मिमी ना 3 4 पीओ, पीएच 7.4।
- 0.1x एमबीएस में इथाइल 3-aminobenzoate methanesulfonate नमक के एक 0.03% समाधान (MS222) में महिला anesthetize के लिए समाधान में मेंढक रखकर (पहले 10 मिलीलीटर 95% इथेनॉल में 0.3 ग्राम MS222 भंग, तो 1 एल 0.1x एमबीएस में पतला) 10 - 15 मिनट या अनुत्तरदायी जब तक।
- कि संज्ञाहरण यह जवाब नहीं है सुनिश्चित (अधूरे anesthetized मेंढ़कों अंगों को स्थानांतरित या शरीर पर बारी) को अपनी पीठ पर anesthetized मेंढक मोड़ से पूरा हो गया है की जाँच करें।
- शल्य चिकित्सा संदंश के साथ डिम्बग्रंथि ऊतक को अलग-थलग, स्केलपेल ब्लेड के साथ त्वचा और शरीर की दीवार के माध्यम से एक पेट चीरा बनाकर डिम्बग्रंथि टुकड़े को अलग-थलगऔर कैंची। OR2- में डिम्बग्रंथि टुकड़े रखें। एक 24 मिमी घुमावदार सुई पर 3-0 रेशम सीवन के साथ शरीर की दीवार को बंद करें और एक ही टांके के साथ अलग से त्वचा को बंद करें। पानी में 1 ग्राम / एल मछलीघर नमक में महिला की वसूली की अनुमति दें।
- (- 20 oocytes 10) टुकड़े और ताजा OR2- करने के लिए स्थानांतरण छोटे में ठीक संदंश, आंसू डिम्बग्रंथि ऊतक का उपयोग करना।
- , 1 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर धीरे आंदोलन ताजा कोलैजिनेज़ को स्थानांतरित करने और एक अतिरिक्त घंटे के लिए आंदोलन से OR2- में 2.0 मिलीग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ ए में Defolliculate डिम्बग्रंथि टुकड़े।
- धो छोटे oocytes discarding or2 में [सीए ++ / एमजी ++ युक्त] 10 गुना, oocytes।
- ओसीएम में दो बार oocytes धो और ताजा ओसीएम को हस्तांतरण। दृश्य निरीक्षण पर आकार से स्टेज छठी oocytes अलग करने और अपरिपक्व (छोटे) oocytes त्यागने: स्टेज छठी oocytes पशु गोलार्द्ध में भी रंजकता के साथ अपरिपक्व oocytes से बड़े होते हैं और व्यास में लगभग 1.2-1.4 मिमी हैं।
- 20 डिग्री सेल्सियस मैं - 18 पर oocytes बनाए रखेंइंजेक्शन के लिए पहले एन ओसीएम। नोट: agarose लेपित पेट्री डिश पकवान oocytes की चिपके कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
लाइब्रेरी टेप के 2. इंजेक्शन
- विकास का एक उचित मंच (उदाहरण के लिए, तंत्रिका प्लेट 14 चरण 10) पर निकाले एक दिशात्मक सीडीएनए लाइब्रेरी 15 का उपयोग आरएनए तैयार करें। एक सीडीएनए पुस्तकालय खरीद या नीचे चार चरणों में सिंहावलोकन प्रति एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर एक का निर्माण।
- पाली (ए) + आरएनए (सामग्री की तालिका देखें) के लिए बेहतर बनाने के लिए एक उत्पाद का उपयोग और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए लगभग 5 ग्राम mRNA के अलग। नोट: टेप (वांछित ऊतक के microdissection के बाद, इस तरह के तंत्रिका प्लेट के रूप में) एक उत्प्रेरण ऊतक के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, या एक विशेष चरण में पूरे भ्रूण से हो सकता है।
- निर्माता के निर्देशों का अनुसरण करते हुए एक वाणिज्यिक किट के साथ सीडीएनए निर्माण।
- एक Vecto में सीडीएनए एनजी लगभग 20 ligateआर वाणिज्यिक किट या अन्य उपयुक्त वेक्टर के साथ शामिल थे। एक उपयुक्त प्लाज्मिड वेक्टर mRNA स्थिरता जैसे 5 'β ग्लोबिन और 3 पाली (ए) दृश्यों (pCS2 + pTnT, pCS105) के लिए दृश्यों में शामिल हैं।
- गर्मी झटका परिवर्तन के लिए आपूर्तिकर्ता की सिफारिश प्रोटोकॉल का उपयोग सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं में बंधाव रूपांतरण।
नोट: वैकल्पिक रूप से, खुला पढ़ने फ्रेम (ORFeome) क्लोन का एक संग्रह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और इंजेक्शन के लिए टेप उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 10 4 जटिलता (10 अप्रैल - 10 मई कुल जटिलता) के लिए 10 3 के plasmids के 10 पूल तैयार करें। 10,000 कालोनियों प्रत्येक - यह 1000 के साथ 10 प्लेटों का प्रतिनिधित्व करता है।
- 37 सी में 18 घंटा, और 7 मिलीलीटर लेग में एक गिलास स्प्रेडर के साथ कोमल दबाव से प्रत्येक से कालोनियों इकट्ठा - प्लेट पुस्तकालय संस्कृति 10 से 15 सेमी लेग एम्पीसिलीन प्लेटों पर, 12 से बढ़ने
- 0.5 मिलीग्राम से एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार (-20 और पर 0.2 मिलीग्राम बाँझ ग्लिसरॉल और स्टोर करने के लिए जोड़# 730; सी), और एक मानक के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए Miniprep किट डीएनए तैयार करने के लिए शेष 6.5 मिलीलीटर का उपयोग करें।
- 1.5 घंटे - एंजाइम 1 के लिए 37 सी पर 16 पचाने उचित प्रतिबंध के साथ - (2.0 माइक्रोग्राम 1.0) जमा प्लास्मिड डीएनए Linearize। इस्तेमाल किया आरएनए पोलीमर्स किट के विनिर्देशों के अनुसार पानी में इथेनॉल और मेजबान के द्वारा पीछा फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ linearized डीएनए अलग। निर्माता के निर्देशों के बाद एक वाणिज्यिक आरएनए पोलीमर्स किट के साथ भावना आरएनए synthesize।
- लगभग 20 मीटर व्यास की (कांच केशिका टयूबिंग के साथ एक सुई खींचने का उपयोग) microinjection के लिए सुइयों तैयार करें; एक calibrated नेत्र माइक्रोमीटर के साथ एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर सुई सुझावों को मापने। नोट: सुई खींचने सेटिंग ठीक संदंश के साथ टूट गया जब वांछित टिप आकार पैदावार ऐसी है कि ठीक एक टिप के साथ एक सुई का निर्माण करने के अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।
- (में मिट्टी धक्का तैयारडिश के नीचे) पर समान परत मिट्टी से अटे 35 x 10 मिमी microinjection के दौरान जगह में oocytes धारण करने के लिए समानांतर खांचे के साथ पेट्री डिश; लौ में नोक पर जुड़े हुए एक मॉल जांच या पाश्चर विंदुक के साथ खांचे का उत्पादन। मिट्टी के लिए एक विकल्प के रूप में, एक elastomer ढालना 17 के साथ indentations बनाने agarose व्यंजन तैयार करते हैं। मिट्टी से अटे बर्तन में पंक्तियों में 1X एमबीएस में 3% Ficoll (लगभग 2 एमएल) के लिए एक विस्तृत बोर विंदुक के साथ स्थानांतरण oocytes।
- Microinjector का उपयोग करना, 1 एनजी / nl शाही सेना के साथ सुई भरने और (डिम्बाणुजनकोशिका कोशिका द्रव्य के ऊपर ड्राइंग रोकने के लिए) मामूली सकारात्मक दबाव का उत्पादन करने के लिए शेष राशि को समायोजित।
- भूमध्य क्षेत्र में लगभग 20 nl शाही सेना के साथ oocytes इंजेक्षन। तो, Ficoll-एमबीएस में रहने 1x एमबीएस करने के लिए धीरे हस्तांतरण करने के लिए इंजेक्शन oocytes के लिए 1 घंटा की अनुमति दें। प्रायर पशु टोपी परख करने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा - 8 के लिए सेते हैं।
3. पशु कैप परख
- ठीक संदंश, बाल पाश, घुमावदार coverslip के टुकड़े, मिट्टी से अटे जिले 3 / 4x गुटनिरपेक्ष आंदोलन को तैयार है और प्राप्तकप के आकार indentations के साथ hes oocytes धारण करने के लिए। एक घुमावदार टुकड़ा उत्पादन, (4 मिमी - - 2 मिमी x 2 लगभग 1) और किनारों पॉलिश और सूखना जब तक लौ के माध्यम से गुजर छोटे टुकड़ों में कांच coverslips अलग तोड़ने से घुमावदार coverslip के टुकड़े करें।
- एक्स खाद laevis अंडे इन विट्रो या प्राकृतिक सहवास और चरणों गेसट्रुला संस्कृति के माध्यम से 18 - पहले चरण से छँटाई करने के लिए 0.1x एमबीएस में (10 आरटी पर 11 घंटे बाद निषेचन); 10 भ्रूण - मध्य गेसट्रुला (11.5 चरण 11) इकट्ठा।
- 3 / 4x गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ लगभग आधा भरा एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण भ्रूण। ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना, gastrulae से निषेचन (पीतक) झिल्ली को हटा दें।
- स्थानांतरण मिट्टी से अटे बर्तन में 3/4 X गुटनिरपेक्ष आंदोलन (लगभग 2 एमएल) के लिए oocytes और खांचे ऊपर वर्णित किया गया के रूप में व्यक्तिगत भ्रूण को समायोजित करने के छापों का निर्माण, मिट्टी में अलग-अलग छापों में स्थिर करना।
- मिट्टी से अटे बर्तन करने के लिए स्थानांतरण भ्रूण और छ बंद जानवर टोपियां कटौतीastrulae ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर। ही नहीं है और इक्वेटोरियल ऊतक 18 पशु टोपी बाहरी झिल्ली को अलग करने के लिए ध्यान रखना।
- डिम्बाणुजनकोशिका से संपर्क पशु टोपी की अंदरूनी सतह के साथ प्रत्येक डिम्बाणुजनकोशिका के पशु गोलार्द्ध पर एक जानवर टोपी रखें। 8 घंटे या उससे अधिक समय - 6 के लिए डिम्बाणुजनकोशिका की सतह के संपर्क में भीतरी परत के साथ खुला रह सकता है (coverslip के संपर्क के रूप में पशु टोपियां मिट्टी बाहरी झिल्ली सपाट, घुमावदार गिलास coverslip टुकड़ा लागू करने और कांच के लिए नीचे की ओर दबाव लागू करने से रिकोम्बिनेंट्स एक साथ पकड़ )।
वैकल्पिक रूप से, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ इसकी भीतरी सतह के साथ एक मिट्टी खरोज में पशु टोपी जगह और टोपी पर एक डिम्बाणुजनकोशिका जगह;: नोट मिट्टी के छोटे एक्सटेंशन के साथ पुनः संयोजक सुरक्षित है। - 20 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति नियंत्रण भ्रूण परख के लिए मंच वांछित तक पहुंचने तक।
- Coverslip / मिट्टी हटाने और संदंश और एक बाल पाश के साथ बाहरी झिल्ली को अलग से अलग पुनः संयोजक।
- MEMFA में 1 घंटे (3.8% के लिए बहिर्जनस्तरीय टुकड़े को ठीक करेंसदस्य [0.1 एम MOPS 7.4 पीएच, 2 मिमी EGTA, और 1 मिमी MgSO 4] में formaldehyde)।
- सी -20 में इथेनॉल और दुकान में MEMFA से स्थानांतरण टुकड़े (और नियंत्रण भ्रूण)।
में बगल में संकरण द्वारा त्वक में प्रतिक्रिया के 4. विश्लेषण (ISH)
- ISH के समाधान के लिए तैयार करें।
- 1x पीबीएस तैयार: 0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा, सोडियम क्लोराइड 0.138 एम, पीएच 7.4
- तैयार पीबीएस बीच (PTW): 1x पीबीएस, 0.1% बीच 20
- 100x Denhart के समाधान तैयार: 2% बीएसए, 2% Polyvinylpyrrolidone, 2% Ficoll
- संकरण बफर तैयार: 50% Formamide, 5x एसएससी, 1 मिलीग्राम / एमएल torula खमीर शाही सेना, 1 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 1x Denhart के समाधान, 0.1% बीच 20, 0.1% CHAPS, 10 मिमी EDTA, DEPC-एच 2 ओ
- तैयार Maleic एसिड बफर (एमएबी): 100 मिमी maleic एसिड, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.5
- (भंग करने के लिए 60 सी के लिए गर्मी) एमएबी, 2% अभिकर्मक अवरुद्ध: एमएबी + ब्लॉक तैयार
- 100 मिमी Tris: alkaline फॉस्फेट (एपी) बफर तैयारपीएच 9.5, 50 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl, 0.1% बीच, DH 2 हे
- आरएनए जांच को तैयार है।
- एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (50 μl प्रतिक्रिया) को जोड़ने के लिए, एक वाणिज्यिक आरएनए पोलीमर्स किट का प्रयोग और मिश्रण एनटीपी खुदाई: 25.5 μl DEPC-एच 2 ओ, 10 μl 5X प्रतिलेखन बफर, 2.5 μl 10x डीआईजी एनटीपी मिश्रण, 5 μl 100 मिमी डीटीटी, 2 μl RNAsin, 2 μl linearized डीएनए टेम्पलेट (~ 1 माइक्रोग्राम / μl), 3 μl शाही सेना पोलीमरेज़ और 90 मिनट के लिए 37 सी सेते हैं।
- 2 μl शाही सेना पोलीमरेज़ जोड़ें और 60 मिनट के लिए 37 सी सेते हैं।
- 1% agarose जेल पर प्रतिक्रिया के 2 μl की जाँच करें।
- 1 μl RQ1 RNase मुक्त DNase जोड़ें और 20 मिनट के लिए 37 सी सेते हैं।
- 50 μl DEPC-एच 2 ओ, 25 μl 10 एम अमोनियम एसीटेट और 313 μl इथेनॉल जोड़कर जांच वेग। सी -20 पर स्टोर में रात भर (ओ / एन) फिर 20 मिनट के लिए 13,800 XG पर centrifugation द्वारा शाही सेना की वसूली। संक्षेप में स्पिन, 500 μl 75% इथेनॉल के साथ धोएं, हटानेइथेनॉल और शुष्क हवा की गोली अनुमति देते हैं। जोड़ें 50 μl DEPC-एच 2 ओ
- 0.5 ग्राम / μl ~ के अंतिम एकाग्रता के संकरण बफर जोड़ें।
- संकरण के लिए ऊतक तैयार करें। जब तक अन्यथा नोट, प्रत्येक समाधान परिवर्तन वर्णित (लगभग 4 एमएल) के साथ शीर्ष पर शीशियों भरें।
- क्षैतिज घुमाव पर, 10 मिनट प्रत्येक के लिए 75% इथेनॉल / PTW, तो 50% इथेनॉल / PTW में शीशियों और हस्तांतरण भ्रूण से इथेनॉल निकालें।
- 5 मिनट के घुमाव पर प्रत्येक के लिए PTW में तीन बार धोएं।
- 10 माइक्रोग्राम PTW में / μl Proteinase कश्मीर उपचार के लिए स्थानांतरण; रॉक नलियों खड़ी 15 मिनट।
- खड़ी चट्टान ट्यूबों - 0.1 एम triethanolamine 7.8 पीएच में दो बार 10 मिनट के प्रत्येक कुल्ला।
- ट्यूबों के लिए 12.5 μl एसिटिक एनहाइड्राइड जोड़ें और खड़ी 5 मिनट रॉक। 5 मिनट के लिए अतिरिक्त 12.5 μl एसिटिक एनहाइड्राइड साथ दोहराएँ।
- घुमाव पर मिनट खड़ी PTW 5 में धो लें।
- घुमाव पर 4% paraformaldehyde 20 मिनट में Refix। हीट संकरण बफर60 सी के लिए।
- 5 मिनट के घुमाव पर प्रत्येक के लिए PTW में तीन बार धोएं।
- 250 μl Hyb बफर प्रत्येक ट्यूब से PTW के सभी लेकिन ~ 1 मिलीलीटर निकालें और जोड़ने; धीरे मिश्रण ट्यूब ज़ुल्फ़। रॉक नलियों खड़ी 5 मिनट।
- 60 सी Hyb बफर (0.5 एमएल) के साथ बदलें और 60 सी 10 मिनट पर धीरे आंदोलन। ताजा Hyb बफर के साथ बदलें और 60 सी से दो चार घंटा पर आंदोलन।
- हीट जांच 60 सी (3 मिनट) से (0.5 माइक्रोग्राम Hyb बफर में / μl में 1 मिलीलीटर)। Hyb बफर निकालें और ट्यूबों के लिए जांच जोड़ने। हे / एन 60 सी पर धीरे आंदोलन।
- एंटीबॉडी के लिए ऊतक तैयार करें।
- 60 सेल्सियस तक गर्म Hyb बफर और 2x एसएससी + 0.1% बीच 20 समाधान।
- (- 3x पुन: उपयोग के लिए 2 सी -20 पर जांच बचाने के लिए) Hyb बफर के साथ जांच के समाधान बदलें। 10 मिनट के लिए 60 सी पर धो लें।
- 2x एसएससी-बीच में 60 सी (20 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक) में तीन बार धोएं।
- 0.2X एसएससी-बीच में 60 सी (20 मिनट के आंदोलन के साथ प्रत्येक) में तीन बार धोएं।
- घुमाव पर 15 मिनट प्रत्येक क्षैतिज लिए एमएबी (आरटी) में दो बार धोएं।
- 1 मिलीलीटर एमएबी + ब्लॉक जोड़ें। घुमाव पर खड़ी 2 घंटा धो लें।
- एक 1 / 2,000 विरोधी digoxygenin-एपी युक्त 1 मिलीलीटर एमएबी + ब्लॉक करने के लिए स्थानांतरण। 4 co / एन पर खड़ी रॉक।
- रंग अभिकर्मक के लिए ऊतक तैयार करें।
- एमएबी साथ एंटीबॉडी समाधान की जगह; एमएबी में 5 मिनट प्रत्येक क्षैतिज घुमाव पर तीन बार धोएं।
- एमएबी 1 घंटे में प्रत्येक क्षैतिज घुमाव पर तीन बार धोएं।
- एपी बफर 10 मिनट में प्रत्येक क्षैतिज घुमाव पर दो बार धोएं।
- , कई अच्छी तरह से प्लास्टिक ट्रे के लिए ऊतक स्थानांतरण एपी बफर निकालें और बीएम बैंगनी अभिकर्मक जोड़ें (~ 1 एमएल)। प्रतिक्रिया हे / एन के लिए अंधेरे 5 मिनट में आगे बढ़ने की अनुमति दें।
- उचित धुंधला हासिल की है, PTW की शीशियों के लिए ऊतक हस्तांतरण। घुमाव पर PTW में दो बार 10 मिनट के प्रत्येक धो लें।
- घुमाव पर 4 co / एन पर Bouin के समाधान में ठीक करें।
- आरटी पर Bouin के तीन 70% इथेनॉल / 30% PTW washes के साथ बाहर धो लें। टी आगे बढ़ेंआवश्यक 18 यदि महामारी रोशनी और एक माइक्रोस्कोप घुड़सवार कैमरा, विरंजन का उपयोग कर ओ छवि पर कब्जा।
5. सिब चयन और क्लोनिंग
- उच्चतम गतिविधि के साथ चयन पूल (बहिर्जनस्तरीय ऊतक में सबसे बड़ी प्रतिक्रिया)।
- (ऊपर प्रोटोकॉल में धारा 2 का उपयोग) पिछले चरण से कालोनियों उच्चतम गतिविधि के साथ पूल के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक (उचित घनत्व के पौंड के साथ पतला) और लगभग एक दसवें के साथ दस नई प्लेटों बाहर थाली titrate।
- गतिविधि एकल कॉलोनी का पता लगाया जाता है जब तक पूल के आकार को कम करें।
- वेक्टर में मानक प्राइमरों का उपयोग डीएनए अनुक्रम प्राप्त करते हैं।
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Representative Results
पशु टोपी ऊतक जवाब, oocytes में इंजेक्शन mRNA की अभिव्यक्ति के जवाब में सीटू संकरण (चित्रा 2 और 1 टेबल) में से otx2 की अभिव्यक्ति के लिए यत्न किया गया था; otx2 लेंस placode के माध्यम से न्यूरल ट्यूब बंद होने से प्रकल्पित लेंस बाहरी झिल्ली (मिसाल) में व्यक्त किया जाता है उमड़ना 19। Otx2 भी मिसाल के बाहर पूर्वकाल तंत्रिका बाहरी झिल्ली के साथ ही गैर-तंत्रिका सिर बाहरी झिल्ली में व्यक्त किया जाता है लेकिन, जब से यह तंत्रिका और placodal प्रतिक्रियाओं दोनों के साथ जुड़ा हुआ है। foxe3 तंत्रिका प्लेट से मिसाल में व्यक्त किया जाता है के बाद से foxe3 का उपयोग करते हैं, अभिव्यक्ति क्लोनिंग के लक्ष्य के लिए एक अधिक विशिष्ट दृष्टिकोण की अनुमति दी लेंस-सक्षम पशु टोपी बाहरी झिल्ली में एक लेंस प्रेरक प्रतिक्रिया के उत्पादन में सक्षम एक जीन उत्पाद के लिए पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए आसन्न placodal क्षेत्रों में मौजूद है लेकिन neuroectoder से अनुपस्थित चरणों और लेंस पुटिका गठन 20 भर में, मी। ऊपर क्लोनिंग अभिव्यक्ति और एसआईबी चयन प्रोटोकॉल का प्रयोग और पुस्तकालय टेप के पूल इंजेक्शन लगाने, पशु टोपी में foxe3 अभिव्यक्ति के उत्पादन में सक्षम एक जीन (तालिका 2) पृथक किया गया। क्लोन के अलगाव के बाद, पुस्तकालय टेप के साथ इंजेक्शन oocytes का उपयोग कर 179 अतिरिक्त पशु टोपी assays के foxe3 की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई; 50 सकारात्मक थे (28%)। Uninjected oocytes पर रखा 140 पशु टोपी टुकड़े की, 0 (चित्रा 3) सकारात्मक थे।
चित्रा 1. Oocyte-पशु कैप परख और अभिव्यक्ति क्लोनिंग प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध अवलोकन:। टेप क्लोन पुस्तकालय से तैयार और oocytes में इंजेक्ट कर रहे हैं, पशु टोपी बाहरी झिल्ली oocytes साथ सुसंस्कृत और फिर स्वस्थानी संकरण में से प्रेरित जीन अभिव्यक्ति के लिए यत्न किया है। डी / 53,518 / 53518fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
MRNA के इंजेक्शन और Otx2 के लिए बगल में संकरण में निम्नलिखित पशु कैप परख के चित्रा 2. ठेठ परिणाम। (एबी) प्रेरक प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम बगल में पूरे माउंट द्वारा otx2 अभिव्यक्ति के लिए यत्न किया, पशु टोपी में 14 चरण पाली (ए) + आरएनए dorsalized को संकरण। Oocytes पर रखा गया (ए) पशु टोपियां चरण के लिए मंच 10.5 पर uninjected oocytes पर रखा गया है और सुसंस्कृत 25 (बी) के स्टेज 10.5 पशु टोपियां 10 एनजी शाही सेना के साथ इंजेक्शन और अभिव्यक्ति द्वारा 6/7 मामलों में मनाया जाता है और संकेत दिया otx2 चरण 25 से सुसंस्कृत तीर। बार = 500 माइक्रोन। "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
स्वस्थानी संकरण में से foxe3 की अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण किया डिम्बाणुजनकोशिका-पशु टोपी assays से पशु कैप परख Foxe3 के लिए बगल में संकरण में निम्न में से चित्रा 3. ठेठ परिणाम। (एसी) प्रतिनिधि पशु टोपियां। (ए) स्टेज 11-11.5 पशु टोपियां चरण 23. foxe3 अभिव्यक्ति के लिए ldb1 इंजेक्शन oocytes पर रखा गया है और सुसंस्कृत तीर द्वारा संकेत दिया है। (बी) के स्टेज uninjected oocytes और पर रखा 11-11.5 पशु टोपियां 23 चरण के लिए सुसंस्कृत; कोई foxe3 अभिव्यक्ति का पता चला। Foxe3 के माध्यम से (सी) धारा बाहरी झिल्ली की आंतरिक और बाहरी परत में एक दिखाने अभिव्यक्ति से पशु टोपी प्रेरित पॉजिटिव। सलाखों के 500 माइक्रोन =।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| इंजेक्शन के आरएनए | पॉजिटिव मामलों | जीन | % |
| स्टेज 14 dorsalized mRNA, 10 एनजी | 12/24 | otx2 | 50 |
| 10 5 क्लोन की लाइब्रेरी ताल, 20 एनजी | 3/9 | otx2 | 33 |
| 10 5 clon 0 से 10 के लाइब्रेरी पूल तों, 20 एनजी | 50/179 | foxe3 | 28 |
| कोई नहीं | 0/140 | foxe3 | 0 |
तालिका 1. Oocyte-पशु कैप परख परिणाम पशु टोपी परख के परिणाम mRNA के साथ या सीडीएनए लाइब्रेरी पूल से संश्लेषित टेप के साथ इंजेक्शन oocytes का उपयोग कर, otx2 और foxe3 के साथ बगल संकरण में से आकलन किया।; या uninjected oocytes।
| इंजेक्शन के आरएनए | पूल पदनाम / चयन | सकारात्मक foxe3 अभिव्यक्ति |
| ए | 2/4 | |
| बी * | 4/28 | |
| सी | 4/44 | |
| 10 4 क्लोन की लाइब्रेरी ताल, 20 एनजी | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| 5000 क्लोन की लाइब्रेरी ताल, 20 एनजी | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| 70-200 कालोनियों के पुस्तकालय ताल, 20 एनजी | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 20 कालोनियों के पुस्तकालय ताल, 20 एनजी | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, एल 1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| के 2, K5, एल 2, एल 5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, एल 1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| लाइब्रेरी आरएनए, 20 एनजी | K6 | 0/10 |
| एल 1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| लाइब्रेरी शाही सेना, 20 एनजी | एल 1 (ldb1) पुष्टि | 50/179 |
| * चयनित पूल इंगित करता है |
तालिका 2 सिब चयन और Expression क्लोनिंग (10% और foxe3 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक 36% के बीच) प्रत्येक जानवर टोपी परख में प्रतिक्रिया के उच्चतम स्तर के साथ पूल एक क्लोन करने के लिए गतिविधि नीचे संकीर्ण करने के लिए अगले प्रयोग में इस्तेमाल के लिए चुना गया था। परिणाम। तारांकन चयनित पूल इंगित करता है।
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Discussion
सक्षम बाहरी झिल्ली में एक प्रतिक्रिया उत्प्रेरण के लिए सक्षम जीन की कार्यात्मक क्लोनिंग के लिए यहाँ वर्णित विधि जीन उत्पादों की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि अभिव्यक्ति क्लोनिंग तकनीक के साथ ऊतक उत्प्रेरण assays के संयोजन से पिछले काम पर फैलता है। हम आरएनए इंजेक्शन के बाद, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से, कारकों उत्प्रेरण के उत्पादन का एक स्रोत के रूप में Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका की चयापचय मार्ग का उपयोग। यह, ब्याज एक सीडीएनए पुस्तकालय या क्लोन के अन्य संग्रह से उत्पन्न टेप की अभिव्यक्ति का उपयोग 6.7 की एक जीन क्लोनिंग के लिए स्थापित तरीकों के उपयोग के साथ संयोजन में भ्रूण में शामिल नई ब्याज की जीन की पहचान करने की मांग करने वालों के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है प्रेरण। नए जीन के कार्यात्मक पहचान करने के लिए इस विधि का व्यापक प्रयोज्यता रोमांचक नई रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए एक उपयोगी पूरक है, और यह भी उच्च thr का उपयोग पहचान परीक्षण टेप कार्यात्मक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैoughput (जैसे शाही सेना seq के रूप में) तरीकों 21।
नियंत्रण टोपी परख में इस्तेमाल oocytes की चयापचय समारोह की निगरानी में महत्वपूर्ण हैं। दोनों INHBB परीक्षण किया गया mesoderm inducer के mRNA की सांद्रता बदलती है, प्रत्येक बैच oocytes की और कम बहुतायत टेप का पता लगाने के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता स्थापित करने के लिए के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए; इस जीन लेंस प्रेरण मार्ग से संबंधित नहीं है और एक अच्छी तरह से प्रलेखित स्वतंत्र नियंत्रण 14 है। 2 के साथ मनाया गया, 12/101 एंटीबॉडी के साथ पशु टोपी बाहरी झिल्ली में पेशी-विशिष्ट एंटीजन की अभिव्यक्ति से यत्न किया, गतिविधि स्नायु उत्प्रेरण - यहां तक की उपस्थिति में, 200 पीजी INHBB mRNA के अतिरिक्त चरण 14 पाली (ए) 500 गुना + आरएनए। सिस्टम इंजेक्ट आरएनए मात्रा का एक बहुत व्यापक रेंज पर इस प्रकार से उपयोगी है, और oocytes स्थिरतापूर्वक प्रोटीन का उत्पादन और 50 nl और उच्च के संस्करणों के cytoplasmic इंजेक्शन के बाद व्यवहार्य रहने के लिए सक्षम हैं।
यू के लिए एक विचारइस प्रोटोकॉल में एक सीडीएनए लाइब्रेरी के एसई पूर्ण लंबाई या लगभग पूर्ण लंबाई क्लोन के लिए आवश्यकता है। प्रोटोकॉल में उपयोग करने से पहले, पुस्तकालय पुस्तकालय में जाना जाता टेप के आकार का निर्धारण और इसलिए प्रमुख नकारात्मक प्रभाव संभावित छोटा कर दिया इंजेक्शन के टेप से प्राप्त कर रहे हैं कि संभावना को कम करने के लिए उत्तरी विश्लेषण द्वारा जांच की जानी चाहिए। एक पूर्ण लंबाई सीडीएनए पूल महत्वपूर्ण है के बाद से, ईएसटी क्लोन के उपयोग के 22 या बेहतर, (मान्य पूर्ण लंबाई क्लोन का एक पूरा सेट प्रदान करता है) Xenopus ORFeome 23 एक पारंपरिक सीडीएनए पुस्तकालय के लिए पसंद कर रहे हैं एक stage- और ऊतक जब तक सीडीएनए के विशिष्ट स्रोत की मांग की और पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। दूसरा विचार यह β ग्लोबिन और पाली (ए) इंजेक्शन के टेप में mRNA स्थिरता में वृद्धि के उद्देश्य पुस्तकालय वेक्टर में दृश्यों की उपस्थिति है। इस इंजेक्शन के सिंथेटिक mRNA से उत्पादित प्रोटीन की मात्रा बढ़ाने के लिए वांछनीय है, यह भी possibil उठातीविवो में से स्थिरता और गतिविधि में अधिक है कि mRNA से एक प्रमुख नकारात्मक असर उत्पादन के अल्पसंख्यक। एक कम प्रतिलिपि संख्या mRNA टेप का एक बड़ा पूल की पृष्ठभूमि में अपनी अंतर्जात समकक्ष के रूप में एक ही प्रभाव डालती नहीं हो सकता है; क्लोनिंग और प्रतिलेखन प्रक्रिया में स्थिर हो जाता है कि एक टोपी परख में पता लगाने की अनुमति बना रह सकता है। एक तीसरा मुद्दा पूल आकार है; पूल आकार की काफी कमी (10 क्लोन या इससे कम) भ्रूण 24 में हाल ही में लाभ के समारोह स्क्रीनिंग परियोजनाओं में फायदेमंद होने के लिए प्रदर्शन और स्पष्ट परिणाम और उम्मीदवार जीन की आसान पहचान प्रदान करने के लिए की संभावना है किया गया है। 10 3 तुलना में एक छोटे पूल आकार - क्लोन के संग्रह की कुल जटिलता कम से कम 10 4 है, तो ORFeome 23 के साथ मामला है इस प्रोटोकॉल में सिफारिश की 10 4, प्राप्त है; यह बेहद श्रम प्रधान के लिए किया जा सकता है, हालांकि एक, 900 के 10 पूल के साथ शुरुआत ~ 9,000 क्लोन स्क्रीन सकताएक प्रयोग में 10 से अधिक ताल की प्रक्रिया।
स्क्रीन में पहचान जीन द्वारा किए गए (अनुक्रम विश्लेषण द्वारा) जीन उत्पाद के प्रकार का निर्धारण अपने कार्य के परीक्षण की प्रकृति को निर्धारित करता है। एक परमाणु ट्रांसक्रिप्शनल सहघटक हमारे स्क्रीन 8 में पहचान की थी, इसलिए यह ldb1 के लागू होने से चालू होने वाले प्रेरक प्रक्रिया में नाभिक की भूमिका की पुष्टि करने के लिए जरूरी हो गया था। Enucleated oocytes पूरी तरह से कार्य प्रोटीन सिंथेटिक मशीनरी है और व्यवहार्य और इंजेक्शन टेप से स्रावित कारकों का उत्पादन करने में सक्षम हैं। हालांकि, नाभिक के अभाव प्रतिलेखन कारक है, सहकारकों, या अन्य अप्रत्यक्ष रूप से अभिनय जीन उत्पादों के कामकाज को समाप्त होगा। स्क्रीन में पहचान जीनों के बाद के विश्लेषण स्वस्थानी संकरण में से विकासात्मक अभिव्यक्ति पैटर्न के निर्धारण में शामिल हैं और लाभ के समारोह और नुकसान के समारोह परीक्षण। युग्मनजों में शाही सेना के इंजेक्शन द्वारा या सपा को इंजेक्शन सीमित करके overexpressionecific ब्लास्टोमेरेस इन विवो प्रतिलेख के खिलाफ निर्देशित morpholino oligonucleotides के इंजेक्शन के माध्यम से अंतर्दृष्टि, साथ ही जीन समारोह की पछाड़ना प्रदान कर सकते हैं भ्रूण के विशेष क्षेत्रों में इसके प्रभाव को सीमित करने के लिए।
बहुत स्क्रीनिंग प्रक्रिया में तेजी लाने और स्वस्थानी संकरण में से शाही सेना अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए समाप्त करने की जरूरत हो सकती है (जैसे GFP) के रूप में एक पत्रकार जीन के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग कर जवाब पशु टोपी बाहरी झिल्ली में एक प्रेरक प्रभाव के प्रत्यक्ष दृश्य। इसी तरह, स्क्रीनिंग की तेज साधन के रूप में एंटीबॉडी के उपयोग के लिए वांछनीय है, तो इसके लिए उचित एंटीबॉडी उपलब्ध है (ऊपर चर्चा की मांसपेशी प्रतिक्रिया के लिए 12/101 के रूप में इस तरह के)। सूरजमुखी मनुष्य भ्रूण बेहतर रंग प्रतिक्रिया ठेस कल्पना करने के लिए जंगली प्रकार रंजकता के किसी भी विरंजन की आवश्यकता को समाप्त करके बगल में संकरण प्रक्रिया को कारगर बनाने, और अधिक कठिन है, हालांकि गेसट्रुला चरणों में सही ढंग से करने के लिए मंच जो पशु टोपियां, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैUCT।
अंत में, यह कई कारणों के लिए, परीक्षणों की एक बड़ी संख्या किसी जीन की पहचान करने के लिए आयोजित किए जाने की जरूरत हो सकती है उस पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक के लिए, एक मामलों की संख्या एक दिया परीक्षण में यथोचित प्रक्रिया के रूप में, यहां तक कि भ्रूण की एक बड़ी खेप और जिस पर संस्कृति उन्हें तापमान की एक श्रृंखला भी समय पर होता है कि विकास (और क्षमता के संभावित नुकसान) द्वारा सीमित है हो सकता है अच्छी तरह से प्रसंस्करण में बाहरी झिल्ली के छोटे टुकड़े से हो सकती है कि नुकसान के रूप में। दूसरे के लिए, बाहरी झिल्ली में एक चुना मार्कर की अभिव्यक्ति की सफलता की दर बहुत कम हो सकता है और एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए कई मामलों आवश्यकता हो सकती है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
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